血红蛋白电泳及其临床应用

1 4 血红蛋白电泳及其临床应用血红蛋白电泳及其临床应用 鄢盛恺 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院检验科 北京 100730 早在 60 多年前 Pauling 等 1949 在研究镰状红细胞贫血患者的血红蛋白 hemoglobin Hb 时就发现其与正常人不同 证实这种异常的 Hb 在缺氧条件下是产生 红细胞镰变和溶血性贫血的原因 并提出了 分子病 这一新概念 引起了人们对 Hb 结 构异常及异常 Hb 与遗传性贫血之间关系的重视 近年来 由于生化技术和分子生物学技 术的不断发展 相继发现和鉴定了许多新型异常的 Hb 电泳技术作为分离与鉴定 Hb 最简 便 准确的方法之一 广泛用于临床遗传性贫血 如地中海贫血 异常血红蛋白病等疾病 的临床诊治 1 概述概述 Hb 的主要生理功能是将氧气从肺部运送到组织 同时将组织释放的二氧化碳带回到肺 部完成氧气和二氧化碳的交换 Hb 是由珠蛋白和亚铁血红素连接成的一种结合蛋白质 每 一个 Hb 是由 4 个多肽链组成 而每一肽链又和一个铁卟啉结合 和血红素连接的珠蛋白 是一种组蛋白 每一个珠蛋白分子由 4 条肽链组成 每一条肽链和一个血红素结合 构成 一个 Hb 单体或称为亚单位 因此 每个 Hb 分子是由 4 个 Hb 单体聚合而成的四聚体 现在已知人类的红细胞中存在 3 种正常的 Hb 即 HbA HbA2 和 HbF 从正常 Hb 中 已发现 链 和 4 种不同肽链 这些 Hb 由均由一对 链和一对非 链组成 正常成人 Hb 的非 链称为 链 而胎儿 Hb 中的非 链称为 链 HbA 含量最多 它由两条 链和两条 链组成 HbA2 占 3 由两条 链和两条 链组成 HbF 正 常含量是 Hb 的 2 由两条 链和两条 链组成 除 HbA HbA2 和 HbF 外其他的各种 Hb 常被称为异常 Hb 全世界目前已报道的异常 Hb 达 450 余种 而且每年还有新的发现 如美国最常见的两种 Hb 变异体是 HbS 和 HbC 而 Hb Lepore HbE HbA2 G philadelphia 等几类很少见 现已证实这些异常 Hb 的不同之处不在于亚铁血红素部分 而在于珠蛋白部分化学结构的差异 主要类型有 肽链中氨基酸的顺序略有差异 此类型最为多见 约占 90 如 HbS HbA HbS 是由于 2 2 2 2S HbC HbA HbC 是由于 2 2 2 2C 各肽链的重新组合或某 些正常肽链的缺失 如 HbH HbA HbH 是由于 2 2 4 Hb Bart s HbA Hb Bart s 是由于 2 2 4 Hb 肽链的融合 如 Hb Lepore 是 链的一半 N 端 与 链的一端 C 端 融合而成 肽链中氨基酸增多 可在中间嵌入或在 C 端延长 等 以前发现的 Hb 皆以英文字母命名 由 A Q B 除外 加上 S 随着新发现的 Hb 越来越 多 字母不够用 现规定从 Q 以后的字母不能再用以命名 而以发现地或实验室命名 临床实验室常用的分离和鉴定 Hb 的方法有醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电 泳 柱层析和一些有关的化学试验 地中海贫血是一种常染色体显性遗传病 是我国南方 最常见和危害最大的遗传病之一 应用电泳法鉴别患者血液中 Hb 的类型及含量对于贫血类 型的临床诊断及治疗具有重大意义 全自动电泳分析系统的引进将为临床诊断地中海贫血 及异常 Hb 病提供准确的实验室方法和依据 近年来分子生物学技术已用于因异常 Hb 引起 的遗传性疾病的基因诊断中 2 4 I 1 2 Hb 电泳电泳 2 1 原理原理 Hb 的分离和鉴定方法很多 其中以电泳法最为常用且最为重要 很多异常 Hb 都是首先用电泳法发现的 其原理是 Hb 中的珠蛋白和其他蛋白质一样为两性电解质 在不同的缓冲液中可带正或负电荷 在电场中向阴极或阳极移动 由于不同的蛋白质之间 正常 Hb 与异常 Hb 其等电点 分子大小 形状及所带电荷的不同 其移动速率不同 电泳迁移率不同 在一定的支持介质中可借以分离 不同的电泳方法具有不同的电场强 度 pH 缓冲液或支持物 2 2 常用方法常用方法 最常用的方法是碱性缓冲液电泳 早期用醋纤膜作为支持介质 在碱 性环境下 pH8 4 8 6 可快速分离 HbA HbA2 和 HbF 及其他多种变异体 可是不能将 HbS 与 HbD 和 HbG 分开 因为后 3 种 Hb 在这一电泳系统中具有相同的迁移率 同样 在碱性条件下 HbC HbE HbO 与 HbA2 也有相同的迁移率 1976 年美国疾病预防与控 制中心 CDC 和美国临床实验室标准化委员会 NCCLS 曾推荐用醋酸纤维素薄膜电泳 Helena 实验室的方法与之基本相同 作为异常 Hb 检测的初级试验 现多用分辨率更高 的琼脂糖凝胶进行电泳分析 而酸性缓冲液 pH6 0 6 2 电泳可用来分离那些在碱性缓冲 液电泳中不能分离开的 Hb 如 HbS 及 HbC 在此酸性条件下 HbD HbO 或 HbE 与 HbS 及 HbC 可明显的分开 电泳后 Hb 可用丽春红 S 酸蓝或氨基黑 10B 进行染色 将电 泳区带与已知的对照比较 并用光密度计进行扫描定量 对于一些特殊的 Hb 如 HbS HbA2 HbF 和不稳定 Hb 如 HbM HbH HbE 等 可分别采用溶解度试验 柱层 析法 碱变性法 Singer 法 及不稳定试验 异丙醇试验 进行鉴定 珠蛋白链电泳 等 电聚焦和氨基酸序列分析可用来证实稀有的 Hb 存在 多用于研究 目前已有多种自动化 电泳分析仪可应用于临床常规 Hb 电泳 如 Helena 公司的 REP SPIEF 等型号 Sieba 公 司的 HYDRASYS 其中碱性缓冲液电泳为常用筛选方法 2 3 电泳结果电泳结果 2 3 1 碱性缓冲液电泳碱性缓冲液电泳 在碱性缓冲液中所有 Hb 均向阳极移动 其移动顺序为 HbH HbA3 HbA1 HbF HbS HbD HbG HbC HbA2 HbC HbE HbO CA1 CA2 CA1 为 碳酸酐酶 1 CA2 碳酸酐酶 2 正常人可见 4 条区带 HbA HbA2 CA1 CA2 若用联苯 胺染色 CA1 与 CA2 则不显色 在点样处有一条蛋白带 它是非 Hb 成分 为细胞基质 和膜蛋白 2 3 2 酸性缓冲液电泳酸性缓冲液电泳 在酸性缓冲液中 HbA HbD HbE 和 HbG 向阴极移动 而 HbF 比它们更靠近阴极 HbC 向阳极移动得最快 HbS 也向阳极移动 但比较接近点样点 2 3 3 结果报告结果报告 有两种报告方式 定性 将染色后的电泳胶片用质控胶片对比即可 判断胶片有无 Hb 定量 染色后的电泳胶片用光密度计扫描 报告各条带的百分比值 各区带参考值 根据不同年龄有不同的范围 例 正常成人 Hb A F 94 5 98 5 HbA2 2 5 3 5 新生儿 1 个月 HbA 12 40 HbF 6 93 HbA2 0 1 1 0 婴儿 3 个月 HbA 1 00 65 00 HbF34 3 82 95 HbA2 0 04 2 3 4 婴儿 6 个月 HbA 86 98 HbF 0 84 10 7 HbA2 0 87 2 9 I 2 3 临床意义临床意义 足月的初生婴儿血液中的约 70 80 的 Hb 为 HbF 同时也存在少量的 HbA 和 HbA2 不久 HbF 浓度迅速下降 同时 HbA 相应增加 绝大多数于出生后 6 个月至 2 年后 HbF 降至成人的正常水平 HbA2 增高是 轻型地中海贫血的一个重要特征 HbA2 减低 见于缺铁性贫血及其它 Hb 合成障碍性疾病 常见如 地中海贫血 电泳发现异常 Hb 如 HbH Hb Bart s HbC S HbK 等则可确诊为相应的 Hb 分子病 据广东省人民医院资 料统计 该院一年所做 Hb 电泳 5800 人次 所有产前检查及贫血待查病人 共检出地中 海贫血和异常 Hb 病患者 1375 人 阳性率 23 7 其中 1 地中海贫血基因携带者 HbH 病患者 PCR 确诊 地中海贫血 新生儿 Hb Bart s 区带者 1018 人 阳性率 17 6 2 地中海贫血基因携带者 327 人 阳性率 5 6 3 异常 HbJ HbK HbN HbG HbD 和 HbE 共 30 人占总人数 0 52 3 1 地中海贫血地中海贫血 是由于珠蛋白基因缺失或突变 导致 珠蛋白肽链合成障碍所致 我国多数是 珠蛋白基因缺失 3 1 1 静止型静止型 地中海贫血地中海贫血 无临床症状 体征 无贫血 红细胞形态正常 HbA2 和 HbF 正常 新生儿期可出现 1 3 Hb Bart s 出生后 3 个月消失 父母任一方有 地 中海贫血 3 1 2 标准型轻型标准型轻型 患者无症状 呈轻型小细胞低色素性贫血 有轻度红细胞形态改变 HbA2 含量为正常低限 1 5 2 5 约 1 4 1 HbF 正常 新生儿期 Hb Bart 可达 5 8 6 个月完全消失 父母任一方有 地中海贫血 3 1 3 HbH 病病 临床表现有轻 中度贫血 2 3 以上病例有肝脾肿大 常反复出现黄 疸 在妊娠 感染及使用氧化剂时 Hb 显著下降 父母双方常有 地中海贫血 实验室 检查 有溶血性贫血的特征 骨髓中红细胞系统增生极度活跃 HbH 明显增高 2 5 40 HbA2 及 HbF 含量正常 Hb 电泳可出现 HbH 区带 红细胞渗透脆性试验 降低 红细胞包涵体阳性 3 1 4 Hb Bart s 胎儿水肿综合征胎儿水肿综合征 临床表现 该病为 地中海贫血中最严重者 胎 儿常于妊娠后期死亡或早产 胎儿生下时 全身水肿 皮肤苍白 黄疸 肝脾肿大 常于 产后数小时内死亡 父母双方均有 HbH 病或标准型 地中海贫血 实验室检查 有溶血 性贫血的特征 骨髓红系增生活跃 红细胞形态靶形红细胞明显增多 外周血可见有核红 细胞 Hb 电泳 Hb Bart 成分 80 抗碱 Hb 增加 出现少量 Hb Portland 或少量 HbH 3 2 地中海贫血地中海贫血 是由于 珠蛋白链合成减少或完全不能合成所致 完全不能合成 珠蛋白链的地贫 基因称为 0 合成减少的称为 3 2 1 重型重型 临床表现 又称库利氏贫血 Cooleyanlsnua 患者症状严重 多在儿童期 夭折 少数症状较轻 可活至成年 此型又常称为中间型 库利氏贫血在婴儿期 6 9 个月 开始出现贫血 黄疸 肝脾肿大 儿童患者发育不良 智力迟钝 骨骼改变如颧骨隆起 眼距增宽 鼻梁低平 线可见外板骨小梁条纹清晰呈直立的毛发样等 多在幼儿时死于 4 4 重度贫血或感染 若能生长超过 10 岁 可出现个体矮小 性功能 甲状腺及甲状旁腺等功 能低下 可继发血色病 出现心律系乱 心力衰竭 肝硬化 糖尿病等 父母常均有轻型 地中海贫血 实验室检查 Hb30 3 2 2 轻型轻型 临床表现 无症状或有轻度分血症状 肝脾无肿大或轻度肿大 父母一方 为 地中海贫血杂合子 实验室检查 Hb 稍降低或正常 外周血少量靶形细细胞 HbA1 3 5 HbF 轻度增加 不超过 5 3 2 3 中间型中间型 临床表现 症状和体征介于重型和轻型 地中海贫血之间 实验室检 查 同重型 地中海贫血 遗传学 父或母均为 地中海贫血杂合子状态 根据临床表现 小细胞低色素性贫血 Hb 电泳及 HbF HbA2 含量测定有家族史 一般不难作出诊断 3 3 异常异常 Hb 病病 异常 Hb 病指因正常成人 HbA 的产生受到部分或完全的抑制 被另一种或几种异常 的 Hb 部分或完全取代而产生的病症 例如 HbS 和 HbC 等常与溶血性贫血 镰状红细胞或 靶形红细胞等特征联系在一起 实际上 某些异常 Hb 的存在 并不引起生理上的任何特 征 也并不是所有异常 Hb 携带者都有特殊的临床表现 有些异常 Hb 携带者 可以终生健 康地生活 仅在居民普查或因其它疾病就医时才被发现 当然 这些 Hb 变异体仍有其生 物化学 遗传学及人类学意义 那些有临床意义的异常 Hb 涉及到预防 治疗等一系列问 题 早期发现的一些 Hb 变异体 如 Hb 等 多出现在溶血性贫血患者身上 现在看来 有一些可能伴有地中海贫血 镰状细胞贫血是由纯合子 HbS 引起的是一种很严 重且致命的疾患 患婴多在 5 6 个月时就会出现临床症状 如疼痛 发热 并随着病情的 恶化而加重