【毕业学位论文】（Word原稿）猪肺组织中差异表达基因的筛选动物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 猪肺组织中差异表达基因的筛选 of of in of of in 要 目前，猪呼吸系统疾病已成为我国许多规模化猪场和农村养猪大户十分关注的问题 。猪的呼吸道疾病被认为是困扰猪场生产经营的主要问题之一 ，是造成最大经济损失的疾病， 将是今后养猪业面临的主要难题。 猪呼吸 系统 疾病是多种因素综合作用的结果， 除了 遗传因素 以外，还 包括传染性、环境 以及 管理 因素 等 。 猪呼吸 系统 疾病 的肺组织炎症过程常导致 肺间质纤维化 ， 是呼吸衰竭的重要原因。 通过遗传选择提高肺组织炎症 抗性可能是解决这一重大疾病最好的长期策略。 对猪 肺 组织炎症抗性的基因表达调控和分子机制 目前还不 是很 清楚 , 这就严重阻碍了人们通 治疗、免疫接种和遗传选择等途径来显著提高猪肺组织炎症的整体抗性。本研究旨在通过分离和克隆与猪肺组织炎症抗性相关基因的探索性研究，初步揭示参与肺组织炎症抗性的基因种类和数量，为进一步深入开展肺组织炎症抗性的分子机理研究及将来通过遗传选择提高肺组织炎症的抗性提供理论基础。 本实验中首先应用抑制性消减杂交 (术成功构建了猪病变肺组织 与健康 肺组织差异表达 大白猪为材料，分离 )+ 转录合成单链及双链 酶切成为平均大小 150猪病变肺组织 成两组，分别与 2种不同 的接头连接，再与健康 肺组织 行 2 次消减杂交和 2 次抑制性 增，将第 2 次 体连接，转化大肠杆菌 终构建得到了具有高消减效率的猪肺组织炎症抗性相关 库扩增后得到 422 个白色阳性克隆，随机挑选 21 个克隆进行 定，鉴 定结果表明插入片段主要分布在150500间。 随后将从抑制性消减杂交过程中筛选到的初步差异表达的基因片段，经过反 库中高通量筛选得到 422 个差异表达的克隆。分别用地高辛标记猪病变肺组织和无病变肺组织 为杂交探针，对构建的 减文库利用反向1 个差异表达克隆，测序后得到 34个质量合格的 据在 将这些 类：第一类 代表已知基因，共 12 个；第二类代表已知 22个 。 代表已 知基因的 照基因功能分为 六 类：信号转导与细胞间通信、细胞结构与运动、细胞与机体防御、物质转运、翻 译与表达调控及其它。结合相关文献初步探讨了部分猪肺组织炎症相关 差异表达基因的作用和意义，其中猪免疫球蛋白重链基因 ( 核转录因子一 B)、 补体分子 钙粒蛋白 ( 平滑肌激动蛋白基因 ( 核糖体蛋白基因 ( ( 基因可能在猪肺组织炎症抗性中发挥重要作用。 关键词： 大白猪；肺组织炎症抗性；抑制性消减杂交；基因表达；差异筛选； 库 X ow is a is of to be in is in in is to XI be it of of in it to to of to to we in of A)+ 0 as )+ 50 00 as a of 8 h 00 CR CR . 422 of in 50bp in 1 of of in A 22 ( 41 4 A in nr ST ST 22, in on of is or an of of in on 、 an in in 目 录 第一章 文献综述 . 1 吸系统及其肺损伤机制 . 1 吸系统的结构及其与疾病的关系 . 1 损伤发生的机制 . 2 常见的呼吸系统疾病及其研究进展 . 3 因差异表达的研究方法 . 4 示筛选 (. 5 消减杂交 (. 5 异显示反转录 术 (. 6 表性差示分析法 (. 6 因表达系列分析（ . 7 制性消减杂交 (. 7 互扣除 . 11 异消减展示（ . 11 阵列分析 (. 11 研究意义 . 12 第二章 构建猪肺组织炎症抗性相关 库 . 13 言 . 13 料和方法 . 14 料 . 14 法 . 15 结果 . 26 部组织中总 . 26 链 成与酶切 . 27 头连接效率检测 . 27 减产物第二次 果 . 28 减效率检测 . 29 减文库中插入片段的 . 27 论 . 27 第三章 猪肺组织中差异表达基因片段的克隆测序和功能分析 28 言 . 28 料与方法 . 28 要试剂 . 28 要仪器设备 . 28 交所用溶液配制 . 29 异筛选探针的标记 . 31 针标记效率检测 . 33 入片段的扩增与点膜 . 33 点杂交与显色 . 34 异表达克隆选取 . 34 序 . 34 异表达 . 35 果 . 35 针标记效率检测结果 . 35 点杂交筛选结果 . 35 3 4 结论 . 39 猪免疫球蛋白 . 38 核转录因子 基因 () . 38 补体 分子 . 42 钙粒蛋白 ( . 42 a平滑肌激动蛋白基因 (. 44 核糖体蛋白基因 ( (. 44 第四章 全文结论 . 45 参考文献 . 46 致 谢 . 55 附 录 . 55 作者简历 . 56 英文 缩略词 (英文 缩写 英文全称 中文 全称 苄青霉素 部比对基本检索工具 基对 补脱氧核糖核酸 DD 乙基焦 碳 酸盐 ds 链互补 B 溴化乙锭 二胺四乙酸二钠 达序列标签 油醛 疫球蛋白重链可变区 丙基 - 道尔顿 使核糖核酸 OD 密度 酸盐缓冲溶液 合酶链反应 糖核酸 糖体 /分 转录聚合酶链反应 of 因表达系列分析 细胞计数 二烷基磺酸钠 化钠 ss 链互补 SH 制消减杂交 羟甲基氨基甲烷 43 1 第一章 文献综述 吸系统及其肺损伤机制 吸系统 的 结构 及其与疾病的关系 猪呼吸系统疾病与呼吸系统的结构和免疫机制是密切联系的。呼吸系统由鼻、咽喉、气管、支气管及其分支（细支气管和呼吸性细 支气管）组成的长长的呼吸道。大量的肺泡和肺泡囊附着在呼吸性细支气管上。在由鼻到呼吸性细支气管的管道系统中，管道的总面积逐级增大，到细支气管这一级时，管道总面积已非常大，这种结构影响气流的速度，有利于尘埃和微生物的沉积。在吸入的各种病原因子作用下，肺内细支气管 首先是因为吸入并能到达肺深部小颗粒（直径 米）主要沉积在这一部位，其次是因为肺泡内排出的细胞性和非细胞性物质经过狭窄的细支气管腔时，很容易在这个部位滞留。在外界不良条件作用和机体抵抗力下降时，如脱水、受寒 、细菌、病毒或寄生虫感染、饥饿、吸入有毒气体、代谢紊乱、肺瘀血、肺水肿等情况时，病原微生物则可入侵定居和繁殖，引起支气管肺炎。 整个呼吸系统都有自己的非特异性屏障。从鼻到细支气管黏膜都有一层单层柱状纤毛上皮覆盖，上皮层中有一些能分泌黏液的杯状细胞，它所分泌的黏液能粘附微生物和气源性颗粒，借助纤毛的摆动将这些异物排出。此外黏液中还含有杀菌物质，如溶菌酶、铁蛋白及低分子肽等。溶菌酶对革兰氏阳性菌，铁蛋白对巴氏杆菌，低分子肽对胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌均具有很好的杀灭作用。肺泡壁没有黏液，而是靠肺泡巨噬细胞 的吞噬作用及表面活性物质来清除。但是这种清除作用对某些毒力较强的细菌如胸膜肺炎放线杆菌的清除作用不大，相反，这些毒力较强的细菌产生的毒素能使肺泡巨噬细胞失去活性，从而迅速定居增殖并引发疾病。多数西方学者认为多杀性巴氏杆菌属于继发感染，而胸膜肺炎放线杆菌属于原发感染。 另外，猪呼吸系统的疾病 与 呼吸系统的免疫应答和免疫抑制 密切相关 。与胃肠道类似，呼吸系统的抗菌保护主要靠 使在有抗体存在时，那里也有大量的微生物群。 此不能激活 C3C5的生物功能或 C8介导的溶菌作用，其也没有调理活性，因而 2 强巨噬细胞的吞噬作用。在呼吸系统中， 反， 而使肺基本保持无菌。猪感染病毒、肺炎支原体和胸膜肺炎放线杆菌时能引起呼吸道单核细胞的浸润，具有细胞介导免疫的活性。在胸膜肺炎放线杆菌感染中，细胞介导免疫通过激活巨噬细胞而起着重要作用。当细胞介导免疫不存在时，抗放线杆菌抗体的强烈免疫应答是有害的。这是由于当非活化的肺泡巨噬细胞摄取大量放线杆菌而又不能将其消化时 ，被摄入的放线杆菌分泌出细胞毒素，使巨噬细胞失去活性。 一些免疫、自身免疫或代谢性的全身性疾病，如结节病，系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎、硬皮病等都可累及肺部。肺还具有非呼吸性功能，如肺癌异位性激素的产生和释放所产生内分泌综合证。 肺损伤 发生的 机制 多种急性和慢性肺疾病伴有不同程度的肺部炎症和肺纤维化统称为肺间质疾病 ,肺间质纤维化是各种不同病因肺间质疾病的共同结局 ,是呼吸衰竭的重要原因。对肺间质纤维化 所造成的肺部组织损伤的发病机制的 始动因素目前还不清楚 ,有人认为与遗传易感性、 病毒感染、免疫功能异常等有关。各种损伤因素损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞 ,引起肺泡巨噬细胞 (活化 ,单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细 胞等炎症细胞浸润 ,炎症细胞及其释放的细胞因子和炎症递质介导了早期的肺损伤 。有以下炎症细胞和细胞因子参与了早期的肺损伤过程 源的细胞因子 化后释放的细胞因子和炎性递质在早期肺损伤中起主要作用。在肺损伤时 , 1 ,肿瘤坏死因子 ( ,单核细胞趋化蛋白 (1 ,转 化生长因子 ( ,血小板源生长因子 ( 、胰岛素样生长因子 ( 1 以及其他趋化因子和黏附分子。这些细胞因子一方面使炎症细胞浸润 ,化和成熟 ,另一方面促进细胞因子和炎症递质的进一步分泌和表达 ,形成复杂的细胞因子网络 ,引起肺泡炎和肺损伤。 单核细胞趋化因子 , 中性粒细胞趋化因子 , M ,并损伤肺泡上皮细胞及血管内皮细胞。 致纤维化的生长因子 ,在早期分泌增多 ,同时启动肺纤维化的过程 ,形成不可逆性肺损 伤 （ C， 1996） 。 性粒细胞 近年来 ,中性粒细胞在肺泡炎和肺实质损伤中的作用日渐引起重视 , 人和博莱霉素肺纤维化模型支气管肺泡灌洗液 () 的中性粒细胞数目都明显增高 （ M， 3 1995） 。中性粒细胞来源的活性氧化物和中性粒细胞崩解后释放的蛋白水解酶既对肺组织有直接损伤作用 ,又能促进 放其他细胞因子。 人肺纤维化程度与肺组织中中性粒细胞活性密切相关 , 中中性粒细胞比值低、淋巴细胞比值高者对治疗反应好 ,预后好 。 他细胞和细胞因子的作用 在早期肺损伤时 ,上皮细胞和毛细血管内皮细胞是受到损伤的靶细胞 ,但受损伤后分泌的细胞因子又参与了肺损伤和肺纤维化。在鼠的博莱霉素肺纤维化模型中 ,肺泡型上皮细胞的 达增高 , 白表达增高 （ 宋明臣， 1998） ,上皮细胞和 内皮素 ( 1 蛋白表达增高 （ E， 1998） ,嗜酸性粒细胞分泌 肺组织 达增 高 , 嗜酸性粒细胞、单核细胞有趋化作用 ,能够刺激成纤维细胞增殖和胶原合成 , 够诱导嗜酸性粒细胞分化、增殖和活化。 人 蛋白表达增高 , 中 高 （ ， 1998） 。在鼠的博莱霉素肺纤维化模型中 ,肺内和 中淋巴细胞升高 ,值升高 ,T 淋巴细胞的 达增高 ,抗 巴细胞单克隆抗体治疗后肺纤维化减轻 ,表明淋巴细胞介导的免疫反应也参与了肺损伤。核因子 B () 是调控炎症 反应的重要转录因子 ,与炎症性疾病密切相关 ,在博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中 ,肺 活性增强 ,伴有 达增高 ,在早期肺泡炎阶段尤其明显 （李永春 ，1999） 。 源的生长因子是肺损伤后过度修复和肺纤维化发生的重要原因。在修复阶段 ,纤维化病灶附近的 纤维化病灶内的成纤维细胞 能刺激成纤维细胞增殖和胶原合成 ,促进胶原蛋白、纤维连接蛋白、透明质酸、蛋白聚糖等在细胞外基质 中沉积 ,减少细胞外基质的降解（ ， 1998） 。 是重要的致纤维化生长因子 ,能刺激平滑肌细胞、成纤维细胞增殖和胶原合成。 总之 ,肺间质纤维化是一种免疫介导的炎症性疾病 ,多种炎症细胞和细胞因子参与了肺纤维化的发病过程 ,传统的激素和免疫抑制剂治疗仍是目前主要的治疗手段 ,新的抗纤维化的药物和细胞因子治疗正在为肺纤维化的治疗开辟新的途径。 猪常见的呼吸系统疾病 及其研究进展 猪 常见的呼吸系统疾病 从病理学上，按其发病部位，可分为 3种主要类型：鼻炎、肺炎 、胸膜炎。不同病原侵袭不同生理部位，造成靶器官损伤或全身各系统病征。在生产中，常见 4 的呼吸系统疾病可分为以下几类：（ 1）细菌性呼吸系统疾病，主要有支原体肺炎（猪喘气病，猪放线杆菌胸膜肺炎（ 猪链球菌病（ 进行性萎缩性鼻炎（ 猪肺疫等；（ 2）病毒性呼吸系统疾病，主要有猪繁殖与呼吸系统障碍综合症（ 猪伪狂犬（ 猪流感（ ,猪瘟（ ；（ 3）细菌和病毒混合感染的呼吸系统疾病，主要有猪呼吸道疾病综合征（ 猪断奶后多系统衰竭综合征（ ；（ 4）寄生虫 性呼吸系统疾病，如由蛔虫、后圆线虫、肺丝虫等引起的呼吸系统疾病。 目前对猪的呼吸系统疾病的防治 主要还是 根据各 猪 场实际情况，建立生物安全体系，制定相应的技术和管理规范 措施来解决出现的疾病问题 ， 从分子遗传角度来改善猪呼吸系统疾病相关抗性的研究 还比较少 见，但是 关于猪 呼吸系统方面的遗传差异已有 多数研究 报道 ，呼吸障碍在某种程度上受遗传影响 ，如：在基因选择的肥胖猪中，发现肺脏的肺泡巨噬细胞的吞噬功能比经基因选择的瘦肉型猪的效力强的多，这种差异在冬季和夏季时最明显（ 1990） ； 有临床观察表明，纯种汉普 夏猪（ 约克夏猪呼吸系统疾病的发病率低 （ ， 1986） ； 约克夏猪比长白（ 对萎鼻（ 易感性高 （ 1983） 。 到目前为止，对猪肺组织中抗病性遗传机制及肺组织中与抗病性有关的基因研究还不多。 对于猪呼吸系统疾病的防治还没有从根本的免疫机制和基因水平上去改变猪本身的免疫抗性， 可以通过研究猪呼吸系统疾病相关因子和基因， 采用细胞因子治疗法和基因治疗法，从根本上提高猪的整体抗病力 。 因差异表达的研究方法 基因的时空差异表达是有 机体发育、分化、衰老和抗逆等生命现象的分子基础。基因在不同组织、不同器官以及不同环境条件下的差异表达特征为基因的功能提供了重要的信息。 高等生物大约 30000是同时表达的基因只有很小的一部分，约15%左右。 而这些基因的表达是按事件和空间顺序有序地进行着，这种表达的方式即为基因的差异表达。 基因的选择表达，决定着整个生命过程中的发育，分化，内环境稳定，刺激反应，细胞周期调控，衰老以及程序化死亡等正常的发育过程 ， 另外， 在疾病中出现的病理性改变，无论是单一基因突变引起的或是多基因的复杂效 应，也都是由基因表达的改变所决定的。因此，比较两种不同类型细胞中基因表达的差异，就可探究造成这两种细胞的表型差异的遗传原因，提供研究生命过程的基本信息。 5 基因差异表达有两种含义 ， 包括新出现的基因表达与表达量有差异的基因表达。 无论基因发生哪种差异表达，都会对其生理过程造成重要的影响。 研究基因差异表达的方法很多， 常用的方法 大致归纳如下几种。 示筛选 (差别杂交 (叫差别筛选 (适用于分离经特殊处理而被诱发表达的 差别杂交的技术基础十 分简单，它不需要任何有关的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是 要 拥有两种不同的细胞群体。在这种情况下便可制备到两种不同的 此，可以通过这两种总 是它们的 为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总 应用差别杂交技术分离克隆的目的基因存在着诸多方面的局限性。首先，差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的 个缺点就显得更加突 出。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗费时间和金钱的工作。况且两套平行转移的滤膜之间， 样所得的杂交信号的强度也就不会一致，需要重新进行点杂交，以作进一步的阳性克隆鉴定工作。所以说重复性差是差别杂交筛选法的又一个缺点。 差别 杂 交技术在理论上很具吸引力 ,但实际操作并不容易 :首先是回收 并仍存在重复性差 ,敏感度低的缺点 ,这些均限制了这一技术更广泛的使用。 减杂交 (消减杂交又叫扣除杂交或 扣除 它是通过构建扣除文库 (以实现的。 1984年， 差异表达的基因通过检测样本 过量的对照样本 相互杂交而得到 ， 是早期建立的经典方法。该法通过构建富含目的基因序列的 本质是将共同拥有的序列消减掉，以富集目的基 因序列，提高分离的敏感性。 将消减杂交法的基本原理应用于 两个不同来源的 同样可鉴别出只在一种 而鉴定出差异表达的基因。 另外， 扣除杂交法同样也可以用来分离缺失突变基因。 该法对高丰度的 其适于分离由于缺失而造成的遗传病的相关基 因；但很难获得低丰度的差异基因，且存在重复性差、敏感性低的缺点 6 异显示反转录 术 (差异显示反转录 术是 1992年 由 P,992)，它是以分子生物学上最广泛应用的两种技术 基本原理是：以一对细胞 (或组织 )的总 用 过 5 端与 3 端引物的合理设计和组合，将细胞 (或组织 )中表达的约 15 000种基因片段直接显示在 而找出一对细胞 (或组织 )中表达有差异的 同其它方法相比较 虽然 有很多优点 : l）简单易行 2）灵敏度高 3）重复性好 4）多能性 5）快速 但在实际操作中仍 存在一些问题 ,主要表现在 : 1)出现差别条带太多 ,假阳性率高达 70%左右 ,重复性差 ,且对高拷贝数的 2）在有差异的显示片段中难以知道哪个基因是已经研究过的，哪些是未知基因 。 3)得到的有差异的扩增条带短 ,一般在 110 4）以 )为引物的 所以差别显示技术自 1992年建立后，一直在不断进行着改进。第二代差异显示系统 :限制性酶切片段差异显示（ 就是一个很有效的改进。 是首先限 制性酶切 在酶切后的 是 异性 决了第一代差别显示系统的重复性问题 。总之， 点放大和展示编码区，对原核及真核 大消除假阳性。 差异显示技术经过一系列的改进，其假阳性率有了一定的下降，但是仍然无法完全解决 。 表性差示 分析法 (1993年， 1994年， 代表性差异分析法， 其目的在于减少假阳性，增加重复性。该技术充分发挥了 指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使目的基因片段得到特异性扩增。 此技术最大的优势是差异条带在 阳性少 。 但是如果两组间存在较大差异，以及某些基因在检测子 (存在上调表达时，此方法显得 7 力不从心， 达不到预期目的；而且 所需起始材料较多，更多信赖于 之间若存在较多差异，或 难达到预期目的，而且工作量比 期长 ；另外 操作步骤比较烦琐，低丰度分子被扩增的几率仍很低，酶切连接步骤多， 能漏掉关键基因。 因表达系列分析（ 基因表达