鼠源单克隆抗体技术

第三章 鼠源单克隆抗体,廖振林,廖振林 食品学院,概述在过去的二十五年里,利用杂交瘤细胞生产了成千上万的鼠单克隆抗体.人们用同样的技术从转基因鼠中克隆人类的抗体，并设计了全长型抗体和重组片段,它们可以被用于多种诊断和治疗。而且如果他们能在哺乳动物细胞,牛奶及植物中表达,就可以大量获得. 一个世纪以前,Paul Ehrlich提出了著名的侧链理论来解释抗原抗体的相互作用.他不久又铸造了一个虚构的短语”魔弹”来形容抗体对准及中和抗原.七十五年以后 Georges Khler and Csar Milstein发明了单克隆抗体技术,因此为细胞生物学和临床诊断学的巨大进步铺平了道路.,廖振林 食品学院,鼠和人的单克隆抗体 抗体分泌杂交瘤是由生长是不确定的骨髓瘤细胞得到的。一些不能分泌的骨髓瘤细胞系缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转化酶(HGPRT), 被确定作为融合配偶 。为了选择成功的融合细胞,细胞须在一个含有次黄嘌呤,氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的介质中培养,这样只有融合细胞可以增生。噬菌体的发展加强了抗体库的筛选,从而为获得人类单克隆抗体提供了新的手段.,.,廖振林 食品学院,人类抗体基因的转移 用同源重组技术删除重链结合区（JH）及Ck区可以遏制鼠胚胎干细胞上的IgH和IgK的基因位点，这样的小鼠不产生抗体。 要达到最有效的人类抗体基因转移，需要克隆酵母菌人工染色体（YACs），因为它可以和大片段的染色体DNA吻合。 通过融合缺乏鼠HGPRT的ES细胞和包含YAC的酵母菌原生质球，最终将YAC插入片段整合到鼠的胚系上。被选择的ES细胞微量注入胚细胞后，产生成功整合人抗体序列的小鼠，该序列可以在DNA胚系里编码大部分IgH和IgK基因位点。,廖振林 食品学院,转基因小鼠体内的人抗体 免疫后的转基因小鼠可以产生功能上很重要的高亲和力的人抗体。通过普通的杂交瘤技术可以实现克隆和生产。 鼠体内的人抗体和人细胞产生的人抗体可以通过他们糖基化的状态加以区别 。预期的结果在最初的实验中达到了，该实验利用含人抗体的小鼠和由鼠分离的杂交瘤细胞和啮齿类动物细胞系得到人抗体。,廖振林 食品学院,抗体片段的重组 由重链可变区和轻链可变区组成的Fv片段，是包含抗原结合位点的最小免疫球蛋白片段。然而，Fvs的两条链的结合力比Fab段的要低，Fab段也是由CH1和CL的不变区组成的。VH和VL之间是由肽段连接的，二硫键和“节和孔突变”可以加固他们的连接。,廖振林 食品学院,单链Fv片段 scFv在非靶组织中滞留时间较短，在血液中清除速度较快且更易侵入肿块。它有较低的免疫原性，并较易和蛋白质及肽结合。单一抗体片段 它和轻链可变区相互作用的粘连的碎片影响了他们的溶解度和稳定性。它和抗原的亲和力较低而且和不相干的抗原有交叉反应的趋势。构建多价体Fv抗体为了增加单价体scFv的亲和性，可以强制缩合肽段使它们形成多聚体。,廖振林 食品学院,产生系统 细菌,酵母菌,植物,昆虫细胞和哺乳动物细胞的抗体和抗体片段的产物都有它的表达系统. 细菌：不能装配所有糖基化的抗体,但是可以装配抗体片段的产物.酵母菌：可以表达完整的抗体,但含有高的甘露糖和多分支的寡糖,而且在效应器功能方面有缺陷。携带杆状病毒群的昆虫细胞植物：它们的抗体都含有碳水化合物,但结构上和哺乳动物细胞产生的不同.骨髓瘤细胞和哺乳动物非淋巴样细胞：都可以表达全功能抗体。,廖振林 食品学院,哺乳动物细胞表达 哺乳动物细胞系表达的重组子抗体,暂时或稳定的决定于所需要的蛋白质量. 为了获得稳定的转染体细胞系,可以广泛的应用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或鼠骨髓瘤细胞系。利用占优势的或隐性的扩增标记进行载体扩增后,可以增加这些细胞的生产力. 骨髓瘤细胞可以被表达载体转染,该载体包含免疫球蛋白基因和谷氨酰胺合成酶基因,骨髓瘤细胞可以在游离谷氨酸的介质中培养.,廖振林 食品学院,含抗体的奶为了使哺乳动物的乳腺产生乳蛋白以外的其它蛋白质,可以从超排卵供体的输卵管微量注射数百个复制体到受精卵而引入胚系序列,使外来基因和DNA融合,这些基因编码乳房特殊调节序列.经过一段时间的离体培养,可以把胚胎转移到假孕动物的输卵管或子宫,并发育到产期.最初的奶纯化阶段使用普通的操作，也就是移去酪蛋白和脂肪。澄清的乳清包含高浓度的相关抗体，它可以通过离子交换和亲和层析来纯化。纯化的抗体和从哺乳动物细胞培养中得到的抗体没有区别。,廖振林 食品学院,重组子抗体的细菌产物离体培养重组后的大肠杆菌的细胞质包涵体可以产生抗体片段。分子内二硫键形成功能性抗体片段可以分泌到壁膜间隙甚至大肠杆菌的介质，这需要融合细菌信号肽到抗体N末端。然而，高水平表达常常导致不溶解的抗体片段转运到周质腔后积累。 大肠杆菌一些折叠部分的过度表达，不能增加可溶性抗体片段的产量。,廖振林 食品学院,小结从杂交瘤细胞得到的鼠单克隆抗体提供了生物学临床研究和诊断的重要工具。仅人类基因组工程预期能定义大约100，000个编码同等数量蛋白质的功能基因。最激动人心的发展之一是人单克隆抗体的治疗上的应用，它比鼠抗体更有效和安全。Ehrlich的最早的关于“魔弹”的预言将会被实现。,单克隆抗体简介,一般流程,廖振林 食品学院,廖振林 食品学院,廖振林 食品学院,动画,廖振林 食品学院,基本概念,抗原决定镞（抗原表位）细胞克隆多克隆抗体单克隆抗体,廖振林 食品学院,Antigenic determinant,是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).,廖振林 食品学院,细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团,廖振林 食品学院,Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体,廖振林 食品学院,杂交瘤技术的理论基础,淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAb,廖振林 食品学院,当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。,廖振林 食品学院,细胞DNA合成途经,1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT2.主要途径：氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸谷 氨 酰 胺 （A-）尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）,廖振林 食品学院,甲氨蝶呤（aminopterin）,甲氨蝶呤是一种叶酸拮抗剂，可阻断DNA合成的主要途径，这样DNA的合成需要补救途径来完成。该途径需要次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶脱氧核苷（T）等前体存在。而且细胞内要有次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）、胸腺嘧啶核苷激酶（TK）存在。若缺乏其中一种酶，该补救途径便不能发挥作用。,廖振林 食品学院,HAT选择培养基的原理,HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T),廖振林 食品学院,廖振林 食品学院,抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞） （B细胞恶性肿瘤） 1. 抗体分泌（Ig+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2.8-AG筛选出 HGPRT-株 PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）,8-AG8：杂氮鸟嘌呤,廖振林 食品学院,融合的结果及命运,杂交瘤细胞,未融合的脾细胞,未融合的骨髓瘤细胞,脾-脾杂交细胞,骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞,廖振林 食品学院,免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定,廖振林 食品学院,制备单克隆抗体的基本技术,1 抗原提纯与动物免疫2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合4 抗体检测5 杂交瘤的克隆化和冻存6 McAb的制备7 单克隆抗体的纯化,廖振林 食品学院,免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行）选用6-12周龄Balb/c小鼠,廖振林 食品学院,颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。,廖振林 食品学院,骨髓瘤细胞系选择要点：稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 等。保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清）融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备,廖振林 食品学院,廖振林 食品学院,免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。融合比例：骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液,廖振林 食品学院,一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。,廖振林 食品学院,克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染,廖振林 食品学院,有限稀释法,从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，经过逐步稀释，使每孔只有一个细胞。,廖振林 食品学院,单克隆抗体制备具体步骤,单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。,廖振林 食品学院,廖振林 食品学院,廖振林 食品学院,一、抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。 有的抗原可以用化学合成：地高辛 多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。,廖振林 食品学院,为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。 目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和 LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。,廖振林 食品学院,免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法。 体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用812周龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔13周，再追加免疫12次。,7,廖振林 食品学院,可溶性抗原按每只小鼠10100g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔24周，再用不加佐剂原抗原追加免疫12次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。,廖振林 食品学院,资料：佐剂,对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。 1佐剂的类型 目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。 弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant, IFA） 羊毛脂 1 份 石蜡油 5 份 混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50左右，加抗原进行乳化处理。 弗氏完全佐剂（complete Freunds adjuvant, CFA） 弗氏不完全佐剂 10ml 卡介苗 10mg200mg 卡介苗可10010min灭活处理。,廖振林 食品学院,初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。 脂质体：是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用。 油佐剂 ：采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。目前应用最广的矿物油。10号白油(石蜡油) 100ml硬脂酸铝 2g司本80 6ml 混合加热融化，分装。用时按下列配方进行乳化。 油相 3份 水相（加4%吐温80） 1份 先把油相搅拌起来，然后缓慢加入水相乳化。司本是油分散剂，吐温是水分散剂，均有利于乳化。,廖振林 食品学院,佐剂概念,1. 概念: 即将其预先或与抗原一起注射给机体可增强免疫应答或改变应答的类型的物质2. 分类: 无机佐剂与有机佐剂.3. 作用机制: 改变抗原物理性状，延长抗原在体内存留时间，刺激吞嗜细胞，增强提呈能力，刺激淋巴细胞增殖，分化,廖振林 食品学院,脾内免疫法即在麻醉下直接将 0.10.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10g。,廖振林 食品学院,体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。 优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。,廖振林 食品学院,体外免疫法：用48周龄BALB/c 小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.55g/ml,在5% CO37 C 下培养45天,再分离脾细胞,进行细胞融合。,o,2,o,廖振林 食品学院,二、细胞融合与杂交瘤细胞的 选择性培养 细胞融合的方法： 脾细胞（110） 骨髓瘤细胞（210）混合 聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。,8,7,廖振林 食品学院,用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。 PEG相对分子量4000，浓度为50% 二甲基亚砜增加融合率。,廖振林 食品学院,细胞融合后可产生多种融合。脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞。 选择性培养: 培养基 为HAT培养液。 次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。 A阻断DNA合成。,廖振林 食品学院,三、筛选阳性克隆与克隆化 筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。,廖振林 食品学院,单抗生产的方法：动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。,廖振林 食品学院,单抗纯化方法：,盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法辛酸沉淀法,廖振林 食品学院,用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。 血清 50%饱和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白,廖振林 食品学院,凝胶过滤法,干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。交联葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(Sepharose),廖振林 食品学院,离子交换层析法,DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质