CN103768254A茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用.doc

CN103768254A茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用 (10)申请公布号103768254A (43)申请公布日xx.05.07103768254A (21)申请号xx10031153.2 (22)申请日xx.01.23A61K36/82(xx.01)A61K31/353(xx.01)A61P33/12(xx.01) (71)申请人江汉大学地址430056湖北省武汉市沌口经济技术开发区新江大路8号 (72)发明人徐德宋文剑孔争张泽华胡松陈琳艾永循刘楷 (74)专利代理机构北京华沛德权律师事务所11302代理人刘杰 (54)发明名称茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用 (57)摘要本发明公开了一种茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用，属于医药技术与预防医学领域。 所述茶多酚及其衍生物可以预防日本血吸虫感染，特别表没食子儿茶素没食子酸酯对疫水中尾蚴结构的破坏，减弱尾蚴的钻肤功能，预防日本血吸虫经皮感染。 (51)Int.Cl.权利要求书1页说明书4页附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页 (10)申请公布号103768254A103768254A1/1页21.茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用，其特征在于，所述茶多酚及其衍生物可以预防日本血吸虫感染。 2.根据权利要求1所述的茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用，其特征在于，所述茶多酚及其衍生物的形式为水溶性或脂溶性。 3.根据权利要求1或2所述的茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用，其特征在于，所述茶多酚及其衍生物为表没食子儿茶素没食子酸酯。 4.根据权利要求3所述的茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用，其特征在于，所述茶多酚及其衍生物为表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶中提取的一种成分。 权利要求书103768254A21/4页3茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用技术领域0001本发明属于医药技术与预防医学领域，具体涉及一种茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用。 背景技术0002血吸虫病依然是世界和我国目前主要面对的一项公共卫生难题,被中国卫生部列为4种重大传染病之一。 我国血吸虫病防治工作自上世纪50年代开展以来,取得了举世瞩目的成绩。 xx年，全国第3次血吸虫病流行病学抽样调查结果指出在我国7个流行省疫情未控制村的血吸虫感染率为2.5%。 截止xx年底,已有五个省市如上海市、浙江省、福建省、广东省、广西壮族自治区等达到血吸虫病传播阻断标准，但是在湖北、湖南、江西、安徽、江苏、四川、云南7个省尚未达到疫情控制标准，据统计全国约有血吸虫病人70万人。 0003血吸虫的生活史分为成虫、虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫等7个阶段。 中间宿主是钉螺，哺乳动物是其终宿主。 终宿主、中间宿主及其生存的外部环境共同构成了血吸虫生存、繁衍的环境链条。 0004自毛蚴钻入钉螺体内到尾蚴发育成熟所需时间与温度有关，在自然条件下，最快需要44天，最慢需要186天。 人工控制温度在2530时，感染后2个月，仅有少数尾蚴发育成熟，3个月后有大量尾蚴成熟。 血吸虫尾蚴是血吸虫的感染虫期，感染方式为经皮肤钻入终末宿主。 0005钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主，灭螺仍是目前控制血吸虫病的重要策略和措施之一。 但是，多年的血吸虫防治结果表明由于钉螺生存环境复杂、繁殖力强，要想从根本上消灭钉螺非常困难。 血吸虫尾蚴是感染人畜的唯一阶段，尾蚴以静态方式浮在水面上，并且尾蚴是血吸虫生命周期中最脆弱的阶段。 因此研究血吸虫尾蚴防治药物日渐引起人们的关注。 0006吡喹酮是目前治疗日本血吸虫病的首选理想药物。 对血吸虫尾蚴、童虫、成虫均有明显、快速的杀灭作用。 吡喹酮在水中杀死尾蚴的最低有效浓度为0.05g/mL。 尾蚴与吡喹酮接触后10s变松弛.15min内尾部与体部分离.24h内死亡。 但是吡喹酮难溶于水.密度比水大.直接作为清除大面积水面尾蚴的药物难以实行。 0007氯硝柳胺作为灭螺首选药物，不但对钉螺有较高的杀灭效果，而且对血吸虫尾蚴也有一定的杀灭作用。 由于水溶性差、易沉降或者毒性大而限制其大面积水域使用。 人们对此加以改进，研制出了缓释剂和漂浮剂。 硝苯柳胺是湖南省血吸虫病防治所在氯硝柳胺的基础上经改进其结构及合成路线而成功合成的一种化合物，其理化性质与氯硝柳胺相似，对人畜毒性低且无遗传毒作用。 在温度为25-35时，硝苯柳胺水溶液浓度为0.52.0mg/L,在832min内将尾蚴全部杀死。 硝苯柳胺是一种较强杀日本血吸虫尾蚴的杀蚴剂，其杀蚴作用随温度升高而增加。 0008五氯酚钠易溶于水，对钉螺和尾蚴均有较高杀灭活性；灭血钉草虫灭可湿性粉剂说明书103768254A32/4页4系以沙蚕毒类农药杀虫单位为主要成分，与磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆混合配制而成，对钉螺和尾蚴有杀灭作用。 0009以上研究都有其不足之处，如药物扩散效果不好、在水面容易团聚，导致灭蚴效果难以评价，此外为使水体中药物浓度达到有效浓度，必须加大药量，这样会导致对水生生物毒性也较大.药物安全性难以得到保证。 0010植物灭蚴药主要是从植物根、茎、叶、花、果和籽中提取出有灭蚴活性的有效成分。 许多对钉螺有较强毒杀作用的植物灭螺药同时能够杀灭血吸虫尾蚴。 这些植物药的主要成分分属皂甙类、生物碱类、(异)黄酮类、萜类、鞣质、烯基酚、萘醌和呋喃香豆素等。 植物灭蚴药的优点是对水生生物毒性低，具有环境友好性，对于血吸虫病流行、植物资源丰富的国家和地区来说可以充分利用。 但是，植物活性成分提取步骤复杂、成本高，大面积水域施药浓度不易控制再加上用量大，将其作为灭蚴药大面积推广还存在许多困难。 发明内容0011本发明的目的是解决上述问题而提供了一种茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用。 0012本发明所采用的技术方案是0013茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的应用，所述茶多酚及其衍生物可以预防日本血吸虫感染。 0014优选地，所述茶多酚及其衍生物的形式为水溶性或脂溶性。 0015更优选地，所述茶多酚及其衍生物为表没食子儿茶素没食子酸酯。 0016进一步地，所述茶多酚及其衍生物为表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为绿茶中提取的一种成分。 0017本发明具有以下优点0018本发明对现有的茶多酚进行了分析，发现茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的上有良好的效果。 EGCG是茶多酚中的一种，它是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9%13%，因为具有特殊的立体化学结构，EGCG具有非常强的抗氧化活性，在抗癌和心血管疾病方面担当了重要的角色，近年来，发现其对病原生物的重要蛋白有一定的破坏作用，可以阻断病原生物感染的扩散。 本发明中EGCG对疫水中尾蚴结构的破坏，减弱尾蚴的钻肤功能，预防日本血吸虫经皮感染，同时EGCG是一种纯天然制剂，毒副作用小，对人畜无害。 附图说明0019图1为实施例1中0.1%EGCG作用日本血吸虫尾蚴后的参照图；0020图2为实施例1中1%EGCG作用日本血吸虫尾蚴后的参照图；0021图3为实施例1中对照组日本血吸虫尾蚴的参照图；0022图4为实施例2中日本血吸虫尾蚴感染小鼠后肝组织病理检测图；0023图5为实施例3中ELISA检测小鼠血清中日本血吸虫抗体的参照图。 具体实施方式说明书103768254A43/4页50024下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。 0025实施例10026EGCG对尾蚴活性影响检测0027分别计数日本血吸虫尾蚴约40条置于蒸馏水，1%EGCG，0.1%EGCG，中处理210min，然后于解剖镜下观测尾蚴活性，其结果如下0028参照图1和图3，尾蚴在1%EGCG中2min后，尾蚴运动明显较对照组剧烈，其尾部急剧摆动，挛缩。 参照图2和图3，0.1%EGCG组与对照组无特别大的差别。 0029实施例20030EGCG对尾蚴感染效果影响（成虫计数与肝脏病理）0031实验鼠随机分成3组蒸馏水对照组，尾蚴经1%EGCG处理组，尾蚴经0.1%EGCG处理组，每组5只小鼠。 实验前小鼠腹部剃毛（范围2cm3cm）；皮下注射10%水合氯醛0.1ml进行麻醉。 分别取经蒸馏水，1%EGCG，0.1%EGCG处理10min后的日本血吸虫尾蚴（305）条，贴于3组小鼠腹部,感染20min。 00321）成虫计数0033感染43d后解剖小鼠,用灌注法加撕碎法收集虫体。 首先经上腔静脉灌注冲洗，解剖镜下计数其肝、肠静脉丛内的虫体数；灌洗结束，取下肝、肠，用小镊子将肝与肠系膜拉碎，检查、计数未冲出的虫体，计算小鼠感染率、平均虫荷数以及减虫率。 减虫率计算公式为0034减虫率（%）=(对照组虫荷数实验组虫荷数)/对照组虫荷数100%00352）肝脏病理检测0036感染43d后解剖小鼠，取小鼠肝脏，观察虫卵结节沉积情况，并石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察，其结果如下。 0037成虫计数比较感染43d后解剖小鼠,检查、计数未冲出的虫体，计算小鼠感染率、平均虫荷数以及减虫率。 从表1中可以看出，1%EGCG减虫率为81.87%，0.1%EGCG减虫率为33.52%.0038表11%EGCG、0.1%EGCG以及对照组平均荷虫率和减虫率0039平均荷虫率减虫率(%)对照组18.21%EGCG3.381.870.1%EGCG12.133.520040肝脏病理结果参照图4，图4中A为对照组、B为0.1%EGCG，C为0.1%EGCG。 对照组、0.1%EGCG处理组中小鼠肝组织明显见虫卵结节形成，而1%EGCG处理组中6只小鼠除1只感染外，其余5只肝组织切片正常。 0041实施例30042EGCG对尾蚴感染效果影响（ELISA检测）0043 （1）小鼠眼球采血分离血清，按110稀释后备用说明书103768254A54/4页60044 （2）取96孔反应板，在加入100l样品稀释液到每个反应孔中，并分别保留阳性及阴性对照孔各2个、空白对照孔1个；0045 （3）取110待检血清10l分别加入已有样品稀释液的孔中，充分混匀；0046 （4）分别加入100l空白、阴性和阳性对照血清在之前的预留孔中；0047 （5）混匀后加上封板膜，放入37培养箱内孵育30min；0048 （6）弃掉反应孔中液体，然后加满洗涤液，静置5s后甩干，重复5次后拍干；0049 （7）每孔加入2滴酶结合物，混匀后盖上封板膜，置于37培养箱内孵育30min；0050 （8）重复步骤 （5）；0051 （9）每个反应孔各加入1滴显色剂A液和B液，将其充分混匀后置于37培养箱内孵育10min；0052 （10）每个反应孔加入1滴终止液终止反应，混匀；0053 （11）用双波长的酶标仪比色，取波长630nm，用空白对照孔校零后读取每孔OD值，与对照比较确定结果，其结果如下。 0054参照图5，经统计学比较，我们发现尾蚴经1%EGCG处理组小鼠体内的血吸虫抗体明显低于对照组和0.1%EGCG处理组（p0.05），提示1%EGCG可能影响到尾蚴的钻入功能，进而减弱尾蚴感染能力。 0055从上述三个实施例得出的结论在使用化学合成药物时会出现扩散效果不好、在水面容易团聚，导致灭蚴效果难以评价，此外为使水体中药物浓度达到有效浓度，必须加大药量，这样会导致对水生生物毒性也较大，药物安全性难以得到保证。 EGCG绿茶提取物，属于天然物质，对水生生物毒性低，具有环境友好性。 0056目前小鼠体外实验结果提示尾蚴经1%EGCG处理后尾蚴活动状态异常，并出现断尾现象，小鼠体内检测证明尾蚴经1%EGCG处理后减虫率可达81.87%，肝组织损伤小，血清学诊断也发现该组血吸虫抗体含量远低于其他组。 由此可以认为尾蚴经1%EGCG作用后的感染能力大幅减弱，可以成为灭活体外尾蚴的有效天然的防护消毒剂。 0057茶多酚及其衍生物，如水溶性茶多酚，可通过喷洒，缓释，消毒、内服等应用方式达到预防日本血吸虫感染的效果；脂溶性茶多酚则可制成乳化制剂进行喷洒、缓释、消毒，或制成外涂制剂达到预防日本血吸虫尾蚴侵入，还可探索通过口服途径减低日本血吸虫在体内造成的危害。 0058本发明对现有的茶多酚进行了分析，发现茶多酚及其衍生物在预防日本血吸虫感染的上有良好的效果。 EGCG是茶多酚中的一种，它是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9%13%，因为具有特殊的立体化学结构，EGCG具有非常强的抗氧化活性，在抗癌和心血管疾病方面担当了重要的角色，近年来，发现其对病原生物的重要蛋白有一定的破坏作用，可以阻断病原生物感染的扩散。