染色体显微操作

,第六章染色体显微操作,染色体微分析技术包括：染色体显微切割、分离；PCR体外扩增；微克隆技术，染色体或特异区扩增产物间的Southern杂交及特异DNA片段的FISH定位。该项技术是近十多年来随分子生物学技术发展而诞生的一项生物高新技术，它既有细胞生物学的可视性，又有分子生物学的先进性，在染色体结构、基因组和比较基因组学、基因克隆、物理图谱构建等方面具有广泛的应用前景。,显微切割技术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。显微切割技术实际上属于在微观领域对研究材料的分离收集技术，因此应用此技术往往是许多要深入的研究工作中起始的重要一步。,显微切割的特点一是“细微”，显微切割的对象可以达到微米级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和染色体特异区带这样细微的对象；二是“原位”，利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。三是“同质”，显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性。四是“结合”，显微切割技术可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。,显微切割的结合技术能与多种分子生物学、免疫学、遗传学及病理学技术结合应用，使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记。显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等蛋白质和核酸的相关分析。,显微切割的影响因素 最终结果的因素多种多样。在实验过程中把握一个原则,即一切与显微切割结合的技术中影响因素应同时列为显微切割实验最终结果的影响因素，在实验的过程中予以考虑。与不同的方法结合决定了需要对显微切割的材料进行不同的处理。,染色体显微切割技术出现于20世纪80年代。Scalenghe等（1981）首次报道了应用特殊玻璃针对果蝇唾液腺染色体进行切割、分离和显微克隆。因为当时尚没有发明PCR技术，需分离数百条染色体才可获得足够数量的DNA。 PCR技术发明之后，Ldecke等（1989）将PCR技术应用到染色体显微切割和克隆中，仅用少量切割片段就获得了足够数量的DNA。 自1989年以来，染色体的显微切割技术的研究成果主要是人类染色体区带特异探针池的构建，采用玻璃针法已相继构建了一系列人类染色体区带探针池。,时至今日，植物染色体分离技术也已经发展成熟，并成为构建染色体特异区段DNA探针池最为有效和直接的技术手段，例如，应用显微切割技术可以获得长度为13Mb的DNA片段，相当于水稻基因组遗传图谱上13cM。 在理论上，遗传标记之间1cM的距离已连锁非常紧密。因此，应用染色体显微切割和分离技术建立特定染色体区段的DNA文库，已成为筛选与基因紧密连锁的分子标记和基因克隆的有效方法之一。 染色体显微切割的方法主要有5种：流式细胞分类器法、微细玻璃针法（手工操作法）、激光切割法、玻璃针-激光法和激光捕获微分离法。此外，目前开始尝试使用微操作机器人系统。,1、激光切割法此法与手工操作法的主要差别在于：用激光束代替玻璃针，将染色体标本上不需要的片段剔除，然后将剩余染色体片段消化、扩增。Fukui等利用此法成功地切割了植物染色体片段，但是该方法对设备要求较高，激光切割区域对DNA分子也有损伤。,2、流式细胞分类器法：流式细胞分类技术分析和分选染色体是分子生物学和遗传学研究的一个非常有效的方法。1983年至1986年，美国的两个实验室用流式细胞分类器和分子生物学技术建立了人类24种染色体特异性的基因文库。也有学者利用此项技术分离了番茄第二号染色体。,优缺点使实验过程机械化，可用于处理大批染色体。但结构相似的染色体难以分开，使有些文库中其它染色体污染率高达10-50%，不能构建染色体区带特异性文库。,3、玻璃针-激光法由于激光显微切割法需要价格昂贵的特殊培养皿，操作也较复杂。且氩离子激光热效应大，容易对切口附近的染色体DNA造成较大损伤。玻璃针法较为成功，但难以对染色体进行精确的定位切割。王槐等研究了一种由激光微束与玻璃针结合使用来切割分离植物染色体片段的方法。,优缺点盖玻片的存在减少了切割过程中外源DNA分子的污染，且为油镜下更准确地识别目的染色体和定位切割靶点创造条件，切割准确；因为用玻璃针分离切割后的染色体，所以用普通载玻片即可进行染色体制备，费用较低；但仍需借助玻璃针的操作，易污染。,4、激光捕获微分离法它是一种将紫外激光束切割与激光压力弹射相结合的新方法，激光聚焦点直径小于1um，是目前最为先进的技术，它使染色体显微切割操作步骤大大简化。,将超薄膜用胶带封固在干净的载片上，紫外消毒，染色体制片。用激光脉冲将靠近目标染色体的不需要的遗传材料选择去除。围绕目标染色体，用激光脉冲切割薄膜，通过激光压力弹射操作仪将切下的薄膜上的目标染色体弹射到距载玻片小于1mm的收集装置上，如果所需目标染色体数目多且相同，则可收集到同一个收集装置上。,优缺点除具有激光微切割的优点之外，还在一种环境中操作，避免了污染；激光波长为337nm，远离DNA最大吸收波长260nm，无热效应产生，不会损坏材料；样品可长时间保存。但仪器及薄膜价格极为昂贵。,PALM激光显微切割系统 由德国PALM公司研发的一套高级精确的实验室设备。利用337纳米的紫外激光对显微镜下的生物样本（组织，细胞簇，单细胞，染色体，染色体片断等）进行切割和分离。在病理学，遗传学，肿瘤学、植物学等多个科研领域得到非常广泛的应用。,PALM激光显微切割系统,PALM激光显微切割系统操作界面,5、手工切割法：此法主要步骤包括：a、染色体制备，常规制备的中期染色体即可；b、染色体显微切割，在倒置显微镜下配置显微切割器 ，并将制备的硅化玻璃针安装在切割器上，把染色体标本置于载物台上，在显微镜下找到待切割染色体标本，操作玻璃针进行切割；c、切取染色体片段进行原位裂解和体外扩增。,染色体微分析技术就是在对染色体显微切割和分离的基础上建立起来的。因此它的前提是必须对染色体能够准确地识别和精确切割与分离。国内改进了当前普遍应用的倒置显微镜切割的方法，采用了普通透射光学显微镜，用100倍油浸物镜在1000-1500高倍数下，对染色体进行切割和分离，不但对染色体的个体能准确地识别，而且可使切割的精确度达到0.3微米。,改进的染色体微分析技术,1.玻璃针的制备,玻璃针拉制器将玻璃管拉成合适粗细的玻璃针,利用弯针器将玻璃针弯成合适的弯度,2.染色体的微切与分离,全细胞染色体的分离特定单条染色体的分离染色体特定区的显微切割, 水稻基因组全细胞染色体的分离,A.分离前水稻细胞,箭头所指为4号染色体 B.分离4号染色体后的细胞,A,特定单条染色体的显微分离,A B 黑麦B-染色体(箭头所指)的显微分离A. 分离前的核型(2n=14+2B) B. 分离出一条B-染色体后的核型,黑麦1R染色体的显微分离,染色体特定区的显微切割,A. 显微切割前的黑麦完整核型（箭头所示为B染色体） B. 显微切割后的核型（箭头所示为切除端粒片段的位置）,A,B,黑麦B染色体端粒区的显微切割,黑麦B染色体着丝粒区域微切过程,微切前,微切后,微操作机器人系统 微操作系统作为MEMS（微机械电气系统(Micro-Electro-Mechanical Systems）研究领域的一个重要分支受到各发达国家的高度重视，纷纷投入大量资金进行微操作机器人系统的研究，现已研制出多种各具特色的微操作机器人实验样机系统。,生物工程作为微操作机器人系统的主要应用领域。把生物工程作为微操作机器人的应用领域，目的可以解释为2点：从应用层面说，目标相当明确地界定在“面向生物工程”上，如细胞操作、基因转移、染色体切割等，希望给下一世纪中国的“绿色革命”带来推动作用。从技术层面说，定位在基于显微视觉全局闭环的计算机伺服自动协调作业上。长远观之，其相关技术与微加工、微电子、显微医学等可触类旁通。,系统的具体运作方式：活体细胞或染色体悬浮在培养液内，左右微操作机器人对称地安装在显微镜机架上，毛细玻璃管与毛细玻璃针等操作工具作为机器人的末端执行器(毛细玻璃管用于捕捉与固定细胞，毛细玻璃针用于细胞的切割、注射等)。,哈工大纳米级微驱动及微操作机器人平台,纳米微操作机器人在1010微米的基片上刻出的字样,3、扩增产物的原位杂交分析,利用荧光原位杂交技术可直接将某个区段的DNA直接定位在染色体上，进行PCR产物的鉴定。同时还可以将某个区段DNA定位到相关的其它植物染色体上，进行染色体“一对一”的杂交和进行单条染色体之间的比较作图研究。,黑麦A、B染色体着丝粒区DNA同源性的荧光原位杂交分析,黑麦A、B染色体端粒区同源性的荧光原位杂交分析,玉米B染色体特异片段荧光原位杂交结果A为中期染色体，B为间期细胞核,B480在玉米中期和间期细胞(2n=20+4B)中的原位杂交定位,B1320在玉米中期和间期细胞(2n=20+6B)中的原位杂交定位,4、单条染色体AFLP分子标记图谱分析,单条染色体AFLP分子标记图谱分析，可以直接获得任意一种植物特定染色体分子标记图谱，利用这些相同的DNA分子标记，在相关的物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上基因及排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因结构和起源进行分析，为基因的克隆、基因组的比较研