【毕业学位论文】（Word原稿）TGEV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其S蛋白抗原位点的原核表达-预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 学位论文 光定量 测方法的建立及 其 S 蛋白抗原位点的 原核 表达 of of 中国农业科学院 硕 士学位论文 摘要 I 摘 要 猪 传染性胃肠炎 （ 是由 猪 传染性胃肠炎病毒 （ 引起 的 一种 以一周龄以下仔猪呕吐、水样腹泻和高死亡率（通常为 100%）为主要特征的传染病 。 该病是一种世界性的疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失。 由于它主要引起一周龄以下仔猪几 乎 100%死亡 ，所以及早的确诊对该病的防治就具有特别重要的意义，因此建立一种快速、 高灵敏度 的诊断 方法对防治 十分必要的。 而 传统的检测 方法都不能满足特定要求 ， 荧光定量 术的出现解决了这一难题。 本研究根据猪传染性胃肠炎病毒 N 基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针， 增 得到 目的基因，并克隆到 体得到阳性质粒，用分光光度计对质粒定量， 10 倍梯度稀释即为质粒标准品。 通过对荧光定量应条件的优化，建立了 光定量 测 方法。同时对 60 份现地病料进行检测并与常规 法、 原快速检测试剂盒 （免疫层析法） 比较。结 果，该方法的检测敏感性达到 15 拷贝 /l ， 且具有很好的特异性和重复性， 而 常规 法只能检测到 03 拷贝 /l 。 对现地病料的检测结果也表明该法比常规 法和 原快速检测试剂盒的敏感性高 。 猪 呼吸 道 冠状病毒（ 是 基因缺失变异株， 苷酸序列比较同源性达 96%。由于 原有相关性，产生的中和抗体有交叉反应，因此多克隆抗体等血清学方法很难将二 者区分开。 比， 其 S 基因 N 末端有大量碱基缺失，不同的 株其碱基缺失情况也各不相同，有 621 681 个碱基不等的缺失，并导致 去两个抗原位点 。本研究 根据 已发表的 因组序列（ 陆号： 的 S 基因序列和本实验室测定的 基因序列进行比对分析， 用一 对特异性引物对 基因 缺失区域 即 蛋白的 B 和 C 抗原位点 （ 91 513行扩增， 扩增后的片段 克隆到 )表达载体进行 原核表达 。 果表明，目的蛋白成功表达，且蛋白表达量很高，占菌体总蛋白的 析结果 表明目的蛋白具有很好的免疫学活性。 本研究成功的高效表达了 蛋白 B、 C 抗原位点多肽， 为 血清学鉴别诊断，或用于制备特异性单克隆抗体以区分 奠定 了重要的基础 。 关键词 ： 猪 传染性胃肠炎病毒； 猪 呼吸 道 冠状病毒； 荧光定量 原核表达 中国农业科学院 硕 士学位论文 I is as of of It is a to of it is to vi as as So it is to a In to of by to we ed to 60 of T . It 5l of NA of 03l . of of T is of 6%. is is so it is to by 21 681 at In 1) to in of of In it is an to by or 国农业科学院 硕 士学位论文 目录 目 录 英文缩略表 . V 第一章 绪论 . 1 传染性胃肠炎概述 . 1 原 . 1 毒生长培养特征 . 2 子生物学研究进展 . 2 因组结构 . 2 白结构与功能 . 3 组织嗜性 . 5 子生物学诊断方法研究进展 . 6 酸探针杂交技术检测 . 6 合酶链式反应检测 . 7 鉴别诊断方法 . 8 望 . 9 光定量 术研究进展 . 9 光定量 量原理 . 10 用的荧光定量 . 10 光探针的种类及其作用原理 . 11 光定量 术的优点 . 12 光定量 术的应用 . 12 究的目的和意义 . 14 第二章 光定量 测 法的 建立与应用 . 16 料 . 16 毒与细胞 . 16 料 . 16 体与受体菌 . 16 要试剂 . 16 要仪器设备 . 16 物与探针 . 17 法 . 17 毒的增殖 . 17 镜观察 . 17 织培养半数感染量（ 测定（ ） . 18 毒 内参基因组的提取 . 18 转录 . 18 物鉴定及纯化回收 . 18 物连接与转化 . 19 组质粒提取、鉴定及序列测定 . 20 粒浓度测定 . 20 光定量 各种反应条件和参数摸索 . 20 . 22 . 23 试验 . 23 . 23 中国农业科学院 硕 士学位论文 目录 地病料的检测 . 23 果 . 23 . 23 . 24 基因与 因目的片断的 增 . 24 组质粒 构建与鉴定 . 25 组质粒浓度的测定 . 25 应条件的优化 . 25 线的建立 . 25 . 27 异性试验 . 28 复性试验 . 29 地病料的检测 . 31 论 . 31 第三章 基因抗原位点 的原核表达 . 35 料 . 35 毒 . 35 体和载体 . 35 要试剂 . 35 物 . 35 法 . 35 的基因的获得 . 35 组表达质粒的构建 . 35 组蛋白诱导表达及条件优化 . 36 组蛋白的纯化 . 36 测 . 36 果 . 36 的基因的获得 . 36 组质粒的 定 . 37 组蛋白的表达鉴定及条件优化 . 37 组蛋白的纯化 . 37 析 . 37 论 . 39 第四章 全文结论 . 41 参考文献 . 42 致 谢 . 48 作者简历 . 49 中国农业科学院 硕 士学位论文 英文缩略表 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 基酸 基对 异系数 胞病变 值循环数 焦碳酸二乙酯 荧光定量 荧光共振能量转移 M N 衣壳 苷酸 放阅读框架 酸盐缓冲液 流行性腹泻病毒 合酶链式反应 呼吸道冠状病毒 限制性片段长度多态 反转录 S 突 膜 特定病原体 0% 织培养半数感染量 传染性胃肠炎 传染性胃肠炎病毒 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 传染性胃肠炎概述 猪传染性胃肠炎（ 由猪 传染性胃肠炎病毒（ 起 的一种高度接触传染性肠道疾病，以引起 一 周龄以下仔猪呕吐、水样腹泻和高死亡率（通常为 100%）为主要特征。虽然各种年龄的猪对该病都易感，但 5 周龄以上猪 的死亡率则很低， 成年猪几乎没有死亡。 1933年起，美国的依利诺斯州就有本病的记载，此后该病在美国广泛流行。 1945年 1946）首次确定本病的病原体为病毒，并作了详细的报道。 1956年在日本（ et 1958）， 1957年在英国（ et 1958）相继发生了该病，以后欧洲、亚洲、北美洲等许多国家相继报道了该病。 目前该病已遍布全世界各养猪国家，给养猪业造成了严重损失 (殷震等 ，1997； et 998; et 1997)。目前，美国每年因猪只感染 00万美元 (S et 2005)。我国最早发现本病是 1956年在广东省揭阳、惠来 和汕头市的几个猪 场 中，到 1973年在上海、辽宁、吉林、黑龙江等地也有发生，至 2000年我国大部分省市 (区 )均有本病的流行，并且呈上升趋势。该病毒于 1964年在我国首次被分离。世界动物卫生组织 ( 类传染病，是我国法定检疫的疫病。 1984年在比利时 首次分离出 猪呼吸道冠状病 毒（ (2000)，此后 国目前也有该病的报道 。 猪呼吸道冠状病毒是猪传染性胃肠炎病毒基因缺失变异株，主要引起呼吸道疾病。猪呼吸道冠状病毒病呈亚临床症状，不同的毒株引起的临床症状及严重程度不同，一般是呈现 轻微的呼吸道疾病，如轻微的间质性肺炎、呼吸加快、发热及体重下降等（覃健萍等， 2004； 沈海娥等， 2003； 查红波 ， 2003）。 原 猪传染性胃肠炎病毒 (尼多 病毒 目 （ 冠状病毒科（ 冠状病毒属 (员 (et 1995)， 有囊膜，形态多样，呈圆形、椭圆形和多边形，电镜感染观察全病毒直径为 60 160膜上覆有花瓣状纤突，长 18 24极小的柄连接在囊膜的表面，其末端呈球形， 直径约 10片时容易使纤突脱落，所以经常只看到囊膜的边界，或者只在囊膜的某些部位有这种花瓣状纤突。病毒粒子内部为 螺旋式结构，直径为 9 16 et 1990; et 1997） 。 对来自美国、英国和日本的 10个毒株（包括用猪传代和用细胞培养物传代的 毒株）进行交叉中和试验和噬 斑减数试验，证明 毒株之间有密切的抗原关系。 猪流行性腹泻病毒（ 无抗原相关性，但与犬冠状病毒（ 猫传染性腹膜炎病毒（ 间有抗原交叉关系，犬和猫被认为是 病毒冷冻储存非常稳定，病猪肠组织中的病毒 存放 6 18个月未见滴度下降 （ et 1955; et 1956）， 但病毒不耐热， 56 4565 10织毒置于 37 ，中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 每 24胞培养毒分别存放于 、 、 ， 365天后滴度无明显下降，而存放于 37 4天，感染性全部消失 （ et 1968; et 1980） 。 病毒对乙醚、氯仿、去氧胆酸钠、福尔马林、氢氧化钠等敏感， 醛溶液 37 处理 20仿溶液中室温放置 10毒在 8稳定， 毒在胆汁中相对稳定，对胰酶有抵抗力。但是强毒株和弱毒株对胰酶和蛋白分解酶的感受性不同：毒株毒力越弱，对胰酶的感受性越高。正是由于 使其自身可以抵抗胃肠的酸碱环境（ G, 1995）。病毒对光敏感，将 105个半数 猪感染剂量的 粪 便材料置于平皿中，在日光下照射 6h，可使病毒灭活；紫外线能使 病毒迅速灭活。 据报道 条件下能凝集鸡、鼠和牛的红细胞。 毒生长培养特征 在体内， 在于猪的各器官、体液和排泄物中，其中十二指肠、空肠、回肠粘膜中的病毒检出率和病毒滴度最高，特别是空肠。病毒在鼻腔、气 管、肺等呼吸道粘膜及扁桃体、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结等淋巴系统 也 能良好增殖。 消化道和呼吸道（严懿嘉等， 2006；et 1975）均可感染传播 ， 病毒可随病猪和恢复 期带毒猪的粪便和鼻汁排出，经粪便排毒的持续时间约 8 周。 在体外， 敏感的细胞是猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、猪辜丸细胞（周燕等， 2005）和胎猪肾细胞 (郎景华等 ， 2003)。 971)报道，在 26份检样中， 22份在猪甲状腺细胞培养物中出现不同程度的细胞病变，细胞单层约 25%被破坏，并在第 1代培养物中即可出现细胞病变。 971)认为 年来， 并方便的细胞培养系。初次传代时，野毒株产生的细胞病变可能是短暂的或轻微的，有时仅在整个培养物中出现几个小点，易被忽略。在用猪肾细胞盲传若干代之后，才能看到比较明显的细胞病变。某些毒株，即使盲传多代，也不会产生细胞病变。 毒通过内质网的出芽形式成熟，成熟病毒从感染细胞逸出被覆在宿主表面，在感染细胞表面可检测到 能在核内增殖，不产生包涵体。 子生物学研究进展 因组 结构 基因组为不分段的单股正链 小 约 为 子质量为 6103是所有 基因组最大的。