基因工程的基本操作程序ppt课件.pptx

基因工程的基本操作程序 1 基因工程培育抗虫棉的简要过程 苏云金芽孢杆菌 抗虫基因 棉花植株 有抗虫特性 2 基因工程的基本操作程序 1 目的基因的获取 2 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 基因表达载体的构建 3 一 目的基因的获取 1 目的基因 主要指的是编码蛋白质的结构基因 也可以是一些具有调控作用的因子 2 获取方法 1 从基因文库中获取目的基因 2 利用PCR技术扩增目的基因 3 通过DNA合成仪用化学方法直接合成 4 不能转录为信使RNA 不能编码蛋白质 能转录相应的信使RNA 能编码蛋白质 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 有调控遗传信息表达的核苷酸序列 在该序列中 最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 启动子 终止子 5 补 真核细胞的基因结构 编码区 与RNA聚合酶结合位点 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 内含子 外显子 6 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子 能编码蛋白质的序列内含子 不能编码蛋白质的序列 有调控作用的核苷酸序列 包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点 非编码序列 包括非编码区和内含子 7 结构基因 外显子 内含子 转录 加工修饰 mRNA 8 一 从基因文库中获取目的基因 1 什么叫基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入到受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 9 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 10 基因组文库的构建模式图 通过对受体菌的培养而储存基因 11 12 基因组文库和部分基因文库的比较 小 大 无 有 无 有 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 13 14 15 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 前提条件 原料 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 DNA引物 热稳定DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 模板DNA 16 PCR扩增仪 17 PCR技术扩增与DNA复制的比较 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板 能量 酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 18 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 19 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 三 化学方法人工合成目的基因 20 人工合成 基因比较小 DNA合成仪 21 从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成 归纳 获取目的基因的方法 22 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种 二 构建表达载体 23 2 基因表达载体的目的 1 使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代 2 使目的基因能够表达和发挥作用 24 科学家在培育抗虫棉时 经历了多次失败 才获得成功 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中 然后导入棉花的受精卵中 结果抗虫基因在棉花体内没有表达 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子 抗虫基因首端 导入棉花受精卵 长成的棉花植株还是没有抗虫能力 科学家又在有启动子 抗虫基因的质粒中插入终止子 抗虫基因末端 导入棉花受精卵 结果成长的植株 有了抗虫能力 资料 25 3 基因表达载体的组成 它们有什么作用 a 目的基因 b 启动子 c 终止子 d 标记基因 26 调节基因 操纵基因 结构基因 RNA聚合酶 半乳糖苷酶 酶 酶 启动子 RNA聚合酶 启动子 位于基因首端的一段特殊的DNA片断 它是RNA聚合酶识别和结合的部位 有了它才能驱动基因转录出mRNA 最终获得蛋白质 27 思考1 表达载体为什么一定要有启动子 1 生物之间进行基因交流 只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达 2 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子 只将编码序列导入受体细胞无法转录 28 思考2 终止子的作用是什么 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断 能终止mRNA的转录 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将有目的基因的细胞筛选出来 思考3 标记基因有什么作用 29 三 将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞 有大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 酵母菌和动植物细胞等 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 一 转化 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 30 1 将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法 31 1 农杆菌转化法 特点 易感染双子叶植物和裸子植物 对大多数单子叶植物没有感染能力 原理 Ti质粒上的T DNA可以转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 32 转化过程 Ti质粒目的基因 构建 表达载体 植物细胞 植物细胞染色DNA 新性状 农杆菌 33 基因枪法又称微弹轰击法 是利用压缩气体产生的动力 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中 使目的基因与其整合并表达的方法 2 基因枪法 适用于单子叶植物 34 3 花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后 花粉管要穿过花柱直通胚囊 花粉管通道法就是在植物受粉后 花粉形成的花粉管还未愈合前 剪去柱头 然后 滴加DNA 含目的基因 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 适用于被子植物 35 36 2 操作程序 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 37 常用法 Ca2 处理 常用菌 大肠杆菌 微生物作受体细胞原因 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 过程 Ca2 处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 3 将目的基因导入微生物细胞 思考 为什么要用Ca2 处理受体细胞 用Ca2 处理 增加细菌细胞壁的通透性 38 受精卵体细胞 受精卵 细胞 个体 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射技术 用Ca2 处理成感受态细胞 39 四 目的基因的检测与鉴定 检测 是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定 分子水平鉴定个体生物学水平鉴定 40 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA 1 方法 DNA分子杂交 2 过程 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记 以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交 若显示出杂交带 表明染色体已插入染色体DNA中 一 检测 41 基因探针 是一段带有检测标记 且序列已知的 与目的基因互补的核酸序列 基因探针通过分子杂交与目的基因结合 产生杂交信号 能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来 42 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段 将两种生物的DNA分子的单链放在一起 如果这两个单链具有互补的碱基序列 那么 互补的碱基序列就会结合在一起 形成杂合双链区 在没有互补碱基序列的部位 仍然是两条游离的单链 43 二 鉴定 个体生物学水平 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 分子杂交 方法 抗原 抗体杂交 过程 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交 若出现杂交带 表明目的基因转录出了mRNA 44 提取 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法 抗原 抗体杂交 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 45 目的基因的表达和检测 46 归纳 基因工程的基本操作程序 获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因 启动子 终止子 标记基因将目的基因导入受体细胞转化法 微生物 农杆菌转化法 植物 显微注射法 动物 目的基因的检测与鉴定检测 是否插入