第二章-柱色谱...ppt

1 柱色谱 2 一概述 1906年时由俄国植物学家M Tswett首先提出 3 在荣获诺贝尔科学奖 主要是化学奖和生理学医学奖 的科学家中 至少有20多位得益于这种分析手段 奥地利化学家库恩 R Kuhn 因对胡萝卜素和维生素的出色研究获得了1938年的诺贝尔化学奖 英国化学家马丁 A Martin 及辛格 R Synge 因发明分配色谱法获得1952年的诺贝尔化学奖 马丁辛格 4 二分类 1 按固定相所处的状态分类 柱色谱 ColumnChromatography 纸色谱 PaperChromatography 薄层色谱 ThinLayerChromatography 5 二分类 柱色谱 ColumnChromatography 一类是固定相装在玻璃或金属管内 叫 填充柱色谱 一类是固定相吸附在一根细管内壁上 管子中心是空的 叫 开管色谱柱 或习称 毛细管色谱 如果把固定相装在玻璃管内 再拉成毛细管 就叫 填充毛细管柱 6 二分类 2 按分离机理分类 吸附色谱 AdsorptionChromatography 分配色谱 PartitionChromatography 离子交换色谱 IonExchangeChromatography 凝胶色谱 GelChromatography 7 三吸附色谱 吸附色谱体系是由吸附剂 溶剂和试样三者构成的 试样在吸附剂和洗脱剂作用下 反复地在柱中进行吸附 解吸 从而继续用洗脱剂连续展开 由于在两相吸附能力的差异 顺次从柱中流出而得到分离 吸附色谱基本原理 8 9 在吸附层析中 为要提高分离效果 必须充分考虑试样 洗脱剂和吸附剂三者关系 它们三者的关系如下图 10 吸附色谱三要素 1 吸附剂 adsorbents 对吸附剂的基本要求是 具有适度的活性较大的比表面积 与洗脱剂及被分离物质不起化学反应 不溶于洗脱剂中 要有一定的均匀粒度 11 吸附色谱三要素 吸附剂 氧化铝 alumina 氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对 氧化铝的活性与含水量有关 含水量越低 活性越大 吸附力越强 无水氧化铝吸附活性特别强 根据氧化铝的含水量可将氧化铝的活性分为五级 12 吸附色谱三要素 氧化铝 13 吸附色谱三要素 吸附剂 酸性氧化铝 pH5 4 适用于分离酸性化合物和对酸稳定的中性化合物 如酚类物质和某些氨基酸类等 中性氧化铝 pH 7 5 适用与分离生物碱 挥发油 萜类 甾类 蒽醌以及在酸碱中不稳定甙类 酯 内酯等化合物 凡是能用酸性或碱性氧化铝层析分离的物质 中性氧化铝也都适用 碱性氧化铝 pH9 10 适用于碱性 如生物碱和中性化合物的分离 14 吸附色谱三要素 吸附剂 硅胶 silicagel 它的吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢键的羟基 羟基有结合型 活性型 和游离型 三种 15 它们可以与试样和洗脱剂分子中的极性基团或不饱和键产生氢键缔合而起吸附作用 其吸附性强弱为 16 如果将硅胶在200 以上长时间强热后 则硅原子上结合的羟基发生脱水而形成硅氧烷型 这种不含羟基的硅氧烷型的硅胶吸附性极差 活性羟基在硅胶表面较小的孔穴中较多 水与硅胶表面的羟基形成水合硅醇 使其失去活性 因此需加热除去水分 最佳活化条件为105C 110C 加热30分钟 17 吸附色谱三要素 吸附剂 硅胶 通常视为酸性吸附剂 一般用来分离一些酸性和中性有机物 如有机酸 萜类 氨基酸 甾类和一些甙类 但是 对某些酸性弱的试样 在色层中有分解的危险 此外 对于碱性物质可发生不可逆吸附 因此 对一些碱性物质在使用硅胶进行层析时 有必要进行预实验 如在硅胶中拌入15 左右的硝酸银 这种加硝酸银的硅胶对有机物中不饱和键有特殊的吸附性 因此 常用它分离一些不饱和化合物 吸附在硅胶上的银离子与不饱和键之间发生了电子转移形成可络合物 18 吸附色谱三要素 吸附剂 活性炭 activecarbon 活性炭是使用较多的一种非极性吸附剂 活性炭的吸附性主要是由范德华力所引起 它的特点是对非极性物质 尤其是对芳香族化合物吸附性特别强 它可以在如水溶液那样强的极性溶剂中 吸附弱极性的有机化合物 此外 活性炭还具有分子筛的性能 19 吸附色谱三要素 吸附剂 活性炭主要用于分离水溶液成分 如氨基酸 糖类及某些甙类 由于它在水溶液中对有机物吸附性特别强 在有机溶剂中则较弱 故水的洗脱能力最弱 而有机溶剂洗脱能力则较强 例如 用乙醇和水的混合溶剂进行洗脱时 则随乙醇浓度的递增而洗脱能力增强 又由于活性炭对芳香族化合物的吸附性大于脂肪族化合物 对大分子化合物的吸附性大于小分子化合物 因此 利用这些吸附性的差别 可将水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物分开 单糖与多糖分开 氨基酸与多肽分开 20 吸附色谱三要素 吸附剂 硅藻土 celite 硅藻土是由硅藻的硅质细胞壁组成的一种生物化学沉积岩 是一种吸附性非常弱的吸附剂 一般用在分离极性特别强的化合物和高度不饱和化合物等层析方面 也经常作助滤剂用 将它与别的吸附剂混合使用 能使溶液容易流过 此外 在柱层析中 可以将试样溶液与硅藻土拌合 风干后再加入柱中 21 吸附色谱三要素 吸附剂 聚酰胺 polyamide 聚酰胺的吸附性是由于分子中含有许多酰胺基 在水溶液中能与酚羟基发生氢键缔合而吸附 因此 聚酰胺是分离酚性物质和蒽醌及其甙类最有效的吸附剂 要从聚酰胺柱上洗脱被吸附的酚性物质 是用一种溶剂分子顶替被吸附的酚性化合物 溶剂这种解吸性质的强弱 一般是按下列顺序增强 水 乙醇 甲醇 丙酮 氯仿 稀氨水或稀氢氧化钠水液 甲酰胺 22 吸附色谱三要素 洗脱剂 洗脱过程 流动相与被分离分子竞争占据吸附剂表局面活性中心的过程 23 吸附色谱三要素 洗脱剂 2 溶剂 洗脱剂 在层析中 如采用氧化铝或硅胶为吸附剂 则所用的溶剂应先从极性低的 对吸附剂亲和力小的 开始 以后逐渐增加极性大的溶剂 常用的流动相按其极性增强顺序排列 石油醚 环己烷 二硫化碳 四氯化碳 三氯乙烯 苯 甲苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 乙酸甲酯 丙酮 正丙醇 乙醇 甲醇 吡啶 酸 24 吸附色谱三要素 洗脱剂 在实际操作中 使用混合溶剂作为洗脱剂 一般要比单独使用一种溶剂为洗脱剂的时候多些 因为混合溶剂往往能起到单一溶剂所不能起到的微妙分离效果 但在使用时要绝对避免用两个极端洗脱力的混合剂 这是因为洗脱力强的溶剂发生溶剂化效应 从而降低混合溶剂的作用 达不到理想的分离效果 25 吸附色谱三要素 洗脱剂 一般来说 弱极性溶剂体系的基本两相由正己烷和水组成 再根据需要加入甲醇 乙醇 乙酸乙酯来调节溶剂系统的极性 以达到好的分离效果 适合于生物碱 黄酮 萜类等的分离 中等极性的溶剂体系由氯仿和水基本两相组成 由甲醇 乙醇 乙酸乙酯等来调节 适合于蒽醌 香豆素 以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离 强极性溶剂 由正丁醇和水组成 也靠甲醇 乙醇 乙酸乙酯等来调节 适合于极性很大的生物碱类化合物的分离 26 吸附色谱三要素 洗脱剂 层析时 如被分离的物质含有羧基或氨基等极性强的官能团 容易发生色带扩散和拖尾现象 为了防止这种现象达到有效分离 在分离含有羧基的试样时 可加少量的醋酸 在分离含有氨基试样时 可加少量的氨水 吡啶 二已胺等溶剂 以控制它们的解离 消除拖尾 提高层析效能 27 吸附色谱三要素 试样 3试样成分的性质在给定的条件下 各个成分的分离情况 与被分离物质的结构和性质有关 对极性吸附剂而言 被分离物质的极性越大 两者吸附作用也越强 具有极性基团的化合物 其吸附能力按下列顺序增加 Cl Br I C C OCH3 CO2R C O CHO SH NH2 OH CO2H 溶解试样用的溶剂 极性应与流动相接近 28 四 分配色谱 分配色谱基本原理 分配层析法是利用混合物的各个组分 在互不相溶的溶剂中的分配系数不同 而进行分离和纯化物质的一种层析方法 29 分配层析是将两相溶剂中的一相 固定在某一种不起吸附作用的固体物质上 如硅藻土 纤维素 含水硅胶 无吸附性 等 称此为支持剂或担体 被支持剂固定的溶剂 如水等称为固定相 将含有固定相的支持体填充在层析柱中 然后加入与固定相不相混溶的另一溶剂 称为流动相 来冲洗层析柱 当流动相流经支持剂时 即与其中的固定相接触 四 分配色谱 30 分配色谱三要素 支持剂和固定相 1 支持剂和固定相 做为分配层析保持液体固定相的支持剂应具备如下条件 1 中性多孔 表面积大并无吸附作用固体粉末 不溶于层析时所用的溶剂中 2 能保持一定量的固定相 并使流动相能自由通过 并不改变其组成 3 保持固定相的量应尽量多 最好能达到支持剂重量的50 以上 31 纤维素 含水量可达25 层析用纤维素可分两种 即天然纤维素和微晶纤维素 纤维素上有许多羟基 易与水形成氢键而将水吸附 这种吸附着的水分形成分配柱层析中的固定相 硅藻土 系天然存在的非晶形硅胶 其中除SiO2外还含Al2O3 Fe2O3 CaO Na2O和有机物及水分等 可吸收其重量的100 的水 需经净制才能供层析用 净制步骤包括淘洗 干燥 灼烧 硅胶 在分配柱层析中用作担体的硅胶应在较低温度下活化 使其表面残留一定量的水分作固定相 其含水量可达50 以上 分配色谱三要素 支持剂和固定相 32 分配色谱三要素 洗脱剂 2溶剂 洗脱剂 一般是根据分配层析所使用的固定相和欲分离化合物的性质来选择溶剂 在分配层析中通常是用水为固定相 选用与水不混溶的溶剂作为流动相 在实际操作中多用混合溶剂作为洗脱剂 使用时可调整溶剂系统的组成和各组分的比例 以获得理想的溶剂系统 并加入醋酸 氨水等弱酸 弱碱 以防止某些被分离组分的离解 33 分配色谱三要素 被分离物质 3被分离物质的性质 一般来说 亲水性强或极性大的成分在亲水性分配层析中 保留时间长 Rf值小 流出层析柱慢 如果亲脂性较强的成分应用一般亲水性分配层析不易分离时 可考虑改用非水性分配层析法 这时用甲酰胺等代替水为固定相 效果可能得到改善 如果亲脂性很强的成分 如高级脂肪酸 油脂等 则应考虑采用反相层析 Reversephaseliquidchromotography 即以石蜡油等代替水为固定相 用醇类作为流动相进行层析 34 五 吸附层析与分配层析的比较 从上述内容可见 分配层析与吸附层析在原理上是不同的 可以认为分配层析几乎没有吸附现象 但是两种层析在操作上是相似的 在分离物质时究竟选用哪一种方法适宜 这要由被分离物质的性质来决定 一般来说 对于分离极性强的亲水性物质 适宜用以水作为固定相的分配层析法 对于极性不大的脂溶性物质 适宜用吸附层析法 但是 改进层析技术和固定相及溶剂 两者也可以通用 如欲用分配层析分离脂溶性较强的物质 可改用液体石蜡油或凡士林的苯溶液代替水作为固定相 用亲水性较强的溶剂作为流动相 进行反相层析 也可以达到较好的分离效果 35 六 柱层析操作 装柱干法装柱湿法装柱 加样 洗脱与分离 36 柱色谱分离特点 柱色谱分离与薄层色谱类似 是靠洗脱剂把分离的各组分逐个洗脱下来的过程 故也称洗脱色谱 由于色谱柱填充的吸附剂的量远远大于薄层板 因而柱色谱可用于分离量比较大 克数量级 的物质 所以作为较大量样品的制备分离 柱色谱优于薄层色谱 37 吸附柱色谱分离原理 利用欲分离的混合物中各组分分配在固定相和洗脱剂之间 被吸附的性质不同 而相互得以分离 化合物被吸附作用越强 该化合物溶解在洗脱剂中越少 沿洗脱剂移动的距离则越小 反之 越多 38 常压柱色谱 装柱 上样 洗脱 合并 39 1 装柱 所用吸附固定相一般为硅胶 氧化铝 粒度要求100 160目或160目以上 吸附剂粒度越小 分离度越大 但洗脱速度越慢 Rf值相差较大时 应用硅胶100 160目 可上样30mg g硅胶 更多的情况下硅胶量为10mg g硅胶 即分离1g样品需要100g硅胶 应用氧化铝时 粒度要求100 150目 分离1g样品需要20 50g氧化铝 40 1 干法装柱在柱子上端放一漏斗 直接加入硅胶 轻轻敲打层析柱 或上下震动层析柱 使填装均匀 再加一层石英砂 然后加入洗脱剂 使硅胶润湿 必要时加压或减压以除去气泡 加速溶剂化速度 41 2 湿法装柱将吸附剂硅胶与一定量溶剂调成悬浆状 快速倒入柱管中 打开活塞 使溶剂慢慢流出 吸附剂慢慢下降而均匀沉入色谱柱底 吸附剂填料完毕 一般再覆盖0 5cm厚的石英砂 42 2 上样 1 样品能被流动相溶解 将其中极性溶剂尽可能的用旋转蒸发仪去除后 加入少许流动相稀释 待将吸附剂上面的多余洗脱剂放出 直到柱内液体表面降至石英砂表面时 停止放出洗脱剂 将样品用滴管或漏斗沿柱子内壁直接加入柱中 样品稀释要尽可能用少的洗脱剂 然后用最少量洗脱剂洗涤器皿与层析柱内壁 洗涤完毕 开放活塞 使液体渐渐放出 液面降至石英砂下端时 再加入流动相洗脱 43 2 样品不能被流动相溶解 可选择极性大的溶剂溶解 如氯仿 丙酮 乙醇 甲醇 四氢呋喃 吡啶 免用DMSO DMF沸点较高溶剂 再加入适量的硅胶于溶剂中 一份样品 约5份柱填料 用旋转蒸发仪减压蒸去溶剂至干 让样品均匀地涂布在固定相表面上 然后通过漏斗装于柱子上端 旋转蒸发时 一定要加防爆球 以防样品硅胶爆沸 44 3 洗脱 1 洗脱剂的选择应以TLC检测为依据 被分离物质的最佳Rf值应在0 2 0 5内 被分离的2个点之间 Rf值应尽可能的大 越大越好 2 洗脱剂应不断加入 保持一定高度 3 洗脱液收集洗脱液采用等份法收集 4 控制洗脱液流出速度 不能太快 一般以1 2滴 秒为宜 45 4 合并洗脱液按编号TLC点样展开 将Rf值相同者合并 浓缩 最后进一步纯化 46 注意 1 吸附剂表面应尽量平整 并水平 2 吸附剂充填时必须非常均匀 不可出现空气泡 隙缝等 3 样品层应尽量薄 47 干柱色谱 是指用填充剂干装成柱 然后进行层析分离的一种方法 实际上是制备薄层的一种改进 即由薄层板改为柱状 采用塑料薄膜或玻璃柱 将吸附剂填充到塑料薄膜柱中 把欲分离混合物置于柱子顶端 加展开剂展开 当展开剂到达柱底部时即完成分离 用小刀沿着分离部位将柱子切开或将吸附剂推出 从分段的吸附剂中用溶剂提取所需的化合物 48 1 吸附剂 常用氧化铝或硅胶为吸附剂 一般干柱层析吸附剂粒度200 300目较好 硅胶 干柱色谱样品与吸附剂比例1 300 1 500 2 装柱 与一般柱层析一样 49 3 上样与展开 将混合物溶于展开剂中 或将样品溶于溶剂中 加入5倍量的吸附剂 在旋转蒸发仪上蒸干后 均匀地加载于柱子上端 上面再覆盖少量石英砂 加入展开剂 使柱的顶端保持有3 5厘米厚的液面 展开时展到柱子底端即可 然后去除色谱柱支撑物 50 4检查与分离 按色带或紫外下的色带用小刀将柱子切开 将各段吸附剂分别放在索氏提取器中 溶剂提取 51 快速柱色谱 快速柱色谱可克服普通柱分离的缺陷 它具有快速省时 分离效率高 简单易行的优点 对于0 01 10g的样品 Rf值 0 15的情况下 在10 15分钟可快速得到分离 52 1 装柱 上样同常压柱色谱 53 快速柱色谱的条件与步骤 1 选用对欲分离成分在TLC板上有较好的分离效能的洗脱剂 Rf值 0 35 Rf 0 15 2 选择合适的层析柱 内装粒度230 400目的硅胶 高度5 6inch 3 加入洗脱剂 在压力下快速将硅胶中空气排除 4 上样后 加洗脱剂洗脱 控制 压力 流速2 0in min 约5cm min 54 利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从而很好的分离样品的色谱技术 具有快速 简易 高效 价廉等优点 减压柱色谱 55 1 装柱将吸附剂装入漏斗或短柱中 轻轻拍紧或减压拍打或从顶端挤压 直至吸附剂紧密 最后变得坚硬 吸附剂的高度一般不超过5cm 对于微量分离 样品 100mg 可采用直径为0 5 1cm色谱柱或漏斗 吸附剂高度为5cm 一般固定相用量为10 15 1倍 加大吸附剂与样品比例 可提高分离度 56 2 上样放掉真空后 常压下加入低极性溶剂于吸附剂表面上 减压使溶剂均匀流过吸附剂 如有空隙 需要重装 使柱子抽干后 重复1 2次 即可准备上样 用低极性溶剂或洗脱剂 如石油醚 正己烷 溶解样品 常压下小心加入柱顶端 再加入洗脱剂或溶剂覆盖吸附剂表面 慢慢减压 使样品在柱顶端形成样品层 可也采用固体上样法 即先将样品溶于极性溶剂 加入5 10份吸附剂 旋转蒸发至干后 加到吸附剂的表面上 然后进行洗脱 57 3 洗脱与收集一般先用极性较小溶剂 然后逐渐加大极性 极性溶剂的增加开始要缓慢 然后增加的幅度可逐渐增大 在常压下 加入溶剂后 将柱抽干 收集为一个流分 抽干后再更换溶剂和容器 重复以上操作 并用TLC跟踪每一个流分的分离情况 通常收集20 25个流分可将所有成分洗脱 58 七 应用 1 层析技术在中药化学中的应用 如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素 分别称为丹参酮 但以后进一步的研究 发现除丹参酮 为纯品外 均为混合结晶 此后通过各种层析方法 迄今已发现15种单体 其中有4种为我国首次发现 59 七 应用 如对于C 27甾体皂甙元类成分 能因其分子中羟基数目的多少而获得分离 将混合皂甙元溶于含有5 氯仿的苯中 加于氧化铝的吸附柱上 采用溶剂进行梯度洗脱 如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝 由于硅酸镁的吸附性较弱 洗脱剂的极牲需相应降低 亦即采用苯或含5 氯仿的苯 即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来 60 七 应用 2 在食品生产中的应用 卵磷脂可以促进脂肪代谢 防止出现脂肪肝 具有抗衰老功能 可促进神经传导 提高大脑记忆力 即卵磷脂的药用价值越来