【毕业学位论文】（Word原稿）O型口蹄疫病毒多基因DNA疫苗的研制预防兽医学论文

I 密级 : 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 O 型口蹄疫病毒多基因 苗的研制 NA NA 英文缩略词 缩略词 英文名称 中文名称 突状细胞 苄青霉素 鼠肾细胞系 细胞介素 瘤坏死因子 二烷基磺酸钠 -4,52,5甲基偶氮唑盐 二胺四乙 酸 s 限必需培养基 牛血清 . 油酰磷脂酰乙醇胺 物血凝素 刀豆蛋白 A 糖体进入位点 光霉素 B 培养基 N甲基氨基乙烯氨甲酰胆固醇 密度 单室脂质体 单室脂质体 室脂质体 酸缓冲盐水 合酶链式反应 0% 数组织培养感染量 分钟 转速 原递呈细胞 氨酸甘氨酸天门冬氨酸 扰素 联免疫吸附试验 转录 苯二胺 要组织相容性复合体 0% 数感染量 细胞病毒 胞毒性 T 细胞 使 克隆位点 瘤病毒 纯疱疹病毒 生长激素 数致死量 细胞受体 肝病毒表明抗原 类免疫缺陷病毒 根过氧化物 酶 免疫球蛋白 G 粒白细胞 原加工转运体 疫刺激复合物 病毒 0 猴空泡病毒 ot 休克蛋白 酸激酶 链延伸因子 乙烯亚胺 多糖 of 化群 助性 T 细胞 O 型口蹄疫病毒多基因 苗的研制 摘 要 研制带有 O 型口蹄疫病毒（ 结构蛋白基因及多个非结构蛋白基因的 苗，本研究通过定点突变方法和 增方法，获得包含有结构蛋白 结构蛋白 2A、 3C 以及部分 2B、 3B 编码基因的片段 包含有 结构蛋白 结构蛋白 2A、 3C、 3D 以及部分 2B、 3B 编码基因的片段获得的基因片段直接 /酶切后与同样处理的真核表达质粒连接 ,12 1212重组质粒进行序列测定、分析，并将重组质粒分别转染 胞，通过双抗体夹心 法和间接免疫荧光标记方法检测细胞中 原的表达，用电子显微镜观察病毒空衣壳的组装；为评价重组质粒作为 苗对实验动物及本动物的免疫效果，将重组质粒经肌肉注射方法接种豚鼠，并与酵母表达的纯化 3D 蛋白及带有牛干扰素（ 的真核表达质粒 别 /同时免疫，第二次免疫后第三周豚鼠攻以 100 1000 O 型 ；1212带有牛干扰素（ 的真核表达质粒 周后经牛舌皮攻以 104 型 。结果表明： 1) 因片段正确克隆到真核表达质粒载体上， 因和 042 4452别编码 1 014 和 1 484 个氨基酸。与亲本毒株 相应编码序列比较，同源性分别为 2）重组质粒均可在 胞中表达 的蛋白；带有内含子的质粒 1212 12 1，且其表达的蛋白能正确组装成病毒空衣壳。 3）质粒 12独免疫豚鼠后第 2 周诱导机体产生了特异抗体和中和抗体以及较强的 T 淋巴细胞增殖反应，攻毒后豚鼠获得完全保护。但与 3D 蛋白共同免疫后，抗体水平没有明显提高，攻毒后的保 护率也明显低于质粒 12独免疫组。 4）质粒 组质粒共免疫的豚鼠特异性抗体水平在第一次免疫后出现，并在第二次免疫后的第一周进一步提高；各免疫组的脾脏 T 淋巴细胞均在第一次免疫后出现增殖反应 ,并在第二次免疫后进一步增强；质粒 12 免组的保护率为 25。 5）所有牛在免疫后均出现特异抗体； T 淋巴细胞在免疫后明显增殖；攻毒后免疫牛发病迟缓、病变程度较轻。 这些真核表达质粒的成功构建为口蹄疫基因免疫的研 究提供了基础，并为从分子水平上防制辟了新的途径。 关键词 ： 苗 , 基因免疫，豚鼠，牛 y of CR we 121, 2A, 3C a B B 121, 2A, 3C， 3D a B B. by V 12+) by by by of by by In to of to 1212D or FN of to or TT by 1) 12121212042nt 452nt of to 2) 121212 3) by 12in In 12D 12 4) by 121212in in In 12FN 5) of In of a of NA ey 录 第一章 序 言 . 1 究背景 . 1 内外研究现状 . 2 蹄疫基因疫苗的构成 . 2 蹄疫基因疫苗的免疫机理 . 3 蹄疫基 因疫苗的不同免疫形式 . 4 疫佐剂在口蹄疫基因疫苗研究中的应用 . 6 究目的及意义 . 8 第二章 口蹄疫病毒 真核表达质粒的构建 . 10 料与方法 . 11 株与质粒 . 11 要试剂 . 11 要仪器 . 11 因 (片段 )的 增 . 11 因 (片段 )的 增 . 12 12因（片段）的 增 . 12 因的 增 . 12 3D 基因的 增 . 14 12因的 增 . 14 组质粒的构建、克隆及检测 . 14 果 . 17 段、片段和片段的扩增及鉴定 . 17 123D、 因片段的扩增及鉴定 . 17 隆及鉴定 . 17 因的序列测定及分析 . 19 论 . 19 第三章 口蹄疫病毒多基因重组质粒在 胞中的表达 . 21 料与方法 . 21 要材料 . 21 组质粒的纯化回收 . 22 胞的转染 . 22 接免疫荧光检测 . 22 抗体夹心 测 . 22 毒空衣壳的电镜观察 . 22 果 . 22 心 检测结果 . 22 接免疫荧光检测结果 . 24 蹄疫病毒空衣壳的电镜观察 . 25 论 . 25 第四章 口蹄疫裸基因疫苗对豚鼠的免疫效果研究 . 28 料与方法 . 28 粒、病毒、实验动物 . 28 要试剂 . 29 粒大量提取 . 29 验动物免疫 . 29 异抗体的检测 . 30 清中和抗体的检测 . 30 鼠 T 淋巴细胞增殖试验 . 30 毒试验 . 31 果 . 31 异抗体水平的动 态变化 . 31 清中和抗体水平 . 31 淋巴细胞增殖试验 . 33 毒试验 . 33 论 . 33 第五章 口蹄疫基因疫苗多质粒混合免疫方式对豚鼠的免疫效果研究 . 36 料与方法 . 36 粒、病毒、实验动物 . 36 要试剂 . 37 核表达质粒 构建 . 37 质体的制备 . 38 粒及脂质体质粒混合液的制备 . 38 验动物免疫 . 38 异抗体的检测 . 38 鼠 T 淋巴细胞增殖试验 . 39 毒试验 . 39 果 . 39 核表达质粒 构建 . 39 质体形态观察 . 39 异抗体水平的动态变化 . 40 淋巴细胞增殖试验 . 41 毒试验 . 41 论 . 41 第六章 口蹄疫基因疫苗对牛的免疫效果研究 . 43 料与方法 . 43 粒、病毒、实验动物 . 43 要试剂 . 44 质体的制备 . 44 粒及脂质 体质粒混合液的制备 . 44 验动物免疫 . 44 异抗体的检测 . 44 牛外周血淋巴细胞 增殖试验 . 44 毒试验 . 45 果 . 45 异抗体水平 . 45 淋巴细胞增殖试验 . 45 毒试验 . 46 论 . 46 第七章 结 论 . 48 第八章 文献综述 . 49 因疫苗的免疫机理 . 49 般特点 . 49 肉注射及皮内基因枪接种基因疫苗的免疫机理 . 49 因疫苗免疫接种途径及方式 . 50 疫途径 . 50 种方式 . 52 疫佐剂在基因疫苗研究中的应用 . 53 胞因子 . 54 . 56 学佐剂 . 58 刺激信号分子 . 61 学因子 . 61 附分子 . 61 化细菌体 . 62 毒载体 . 62 因疫苗研究新进展 . 63 因组免疫 （ 或表达库免疫 （ . 63 因免疫毒素 （ . 63 因免疫 . 63 因疫苗靶向细胞腔或细胞表面 (NA to or . 64 合抗原 NA . 64 免 - 蛋白 / 病 毒 加 强 免 疫 (. 65 因疫苗的应用前景 . 65 参考文献 . 66 致 谢 . 79 附 录 . 80 作者简历 . 92 中国农业科学院博士论文 第一章 序言 1 第一章 序 言 究背景 口蹄疫病毒（ 于小 毒科（ 蹄疫病毒属（ 有 O 型、 A 型、 C 型、 （南非型）、 （南非型）、（南非型）、 （亚洲型）等七个血清型 ,各型之间无交叉保护反应。 因组为长约 单股正链 有单一的开放阅读框，由基因、 构蛋白基因、 3 非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，该阅读框翻译产生的多聚蛋白前体在病毒自身编码的蛋白酶作 用下，加工成病毒粒子组装及复制所需要的结构蛋白及非结构蛋白。病毒蛋白 体由蛋白酶 3C 裂解为 些蛋白能够自我组装成二十面体的核衣壳，随着 解为 毒 装进病毒衣壳形成完整的病毒粒子 (et 995; et 1990; et 1989)。缺乏核酸的病毒衣壳由于包含 够诱导与感染性 子相同的免疫反应，尤其是这种衣壳能够诱导与完全病毒粒子相同的特异性中和抗体 (et 975)，其中 因是 要的免疫原性基因，含有细胞抗原表位 (141 160细胞抗原表位 (200 213能诱导机体产生中和抗体。另外 ,细胞抗原表位区构成的“ 暴露在病毒粒子的表面，环内 氨酸甘氨酸天门冬氨酸 )序列高度保守是病毒和宿主细胞结合的特异性位点 (et 1999; et 2000; et 1987)。非结构蛋白 2B 和 3D 在自然宿主中也是细胞免疫和体液免疫反应 的潜在刺激因子，将其作为基因疫苗构成成分注射后能诱导 T 细胞的高度增殖和迟发型过敏反应 (et 1985;et 1985)。 口蹄疫 (由 起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病， 30 余种家畜及野生动物可感染本病，最易感动物有牛、猪、羊、骆驼、鹿等；该病传播途径多、传播速度快，曾多次在世界范围内发生大流行；虽然该病的致死率不高 (幼畜除外 )，但可引起动物生产性能下降；该病的暴发影响国际贸易，往往造 成惨重的直接及间接的经济损失，如 1997 年我国台湾、 2000 年日本和韩国、 2001 年英国暴发的口蹄疫使该地区或国家畜牧经济遭受了沉重的打击 (et 2001)。为此，世界各国非常重视对口蹄疫的研究。正因为口蹄疫危害严重，联合国粮农组织和国际兽疫局将其列为 A 表中第一位烈性传染病。目前对于该病的防制主要采取屠杀、隔离和免疫接种，其中疾病流行前的免疫接种是特异性保护家畜免遭感染的有效手段，大部分流行口蹄疫或受威胁的国家或地区都采用疫苗防制政策，而安全有效的疫苗是成功防制乃至最终消灭口蹄疫的先决 条件。口蹄疫弱毒疫苗和灭活疫苗等传统疫苗都具有良好的免疫原性，事实证明，这些传统口蹄疫疫苗在该病防制策略的实施中发挥了重要的作用，但由于其具有热不稳定性、仅诱导血清型特异性免疫反应和短效的保护力以及为保证生产和运输中的安全而造成的高成本等缺点，尤其是近年来欧洲口蹄疫的爆发可能与疫苗中未完全灭活的病毒或病毒从疫苗生产地逃逸有关，使人们对传统疫苗的安全性产生了怀疑，因此，有必要开发一中国农业科学院博士论文 第一章 序言 2 种更安全、有效的新型口蹄疫疫苗。 近年来，生物工程技术及免疫学的迅速发展为研制口蹄疫新型疫苗提供了条件，以致在近十几年里，口蹄疫疫 苗在亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、抗独特型疫苗、核酸疫苗方面的研究均取得了很大进展，但由于基因疫苗刺激机体产生免疫应答的过程类似于病原微生物自然感染或减毒活疫苗的接种，而克服了减毒活疫苗可能返祖或变异的缺点，而且基因疫苗具有比蛋白质稳定，便于保存和运输；可同时引起体液免疫和细胞免疫，保护力强；对不同亚型的病原体有交叉抵抗作用；质量易于控制和评价，可避免生产过程中病原的污染；操作简单，生产迅速、成本较低等优点，使基因疫苗成为疫苗研究中的热点，甚至将其称为自传统疫苗、亚单位疫苗之后的第三代疫 苗。口蹄疫基因疫苗的相关研究也取得了很大进展，本文将对此作出系统阐述。 内外研究现状 基因疫苗（ 称 苗（ 核酸疫苗（ 是一种将编码某种蛋白质抗原的真核重组表达载体直接注射机体，在宿主细胞中表达外源基因，诱导特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，以达到预防和治疗疾病目的的新型疫苗。 蹄疫基因疫苗的构成 口蹄疫基因疫苗一般由两部分组成，即保护性抗原基因和真核表达质粒载体，保护性抗原基因可以 是编码 412001(et 2000;李光金 等 , 2001; 李光金 等 , 2001; et 2002)，也可以是单个基因（如 (et 2001) 或一组基因（如 2A、 3C、 3D） (et 1997; et 1998; et 2001; et 2001)，甚至 可以是口蹄疫抗原编码基因与其他具有协同保护功能的基因连在一起（如 重链恒定区） (et 2000; 李光金 等 , 2001; 李光金 等 , 2001; et 2002)。在选择抗原时，必须对口蹄疫病毒的相关分子生物学和免疫学知识深入了解，尤其要了解哪些基因的产物具有较好的抗原性，能否诱导最具保护力的免疫应答。由于口蹄疫病毒有不同的亚型，该类病原的基因疫苗应选择较保守的保护性抗原基因。同时还要分析保护性抗原基因中是否含有稀有密码子、有无内含子以及能否在哺乳动物细胞中 正确剪接等。 口蹄疫基因疫苗选择的载体主要是可在真核细胞中表达的质粒，大多以 些质粒均带有细菌复制子及真核生物的启动子，大部分还含有增强子和多聚腺苷酸（ 尾信号。不同类型的启动子 /增强子、内含子序列、翻译启始序列、转录终止序列等调控元件可直接影响基因表达效率，其中启动子类型是影响外源基因表达的主要因素。多数启动子来源于病毒基因组，其中源于巨细胞病毒（ 启动子转录活性较高，应用也最多，而且带有内含子的 动子的转录活性更胜一筹。因此， 动子常作为评价其他质粒 结构转录活性的标准，如人的桥粒蛋白启动子 /增强子 (et 2000)、人的延伸因子 1动子 (et 1999)、鼠肌肉肌酸激酶基因 (et 2000)及劳斯肉瘤病毒（ 末端重复区 (et 2000)等。已经证实，这些启动子能够诱导与 动子同样有效的免疫反应，如人的桥粒蛋白启动子 /增强子能诱导抗乙肝病毒表面抗原（ 高水平抗体反应及细胞毒性 中国农业科学院博士论文 第一章 序言 3 甚至诱导了抗 型嗜人 et 2000)；人的延伸因子 1动子诱导了直接针对病肝病毒（ T 细胞反应；而由鼠肌肉肌酸激酶基因启动子驱动的弱抗原的表达足以诱导抗疱疹病毒（ 特异性免疫反应。根据强启动子可以诱导抗原基因高效表达及更高水平的免疫应答，而弱启动子可能诱导长期的持续性免疫应答，在研制不同的口蹄疫基因疫苗时必须考虑应用不同的启动子。 现以 ） 为例说明其内部各个基因序列的功能。 ）质粒载体以 一种常用的非融合蛋白类型的高效真核表达载体。它除了具有多克隆位点（ 原核筛选标记（ 原核复制启始点（ ，还具有其特征的基因元件，如保证重组蛋白有效、高水平表达的人巨细胞病毒（ 期启动子 /增强子；可供重组质粒在体外转录 /翻译检测实验的 菌体 合酶结合的启动子，即它为 合酶的附着作用提供了特异性的识别位点；使 腺嘌呤化和转录