感受态制备、蓝白斑筛选

感受态细胞的制备 质粒转化入大肠杆菌及初步筛选,复习：基因克隆示意图,基因克隆操作过程：,基因工程,一、感受态细胞及重组体转化,重组体转入受体菌,转化（transformation）转染（transfection）转导（transduction）,转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。 转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞; 转导则是指病毒从被感染的细胞(供体)释放出来，再 次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体 细胞之间的DNA转移及基因重组。,重组DNA分子导入受体细胞的手段,转化方法,CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,感受态(competent)：宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞. 正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。,制备感受态细胞和转化的常用方法 CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到51062107转化子/g质粒DNA，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显微注射法(microinjection)； 磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；,CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0）0.050.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。,同时在转化体系中的DNA形成的抗DNase的羟基-钙磷酸复合物能粘附于细菌表面，经过42短时间热休克（heat shock）处理，促进感受态细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。,0.1mol/LCaCl2,0,重组体,感受态细胞,转化(transformation)：在分子克隆技术中，转化特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 区别转化、转染(transfection)与转导(transduction),转化与感受态细胞,二、感受态细胞制备及重组体转化的实验操作及注意事项,细菌转移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm5min,弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300l，重悬菌体，冰浴20min,40C，4000rpm5min 弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 100l，重悬菌体。 冰浴10min,冰浴10min后,每管加入质粒5l,轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置20min,试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动试管,迅速将试管转移到冰浴，冷却12min,取出试管后，每管加入LB培养基800l，置于370C摇床（100150r/min），温和震荡45min用无菌弯头玻璃铺菌器将200l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面室温放置20min，使液体被吸收（发汗）倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长,三、重组体的筛选,重组体克隆的筛选与鉴定,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆。,筛选的依据： 基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。 筛选的方法： 抗药性标志的选择 插入表达筛选 -半乳糖苷酶系统筛选（-互补） (-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深蓝沉淀）,(插入失活法)抗药性标记选择,目 录,菌落杂交筛选法 内切酶图谱鉴定 PCR筛选重组子 Southern印迹杂交和菌落原位杂交 DNA序列分析 免疫化学检测法,原理：基因载体上含有-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，当外源DNA插入到载体的LacZ基因上后将造成-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化直接观察出来。,蓝白斑实验, 互补的检测,目 录,U6,原位杂交,目 录,Southern印迹,目 录,鸡的肌球蛋