成骨诱导后骨髓间充质干细胞与AWMGC支架材料联合培养的实验研究

成骨诱导后骨髓间充质干细胞与成骨诱导后骨髓间充质干细胞与AWMGCAWMGC支架材料联合培养的支架材料联合培养的 实验研究实验研究 辽 孝 压 学 院 恐 成骨诱导后骨髓间充质干细胞与 支架材 联合培养的实验研究王岩松 刘 平 周大利 梅晰凡 辽宁医学院附属第一医院急诊科 辽宁医 学院附属第一医院骨外科 辽宁锦州 四川大学 材 科学与工程学院 四川成都 摘要目的研究多孔磁 性硅灰石 磷灰石玻璃陶瓷载体 支架 作为组织工程骨支架的可 性 方法体外培养兔骨髓间充质干细胞 在成骨诱导剂地塞米松等的诱 导下 向成骨细胞转化 并使之与修饰后 支架复合 通过倒王相差显微镜和扫描电子显徼镜观察细 胞贴附情况 结果地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化 碱性磷酸酶表 述明显增高 并表达 型胶原 支架具有合适的微孔结构 材 大孔孔径为 舭 且孔道相互贯通 体外复合培养 小时 成骨细胞 即开始贴附于支架上 复合培养 天 成骨细胞在支架上分化增殖 分泌细胞外基质 结论适当浓度成骨诱导剂可成功的将兔 成骨细胞诱导 修饰后 支架是骨组织工程的良好栽体 关键词骨髓间充干质细胞 成骨诱导 载体 生物相容性 文献标志码 一 在 脚 岬 骨缺损修复一直是骨科 临床的棘手问题 目前常用的修复方法均存在一定的缺点 难以满 足临床需要 组织工程骨再造被认为是最有前景的骨缺损治疗修复方法 在一定诱导条件下 可使 向成骨细胞分化的数目大大增 加 表明其具有很强的成骨潜能 是应用最为广泛的种子 细胞 细胞与支架材 的相互作用是组织工程研究的主要领域 细胞与材 的粘附是基础 细胞必须与材 发生适当的粘附才能进 迁移 分化 和增殖 单一的材 难以满足骨组织工程细胞外支架材 的要求 只有通过合 适的方法将几种材 组合 在性能上互相取长补短 形成复合支架材 生物活性玻璃陶瓷作为一种硬组织 修复材 具有 想的生物活性和骨重建功能 生物活性玻璃陶瓷植入体内后 表面溶解 释放出硅离子 能 为羟基碳酸磷灰石形成提供合适成核位置 体液中的和溶解产生的 钙离子 磷离子则沉积生成富钙 磷无定形层 并最终转化为能与 组织紧密结合的结晶羟基碳酸磷灰石层 其化学组成和结构均与骨 组织中的矿化相接近 本实验体外培养兔 在成骨诱导剂的诱导下 向成骨细 胞转化 并将其作为种子细胞 为支架材 观察细胞在材 上的生长情况 探索 作为组织工程骨支架的可 性 基金项目国家自然科学基金资助项目 编号 作者简介王岩松 男 辽宁省兴城市人 硕士学位 主要研究方向为骨组织工程研究 通讯作者刘 平 男 辽宁省兴城市人 教授 硕士研 究生导师 主要研究方向为骨组织工程研究 万方数据王岩松 等成骨诱导后骨髓问充质干细胞与 支架材 联合培养的实验研究 实验材 和方法 实验材 与试剂 实验材 孔培养板和 孔培养板 胎牛血清 胰蛋白酶 一 地塞米松 维 生素 一甘油磷酸钠 碱性磷酸酶试剂盒 多聚赖氨酸 载体 由四川大学周大利教授惠赠 型胶原原位杂交 试剂盒 实验动物 月龄健康新西兰大耳白兔 只 由锦州 医学院实验动物中心提供 动物质 许可证号 辽 体重 实验仪器倒置相差显微镜 一 自动酶标分析 仪 培养箱 超净工作台 扫描电子显微镜 实验方法 兔 的分离和培养选 月 龄新西兰白兔 无菌状态下于兔股骨近端抽取骨髓 采用贴 壁筛选法 接种于培养瓶中 小时后 换培养液 每日在倒置相 差显微镜下观察 天换液 次 原代培养的 接近 时 以 胰蛋白酶消化 离心 弃上清 制成细胞悬液 细胞计数 按 瓶接 种 每日在倒置相差显微镜下观察 兔 的成骨诱导及鉴定细胞传至第 代后 进 成骨诱导 实验分诱导组和非诱导组 诱导液为 地塞米松 一甘油磷酸钠和 维生 素 倒置相差显微镜下观察细胞形态变化 分别在适当的时间测 定碱性磷酸酶含 型胶原的表达情况 染色 碱性磷酸酶含 测 胰蛋白酶消化细胞后 细胞计数 以 个 孔的密度接种于 块 孔培养板上 实验分 组诱导组和非诱导组 每组 孔 每 天换液 于第 天分别取出 块培养板 经 一 处 后 冰箱过夜 用酶标分析仪测碱性磷酸 酶含 型胶原的表达检测 胰蛋白酶消化细胞后 细胞计数 以 个 孔的密度接种于 孔培养板 培养板内置预先经多聚赖氨酸防脱片处 的盖玻片 每 天换液 实验分组同前 于第 天应用原位杂交技术检测各组 型胶原的 表达情况 钙结节 染色诱导 天后取出细胞爬片 清洗 次 水溶液浸染 紫外线下处 分钟 蒸馏 水洗 分钟 硫代硫酸钠水溶液处 分钟后自来水洗 分钟 支架材 的生物学特性本实验所用 支架材 由由四川大学周大利教授提供 该材 采用溶胶一凝胶工艺 制备 并通过造孔 成型及热处 等步骤 支架材 为白色块状多孔物质 孔隙率 一 孔 径 孔道相互贯通 支架材 修饰及体外实验设计将 载体环氧乙烷消毒 扫描电镜观察 将载体分别置于 孔培养板中 先后应用无水酒精处 小时 三蒸水处 小时 小时换 水 次 使材 充分湿化 每孔分别加入多聚赖氨酸将材 充分浸泡 小时 吸除多余液体 细 胞培养箱内干燥 将传了 代的成骨诱导的 制成浓度为 个 细胞悬液 接种到装有载体的 孔培养板中 移入 细胞箱培养 小时后 在支架周围小心加入培养液 进 培养 分别于培养第 天和第 天取出 孔板内的载体 洗 次后 戊二醛固定 一 的乙醇梯度脱水 扫描电镜观察 统计学分析采用版本 统计软件进 处 分析 实验数据用 表示 组问比较均采用重复测 的方差分析 结果 原代和传代培养时 的生长情况原代 于 小时开始贴壁 细胞为圆形 小时后细胞形态为较一致的长梭形 纺锤形 核较小 呈椭圆 形 核浆比例小 天细胞集 形成 逐渐增大 集 之间相互靠近 天时集 边缘融合 细胞呈较均一的旋涡状或螺旋状分布 传代 在形态上与原代无明显差别 兔 成骨诱导后形态观察诱导后细胞自第 天可见 部分细胞由长梭形逐渐变成长方形 并逐渐变为多角形 体积较诱 导前增大 多角形细胞比例随着培养时间的延长而逐渐增高 见图 兔 的成骨诱导鉴定 各组碱性磷酸酶活 性检测结果非诱导组碱性磷酸酶有基础表达 但表达 低 随时间略 有增加 地塞米松等诱导组第 天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无 明显差别 随后碱性磷酸酶表达开始随时间的延长而逐渐升高 具有显著性差异 表 成骨诱导组兔骨髓问充质细胞与非诱导组在 同时间点的碱性磷 酸酶比较 疗 成骨诱导组与未诱导组比较 具有显著性差异 各组原位杂交技术检测 型胶原结果成 骨诱导组检测 型胶原结果发现胞浆内可见大 棕黄色颗粒 见图 非诱导组结果为阴性 钙结节 染色结果成骨诱导组 染色可见钙盐沉积区域呈黑色钙结节 见图 非诱导组结果为阴性 未复合细胞 载体的结构观察未复合细胞载体在扫描电镜下观察 放大倍数为 倍时 可见材 呈孔隙均匀分布的网架结构 孔隙 表面光滑 孔隙率为 一 见图 细胞与修饰后 支架复合的形态观察复合兔骨髓间充质细胞后 扫描电 镜下观察细胞在载体表面 万方数据 辽宁医学院学报 月 生长情 况 第 天 放大倍数为 倍 可见椭圆形的 多角形及 规则形的骨髓间充质细胞贴附于复合材 孔隙之问 见图 讨论运用组织工程的方法修复组织缺损是近 来研究的热点 其中 种子细胞的体外培养是研究的重点之一 骨组织工程研究要求有大 的稳定的种子细胞 自体或异体的成骨细 胞往往取材困难 有限 骨髓问充质细胞具有多相分化潜能 且分 化是非定向的 但己经分化的间充质干细胞仍具有转化成其它类型 间充质细胞的潜能 因而 在一定诱导条件下 可使其向成 骨细胞分化的数目增加 表明 具有很强的成骨潜能骨髓 间充质细胞 向成骨细胞诱导的条件已经非常成熟 在培养基中加入地塞米松 一甘油磷酸钠 维生素 就可以使之向成骨细胞分化 已有研究将 种植于可释放地塞米松和维生素 的支架 并植入裸鼠体内 在体内形成矿化的骨组织一 本实验中观察到地塞米松等诱导组细胞形态向类成骨细胞转化 自 诱导第 天可见部分细胞由长梭形逐渐变成长方形 并逐渐变为多 角形 细胞饱满 多角形细胞比例高 部分区域细胞呈现漩涡状分 布 第 天时碱性磷酸酶表达与非诱导组无明显差别 随后碱性磷酸酶 表达开始随时间的延长而逐渐升高 与非诱导组相比较有统计学意 义 原位杂交检测 型胶原结果发现胞浆内可见大 棕黄色颗粒 染色可见钙盐沉积区域呈黑色 对照组为阴性反 应 作为多孔型骨修复材 孔径 孔隙率及内部连通性是骨长入方式和 数 的决定因素 研究认为 脚孔隙率超过 以后 孔隙之间能够相互贯通 孔 隙率越高越利于新骨长入 但孔隙率越高 多孔材 的强度显著降低 本实验采用的 支架孔隙率在 既使孔隙相贯通 又满 足了临床应用对 学性能的要求 此外 材 孑 隙大小应满足骨单位和骨细胞生长所需空间 一般情况下 孔尺寸在 时最有利于新骨生长 支架中 的微观孔隙与 的宏观孔隙相结合 孔道联结贯通 孔隙结构适度 符合作为构建组织工程骨细胞支架材 的基本要求 成骨诱导细胞与修饰后 支架复合可见材 呈孑 隙均匀分布的网架结构 孔隙表面 光滑 孔隙率为 一 椭圆形的 多角形及 规则形的 贴附于复合材 孔隙之间 细胞充分伸展 向四周伸出伪足 分泌的细胞外间充质包绕于细 胞周围 本实验应用的 生物活性玻璃陶瓷多孔支架材 是一种新型的生物复合载 体 具有良好的生物活性 合适的 学性能和孔结构 实验中证实细 胞在其上贴附生长良好 是优良的骨组织工程支架材 以后 我们将在此研究的基础上 把成骨诱导的细胞与 支架复合植入动物骨缺损模型 观察 支架体内降解性能及成骨情况 为生产可用于临床的组织 工程化活性骨奠定基础 此文图 一 见附页 参考文献 一 日 啪 几 蛐 一 一 心口 口竺 万方数据 墨 亏 压 学 鲰 附页 文见第 页 图 培养的第 代 文见第 页图 兔骨髓间质干细胞成骨诱导第 天 部分细胞由长梭形逐渐变为多角形 图 术后 组脊髓内 阳性细胞较 多 图 成骨诱导组检测 型胶原阳性结果 加 图 未复合细胞载体的扫描电镜图 放大倍数为 倍文见第 页圈 培养 代细胞逐渐伸展为梭形 三角形 多角形 胞 体较原代略膨大 有胞浆突起 成旋涡或平 状排列 图 术后 组脊髓内 阳性细胞较少 图 成骨诱导组 染色可见钙盐沉积区域 呈黑色 图 复合兔骨髓间充质细胞后 细胞在载体表面生 长情况扫描电镜图 第 天 放大倍数为 倍图 特异性表面标志物 万方数据附页 辽宁医学院学报 月 图 代 抗原表达 图 代免疫组化显 示 几乎无阳性 抗原表达 为阴性 对照 为 为胶质细胞 表达 阳性对照 为 的 表达 为 各 代 表达方差分析表达 和传代数无明显区别 文见第 页文见第 页图 腰椎滑脱图 的 表达图 术后 个月时异种神经基质膜管修复情况缝合处愈合良好 吻合口光滑 未见有神经瘸形成 也未与周围组织有粘连情况围 腰椎滑脱术后 个月图 异种神经基质膜管组纵切 染色 大 再生 神经纤维通过移植段 排列紧密整齐 神经纤维中可见血管新生 万方数据成骨诱导后骨髓间充质干细胞与A WMGC支架材料联合培养的实验研究作者王岩松 刘丹平 周大利 梅晰凡 WANG Yansong LIU Danping ZHOU Dali MEI Xifan王岩松 WANG Yansong 辽宁医学院附属第一医院急诊科 刘丹平 梅晰凡 LIUDan ping MEI Xifan 辽宁医学院附属第一医院骨外科 辽宁 锦州 121001 周大 利 ZHOUDali 四川大学材料科学与工程学院 四川 成都 610064 刊 名辽宁医学院学报英文刊名JOURNAL OFLIAONING MEDICALUNIVERSITY年 卷 期 xx 30 2 被引用次数1次参考文献 9条 1 Kim H Suh H Jo SAIn vivobone formation by human marrow stromalcells inbiodegradable scaffoldsthatrelease dexamethasoneand ascorbate 2 phosphate 外文期刊 xx 04 2 Jaiswal N Haynesworth SE Caplan AIOsteogenic differentiation of purified culture expanded humanmesenchymal stem cellsin vitro1997 02 3 Abiraman S Varma HK Kumari TVPreliminary invitro and in vivocharacterizations ofa sol gelderived bioactiveglass ceramicsystem 外文期刊 xx 05 4 Kim BS Baez CE Atala ABiomaterials fortissue engineering 外文期刊 2000 01 5 Kohane DS Langer RPolymeric biomaterialsin tissueengineering 外文期刊 xx 05 6 Kishimoto KN Watanabe