MTT法检测细胞活性及其应用

精品文档 1欢迎下载 MTT 法检测细胞活性及其应用 一 实验目的 1 掌握 MTT 法的基本原理和操作 学会应用 MTT 法解决简单的实际问题 2 巩固动物细胞培养的知识 熟练相关操作 3 学会酶联免疫检测仪 简称酶标仪 的操作方法 二 实验原理 1 MTT 法又称 MTT 比色法 是一种检测细胞存活和生长的方法 其检测原 理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色 结晶甲瓒 Formazan 并沉积在细胞中 而死细胞无此功能 二甲基亚砜 DMSO 三联溶液 能溶解细胞中的甲瓒 用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处 测定其光吸收值 可间接反映活细胞数量 在一定细胞数范围内 MTT 结晶形 成的量与细胞数成正比 该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测 大 规模的抗肿瘤药物筛选 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等 它的特点 是灵敏度高 经济 2 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融 实验证明这样可以最大限度的 保存细胞活力 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂 这两种物质 能提高细胞膜对水的通透性 加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外 减 少细胞内冰晶的形成 从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤 复苏细胞应采 用快速融化的方法 这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化 避免由 于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤 3 从动物机体中取出的相关组织通过胰蛋白酶或胶原蛋白酶可以将其分散 成单个细胞 再放于适宜的培养基中 可以使这些细胞生长繁殖以供实验所需 该实验对无菌要求极高 以培养出满足实验条件的细胞 4 酶联免疫检测仪测定的原理是在特定波长下检测被测物的吸光值 酶标 仪实质就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计 精品文档 2欢迎下载 三 实验材料 器材与试剂 材料 Hela 细胞 器材 恒温水浴锅 超净工作台 培养箱 37 5 CO2 冰箱 4 20 70 液氮冰箱 灭菌锅 烧杯 培养瓶 滴管 酒精灯 镊子 离心机 24 孔培养板 96 孔培养板 摇床 酶标仪 倒置显微镜 移液枪 带枪头 15mL 离心管 冻存管 1 2mL 红血球计数板 记号笔 0 22 m 滤膜 铝箔纸 试剂 二甲基亚砜 分析纯 甘油 10 胎牛血清 胰蛋白酶 0 5 双抗 青霉素 链霉素 1 万单位 mL 磷酸缓冲液 配制见附录 1 MTT 3 4 5 二甲基噻唑 2 2 5 二苯基四氮唑溴盐 商品名 噻唑蓝 配制见 附录 2 DMEM 培养液 配制见附录 3 无菌水 抗肿瘤药物 具体待定 4 实验步骤 A Hela 细胞复苏 1 从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管 直接浸入37 温水中 并不 时摇动令其尽快融化 2 从37 水浴中取出冻存管 打开盖子 用吸管吸出细胞悬液 加到离心 管并滴加10倍以上 DEME 培养液 混匀 3 离心 1000rpm 5min 4 弃去上清液 加入含10 胎牛血清的 DMEM 培养液重悬细胞 计数 调整 细胞密度至1 104个 mL 部分接种培养瓶 37 培养箱静置培养 5 次日更换一次培养液 继续培养 此后定期更换培养液 维持细胞正常 活性 B MTT 检测复苏细胞的细胞活性 Hela 细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块 1 接种培养瓶同时 将其余部分接种于 96 孔细胞培养板 7 组 每组 5 孔 每孔 100 L 37 培养箱静置培养 2 培养 24h 后 向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的 0 5 MTT 5mg mL 20uL 37 培养箱内培育 3 4h 后终止培养 将孔内培养液小心吸出 每孔加入 150 L 二甲基亚砜 置摇床上低速振荡 10min 使结晶物充分溶解 同时每行第一孔设置为调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 用酶标仪 OD570nm 处测量各孔吸光值 C 细胞生长曲线制作 接 B 2 B 3 步骤 连续测量 7 天 根据测量结果绘制细胞生长曲线 精品文档 3欢迎下载 横坐标生长时间 纵坐标吸光度值 D 探究某药物对于细胞活性的影响 1 将之前培养于培养瓶中的细胞用 0 5 胰蛋白酶洗脱 加入 DEME 培养液制 成细胞密度为 1 106个 mL 的细胞悬液 2 设置空白对照组及 5 个不同药物梯度的实验组 分别加载 96 孔培养板内 5 个梯度剂量按药物种类待定 每个剂量分别设置 5 个平行孔 每孔加入细 胞悬液 100 L 在加药的前一天下午完成铺板 3 次日上午按预先设置的药物梯度加药 后置 37 培养箱培养 24h 4 每孔加入 20 LMTT 溶液 继续培养 4h 若药物能与 MTT 反应 可以先离 心后弃去上清液 用 PBS 冲洗 2 3 遍后再加入 MTT 溶液 5 终止培养 小心吸去孔内培养液 6 每孔加入 150 L 二甲基亚砜 置摇床上低速振荡 10min 使结晶物充分 溶解 用酶标仪 OD490nm 处测量各孔的吸光度 7 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度 的药物溶解介质 培养液 MTT 二甲基亚砜 E Hela 细胞冻存 1 配制含 10 DMSO 或甘油 10 20 小牛血清的冻存培养液 2 取对数生长期的细胞 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来 悬浮生长 的细胞则直接将细胞移至15ml 离心管中 3 离心1000rpm 5min 4 去除胰蛋白酶及旧的培养液 加入适量配制好的冻存培养液 用吸管轻轻 吹打使细胞均匀 计数 调节冻存液中细胞的最终密度为 5 106 ml 1 107 ml 5 将细胞分装入冻存管中 每管1 1 5 ml 6 在冻存管上标明细胞的名称 冻存时间及操作者 7 冻存 标准的冻存程序为降温速率 1 2 min 当温度达 25 以下时 可增至 5 10 min 到 100 时 则可迅速浸入液氮中 也可将装有细胞 的冻存管放入 20 冰箱2h 然后放入 70 冰箱中过夜 取出冻存管 移入液 氮容器内 五 实验结果 Hela 细胞复苏情况良好 生长曲线绘制较好 成功验证肿瘤细胞对 Hela 细胞的作用 六 附录 1 磷酸缓冲液配制方法 NaCl 8g KCl 0 2g Na2HPO4 1 44g KH2PO4 0 24g 调 pH 7 4 定容 1L 2 0 5 MTT 溶液配制方法 精品文档 4欢迎下载 称取 MTT0