【毕业学位论文】（Word原稿）酵母细胞壁中葡甘露聚糖的提取及其霉菌毒素吸附效果动物营养与饲料科学硕士论文

I 密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 酵母细胞壁中葡甘露聚糖的提取 及其霉菌毒素吸附效果 I 要 为了 寻求一种 高效、低剂量、环保的霉菌毒素 有机 吸附剂 ，本试验以啤酒工业废弃酵母为材料，研究葡甘露聚糖的提取技术及其黄曲霉毒素的吸附效果， 共进行 2个试验。 试验一：研究了以啤酒工业的废酵 母泥为原料，用柠檬酸缓冲液抽提制得葡甘露聚糖，通过试验确定最佳提取条件为：柠檬酸缓冲液 提温度 120、抽提时间 90提 2次；确定脱蛋白方法为 。制备的酵母提取物为白色粉末，无味，易溶于水，不溶于有机溶剂，其总糖含量为 其中葡甘露聚糖含量为 蛋白质含量为 试验二：选取 180 羽 8 日龄的体重接近的健康 雏，随机分为 3 个处理组 ， 每组 6 个重复，每个重复 10 羽。分别饲喂如下试验日粮：基础日粮、基础日粮 础日粮 甘露聚糖。自由采食和饮水，试验期为 21 天。第 14、 21、 28日龄各重复称重，称料，屠宰。测定血清蛋白含量及转氨酶活性，计算肝脏、肾脏、胰腺、心脏、脾脏、胸腺、法氏囊的器官指数，测定肝脏酶活性及抗氧化指标。结果表明 :曲霉毒素 1， 严重影响了 鸡的生长性能，显著降低了肉鸡的体重、日增重、日采食量，提高了料肉比。血清中总蛋白、白蛋白含量显著下降，谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性显著升高。肝脏、肾脏、心脏 、脾脏器官肿胀，胸腺、法氏囊出现萎缩。肝脏酶活异常升高或降低，抗氧化酶活性降低，脂质过氧化产物丙二醛含量升高。肝脏组织切片可以看出胆管增生、肝细胞大量死亡。说明肝脏受到严重损伤，机体的抗氧化能力受到了抑制。 2. 葡甘露聚糖，可以明显改善 鸡的生长性能，以上相关指标的值基本恢复到正常水平，说明葡甘露聚糖减轻了黄曲霉毒素的毒性，基本消除了其对动物生长性能、免疫功能、肝肾功能、抗氧化能力等的不良影响。 关键词： 酵母葡甘露聚糖 提取 黄曲霉 毒素 吸附 肉鸡 to an of of by in In ， in at 120，90as of in in of of of In ， A of of 100100.1%to ， 14， 21， 28 of W) to ) of as of PA b u n d a n c C : B S B 1 2 0 0 6 1 0 1 4 0 2 . . 0 7图 2 4 标准甘露糖的气相色谱图 as of 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 01 e + 0 72 e + 0 73 e + 0 74 e + 0 75 e + 0 76 e + 0 77 e + 0 7T im e - - A b u n d a n c C : 2 0 0 6 1 0 1 4 0 4 . . 9 6图 2 5 标准葡萄糖的气相色谱图 as of 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 01 e + 0 72 e + 0 73 e + 0 74 e + 0 75 e + 0 76 e + 0 77 e + 0 7T im e - - A b u n d a n c C : 2 0 0 6 1 0 1 4 0 8 . . 1 41 9 . 1 3图 2 6 葡甘露聚糖水解产物的气相色谱图 as of 中国农业科学院硕士学位论文 第 二章 酵母细胞壁中葡甘露聚糖的提取纯化 18 表 2 4 提取物单糖组成成分的百分含量 he of % 名 称 含量（ %） 葡 萄 糖 露 糖 论 甘露聚糖的提取方法 多糖提取要结合饲料行业的特点，方法选取上既要考虑得率，也要考虑成本。酶解法主要是利用蛋白酶水解蛋白质，使得细胞壁结构破碎得到多糖（ 2003；李志江， 2005），但是酶成本较高。碱液浸提法提取甘露聚糖过程需要迅速升温、降温（周义发， 1991），所以生产中必将辅以特殊设备。葡聚糖 用酸碱法提取过程中用到浓度较高的强碱在较高温度下浸提（胡晓忠， 2000） ，而热碱会导致多糖之间聚合链的断裂（ 2003） 。所以本试验中采用中性缓冲液浸提。孙建义（ 2001）采用柠檬酸缓冲液抽提法制备甘露聚糖，除了用溴代十六烷基三甲铵除蛋白外，还要通过硼酸、氢氧化钠调节 偏碱性，硼酸钠洗涤，硼酸钠、醋酸钠和无水乙醇处理得沉淀，再加入含乙酸的乙醇溶液，离心，取沉淀物，最后加入无水乙醇离心才得到甘露聚糖。可见要制得甘露聚糖除了柠檬酸浸提外，还要经过多步的分离纯化。本试验用中性柠檬酸缓冲液浸提 最大程度的保证了酵母细胞壁中葡聚糖与甘露聚糖的链接。 酵母多糖脱蛋白过程中普遍采用的方法为费林试剂法（周义发， 1991；赵凤， 1993）、溴代十六烷基三甲铵法（张惟杰， 1999；孙建义， 2001）和 （王义华， 2003）。然而费林试剂法需要试剂品种多，配制繁琐，而且费林试剂为碱性试剂必将导致葡聚糖与甘露聚糖链接的断裂（ 2003） ；溴代十六烷基三甲铵价格偏高；而 且可重复利用。该工艺具有流程简单、工艺参数容易控制、耗时少和提取率高的特点。 糖提取物的定性和定量分析 在本试验中，提取物的苯酚硫酸反应呈阳性，表明提取物为多糖类碳水化合物，费林试剂颜色反应阴性，表明提取物中不含还原糖。刘烺新（ 1994）制得的酵母胞壁多糖为肉色粉末，加热至 70以上易褐变，易溶于热水，微溶于低浓度乙醇，不溶于高浓度乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶液中，暴露在空气中易吸潮，水溶液粘稠状， 军（ 2005）制得的葡聚糖为灰白色，不溶于水、无水乙醇、无水乙醚和丙酮。杜丹（ 2006） 、王义华（ 2003）制得的甘露聚糖为白色粉末，较易溶于水，溶液为无色透明， 为 溶于乙醇、乙醚、丙酮。本试验所得的提取物为白色粉末、无味、易溶于水、热水和热的浓硫酸中，微溶于低浓度的乙醇，不溶于高中国农业科学院硕士学位论文 第 二章 酵母细胞壁中葡甘露聚糖的提取纯化 19 浓度乙醇以及乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，水溶液为无色透明， 此可见，本试验得到的提取物与前人研究的胞壁聚糖、葡聚糖、甘露聚糖性质相似但不完全相同。 多糖根据是由一种还是多种单糖单位组成可分为同多糖和杂多糖。因多糖中单糖成分各异，所以至今还未见多糖标准品。目前多糖定性定量分析是将多糖水解成单糖或单糖衍生物，根据单糖标准品比对多糖中单糖组成，进而再确定单糖含量。 王义华（ 2003年）从啤酒酵母细胞壁提取的甘露聚糖，采用苯硫酸法测定多糖提取物的浓度为 ，薄层层析法鉴定发现含有甘露糖，薄层扫描仪检测甘露糖占多糖含量的 ，表明糖链主要由甘露糖组成。按本试验确定的提取纯化技术制备的提取物通过薄层层析、气相色谱试验得出提取物的单糖组成成分为甘露糖和葡萄糖，各占 说明提取物是由甘露糖和葡萄糖组成的多糖。 结 1 酵母葡甘露聚糖的最佳提取工艺是： 柠檬酸缓冲液在 120下抽提 90后再通过 脱蛋白制得葡甘露聚糖。该工艺具有流程简单、工艺参数容易控制、耗时少和提取率高的特点。 2 葡甘露聚糖为白色粉末，无味，易溶于水、热水和热的浓硫酸中，微溶于低浓度的乙醇，不溶于高浓度乙醇以及乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，得率为 总糖含量为 葡甘露聚糖含量 甘露糖 、葡萄糖 蛋白质含量为 水份含量为 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 20 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素日粮肉鸡的影响 989)报道，目前世界上至少有 25%的谷物被霉菌毒素污染，其 脱毒和解毒方法一直是人们研究的热点。黄曲霉毒素（ 剧毒物质，在我国饲料中黄曲霉毒素的污染状况普遍存在，气候温湿的南方地区尤为严重，给我国的畜牧业造成了巨大的经济损失。黄曲霉毒素不仅影响动物的生长、繁殖、降低饲料转化率，降低产仔数，造成动物肝坏死、胃肠道损伤、黄疸、贫血、免疫抑制等，给畜牧业带来严重的危害 (1999)。更为严重的是，残留在动物产品中的黄曲霉毒素可以通过食物链而危害人类的健康。 葡甘露聚糖是从废酵母中提取出来的具有孔状结构的功能性碳水化合物，研究证明其具 有吸附霉菌毒素的作用。葡甘露聚糖吸附 ， 2002）、蛋鸡（ 2004）、猪（ ， 2004）马 (， 2005) 进行了试验。此外葡甘露聚糖在肉鸡上还进行了黄曲霉毒素和 素的吸附试验（ 2000； 1998），证明葡甘露聚糖可以有效保护肉鸡不受毒素的影响。 本试验以提取试验中制得的葡甘露聚糖为吸附剂，以 仔鸡为试验动物，旨在研究葡 甘露聚糖是否对黄曲霉毒素具有吸附作用。 料与方法 验动物与试验设计 选取 240 羽 雏（ 0 日龄），不分组，饲喂基础日粮； 8 日龄时选取 180 羽体重接近健康 机分为 3个处理组，每个处理组 6个重复，每个重复 10羽，经检验处理间无显著差异（ P第 8日龄试验开始，按照表 3 1的试验处理饲喂，持续 3周。 表 3 1 试验处理 1 理 日 粮 组 成 一组 （ 基础日粮 二组（ 基础日粮 曲霉毒素 组（ 基础日粮 曲霉毒素 甘露聚糖 养管理 试验前对鸡舍进行严格消毒。试验鸡采用层叠式育雏笼饲养，自由采食和饮水， 24国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 21 常规免疫。按 验期间每日观察鸡体健康状态、行为并记录耗料量。 验基础日粮 试验日粮营养成分按 司推荐水平设计，配合后用粉料直接饲喂。基础日粮组成及营养成分见表 3 2。 表 3 2 试验基础日粮组成及营养水平 (%) 2 of (%) 成 分 0 3周 4周 玉米 (粕 (粉 (米蛋白粉 (物油 (酸氢钙 (粉 (盐 (合预混料 (养水平 ( 代谢能 (g) 蛋白 (效磷 (氨酸 (氨酸 (氨酸胱氨酸 (：每 粮添加 物素 酸40酸 40酸 120 100 120 80 样品采集及处理 试验第 7、 14、 21、 28天，每个重复随机选取一只鸡心脏采血， 30000， 20保存。待测血清中的总蛋白、白蛋白、球蛋白含量，及谷草转氨酶、谷丙转氨酶中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 22 的活性。 鸡颈静脉放血死亡，经正常屠宰，迅速打开腹腔，摘取心脏、肝脏、肾脏、胰腺、胸腺、脾脏、法氏囊、称重，测定器官的相对重量。 器官相对重量的计算：器官鲜重 /活体重 免疫器官指数的计算：免疫器官鲜重 /活体重 取肝左内叶相同部位约 1用生理盐水洗净后，再平铺于滤纸上将液体吸干，浸入 10%福尔马林固定液中固定，待作组织切片分析用。 取 5g 肝脏液氮冷冻保存，匀浆测肝脏组织中琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转移 酶、 测指标及方法 产性能 统计 8 14 日龄、 15 21 日龄、 22 28 日龄各组试验鸡增重及耗料情况，计算各时间段及全期（ 8 28 日龄）的平均日增重（ 平均日采食量（ 料肉比（ F/G）。 记录试验鸡淘汰和死亡情况，并统计各阶段的死淘率。 清生化指标 血清总蛋白（ 白蛋白（ 球蛋白（ 谷丙转氨酶（ 、谷草转氨酶（ 测定采用南京建成生物功能研究所提供的试剂盒，按照 说明书上的操作步骤进行测定。 测定血清生化指标所用仪器设备： 752 紫外光栅分光光度计， 电热恒温水浴锅， 脏生化指标 组织匀浆液的制备：称取 右的肝脏样品，加入 9 倍体积的预冷生理盐水，用组织匀浆机 10000浆时间 10 秒 /次，间隙 30 秒，连续 3 次，在冰水中进行）制成 10%的匀浆液。匀浆后于 4 3000心 10上清液待用。 组织蛋白质含量采用考马斯亮兰法测定。 谷胱甘肽过氧化物酶（ 性采用 ， 5， 比色法（夏奕明， 1987）， 二硫代二硝基苯甲酸作用生成 5在 412测其吸光度即可计算出 量 。 测定 消耗，则可求出 活力。 以在37条件下每毫克蛋白，每分钟扣除非酶反应，使谷胱甘肽（ 度降低 1 U/。 肝脏超氧化物歧化酶（ 性测定采用黄嘌呤氧化法（ 1984），测定原理： 黄 嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生 超氧阴离子自由基， 后者氧化羟胺形成亚硝酸盐 ， 在显色剂的作用下呈现紫红色 ， 在 550测其吸光度。 酶活性定义：每毫克组织蛋白在 1应液中 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 23 制率为 50%时所对应的 U/。 丙二醛（ 量测定采用硫代巴比妥酸（ 色法（ 1985）。测定原理：过氧化脂质降解产物中的 与硫代巴比妥酸（ 合，形成红色产物，在 532有最大吸收峰。因底物为 它酶活 指标 谷氨酰转移酶（ 测定原理谷氨酰萘胺在谷氨酰转移酶作用下，发生转肽作用释放出萘胺与重氮试剂作用，生成红色 色度深浅与酶活力成正比。 琥珀酸脱氢酶（ 测定原理：琥珀酸脱氢酶催化底物反应， 反应与 2， 6定 2， 6 胆碱酯酶（ 测定原理：血清及组织中 被分解的剩余乙酰胆碱与羟胺作用生成乙酰羟胺，再与铁 离子在酸性溶液中形成棕色复合物，根据颜色深浅推算出酶的活力。 碱性磷酸酶 （ 测定原理： 分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与 4氨基安替吡啉作用经铁青化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。 测定肝脏组织指标所用仪器设备： 752 紫外光栅分光光度计， 电热恒温水浴锅， 脏组织病理分析 将固定的肝脏标本经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋等处理后，制成 5 m 的切片，然后展片、烤片， 片后，镜检观察。 计分析 采用 )软件中的一般线性模式（ 数据进行方差分析，各处理间平均值采用 重比较 进行差异显著性检验 ， 试验数据采用平均数 标准 误（ X 表示。 验结果 甘露聚糖对肉鸡生产性能的影响 葡甘露聚糖对 鸡生产性能的影响结果列于表 3 3 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 24 表 3 3 葡甘露聚糖对肉鸡生产性能的影响 of on of 目 对照组 黄曲霉毒素组 黄曲霉毒素葡甘露聚糖组 体重 (g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 增重 (g) 741采食量 (g) 741肉比 741淘数 (只 ) 7 3 0 注：表内同一指标，同行右肩标有不同字母者差异显著 (；但是与 P。可见，与对照组相比，添加 曲霉毒素显著减少了肉仔鸡的体重，并且随着试验时间延长，对体重减少影响越显著。而在黄曲霉毒素日粮中加入 葡甘露聚糖显著增加了肉仔鸡的体中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 25 重，但是未达到对照组的水平。 由表 3 3可见，在试验第一周，与 ， 1 组相比提高了 P， P。可见，与对照组相比，添加 曲霉毒素显著降低了肉仔鸡的日增重，并且随着试验时间延长，对日增重降低影响越显著。而在黄曲霉毒素日粮中加入 葡甘露聚糖显著提高了肉仔鸡的日增重，但是未达到对照组的水平。 由表 3 3可见，在试验第一周，与 ，与 相比提高了 P， 与 相比降低了 P。可见，与对照组相比，添加 曲霉毒素显著降低了肉仔鸡的日采食量，并且随着试验时间延长，对日采食量降低的影响越显著。而在 黄曲霉毒素日粮中加入 葡甘露聚糖显著提高了肉仔鸡的日采食量，但是未达到对照组的水平。 由表 3 3可见，在试验第一周，与 相比， P；而与 相比， P；但是与 P。在试验第二周，与 2 组的料肉比无差异。在试验第三周，与 料肉比提高了 ， 1组相比降低了 P， P。可见，与对照组相比，添加 在黄曲霉毒素日粮中加入 葡甘露聚糖降低了肉仔鸡的料肉比。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 26 甘露聚糖对肉鸡血清 蛋白及酶活的影响 试验鸡血清总蛋白变化见表 3 4。由表可见，试验前（第 7 日龄）各组肉鸡血清总蛋白、白蛋白、球蛋白含量无显著差异。第 14 日龄时， 总蛋白含量显著低于 和 (第 28 日龄时， 总蛋白含量显著低于 ( 血清中白蛋白的变化，第 14、 21、 28 日龄， 2 组 (在 14、 21、 28 日龄时，血清中球蛋白的含量 P可见，添加 黄曲霉毒素显著降低了血清中总蛋白、白蛋白的含量，而在黄曲霉毒素日粮中加入 葡甘露聚糖显著提高了血清中总蛋白、白蛋白的含量，且基本恢复到对照组水平。 表 3 4 葡甘露聚糖对肉鸡血清蛋白影响 of on of 目 对照组 （ 黄曲霉毒素组 （ 黄曲霉毒素葡甘露聚糖 （ 总蛋白 (g/L) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 蛋白 (g/L) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 蛋白 (g/L) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 ：表内同一指标，同行右肩标有不同字母者差异显著 (第 21、 28 日龄时， 2 组 (第 28 日龄时，谷草转氨酶的活性， ， 与 之间 差异不显著 (P可见， 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 27 曲霉毒素显著提高了血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性，而在黄曲霉毒素日粮中加入 葡甘露聚糖显著的降低了谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性，基本恢复到对照组水平。 表 3 5 葡甘露聚糖对肉鸡血清酶活的影响 of on of 目 对照组 （ 黄曲霉毒素组 （ 黄曲霉毒素葡甘露聚糖 (谷丙转氨酶 (U/ 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 草转氨酶 (U/ 第 7 日 龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 ：表内同一指标，同行右肩标有不同字母者差异显著 (而肾脏、胰腺、心脏的相对重量三组间差异均不显著 (P第 21 日龄时， 肝脏、肾脏的相对重量与 相比差异显著(胰腺相对重量三组间差异均不显著(P心脏的相对重量 与 间差异均显著 (第 28日龄时，肝脏、心脏的相对重量 胰腺相对重量三组间均无显著差异(P肾脏相对重量 与 可见， 脏、心脏肿胀，而在黄曲霉毒素日粮中加入 葡 甘露聚糖使得肝脏、肾脏、心脏的肿胀程度得到缓解，基本上恢复到对照组水平。黄曲霉毒素中毒情况下，胰腺有肿胀趋势。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 28 表 3 6 葡甘露聚糖对肉鸡器官相对重量的影响 of on of 目 对照组 （ 黄曲霉毒素组 （ 黄曲霉毒素葡甘露聚糖 （ 肝脏 (g/100g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 脏 (g/100g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 腺 (g/100g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 脏 (g/100g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 ：表内同一指标，同行右肩标有不同字母者差异显著 (胸腺、法氏囊相对重量三组之间均无显著差异 (P第 28 日龄时，脾脏、胸腺、法氏囊相对重量 与 可见， 曲霉毒素引起了脾脏肿胀，而在黄曲霉毒素日粮中加入 葡甘露聚糖后肿胀现象得到了显著的改善，基本恢复到对照组水平。随着试验时间的延长，黄曲霉毒素引起了胸腺、法氏囊的萎缩， 28日龄时达显著差异， 葡甘露聚糖缓解的免疫器官萎缩的症状，达到对照组水平。 中国农业科学院硕士学位论文 第三章 葡甘露聚糖对饲喂黄曲霉毒素肉鸡的影响 29 表 3 7 葡甘露聚糖对肉鸡免疫器官相对重量的影响 of on of 目 对照组 （ 黄曲霉毒素组 （ 黄曲霉毒素葡甘露聚糖 （ 脾脏 (g/100g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 腺 (g/100g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 氏囊 (g/100g) 第 7 日龄 14 日龄 21 日龄 28 日龄 ：表内同一指标，同行右肩标有不同字母者差异显著 ( 碱性磷 酸的酶活性显著高于 的酶活性 (胆碱酯酶、 第 21 日龄时， 琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶的酶活性显著低于