适宜技术应对结核感染

适宜技术助力综合医疗机构应对结核感染,检 验 科 任 易,1. 结核病背景资料,2. 结核病病原学实验室诊断,3.体外r-干扰素释放试验,4.小 结,背景结核病流行现状,全球有三分之一人口（20亿）感染了结核杆菌我国现患肺结核病人达500万，占全球病人总数的1/4,背景结核病感染、传播、发病过程,潜伏感染染,肺病或其他疾病,潜伏感染,复发,细菌在人体复制,播散Disseminates,发作Onset,康复Recovery,时间表Time,诊断Diagnosis,治疗Treatment,痊愈, 2 个月（months）,背景当前结核病的研究,新型抗结核药物(50%)新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗(10%),JID 2012:205 (Suppl 2), S147.,背景结核分枝杆菌基础,结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德国细菌学家柯赫（Robert Koch）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。在微生物分类中，结核分枝杆菌属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌,背景结核分枝杆菌基础,（1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。 （2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主要与其细胞壁内含大量脂质有关。主要包括： 磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关 分枝菌酸：与抗酸染色性有关 索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关 硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用 蜡质D，可刺激机体的迟发型超敏反应。 （3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫,背景-结核病患者的发现,症状： 肺结核病可疑症状者，主要指有咳嗽、咳痰二周以上者, 或有咯血症状者发现方式： 因症求诊、转诊和因症推荐 是发现肺结核病人的主要方式,背景-结核病患者的诊断,肺结核诊断标准：按照新修订的肺结核诊断标准（WS288-2008），肺结核分确诊病例、临床诊断病例和 疑似病例。,背景-结核病实验室的任务,Provide Early and Accurate Diagnosis 提供早期精准诊断 Initiation of right treatment and intervention early 制定正确治疗方案并早期干预 Monitoring therapy efficacy in a prompt manner 迅速的监测疗效 Treatment and diagnosis companion in tuberculosis drug development 在开发抗结核药物同时发展新的治疗及诊断手段,结核病实验室诊断技术简介,1.结核抗体2.结核蛋白芯片3.体外r-干扰素试验4.结核杆菌分泌抗原,1.涂片2.培养3.药敏4.菌型鉴定,细菌学,免疫学,分子生物学,其 他,1.HPLC2.质谱技术3.流式技术,1.实时荧光定量PCR2.DNA3.RNA4.耐药基因突变5.菌型鉴定6.测序,结核分枝杆菌形态学检测,1.直接抹片法2.离心制片法,1.抗酸染色2.荧光染色,1.普通显微镜2.荧光显微镜3.自动阅片技术,结核杆菌形态学检测-离心制片技术,2015年7月至2015年11月，对本院257例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：,结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。,结核杆菌形态学检测-自动阅片技术,2016年2月至2016年3月，本院对308例涂片进行人工阅片和计算机自动阅片比对试验；结果符合的为286例，总符合率为92.58%。,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,分枝杆菌全自动连续检测系统-BACTEC MGIT 960操作简单安全可靠性能优异高性能价格比M=MycobacteriumG=GrowthI=IndicatorT=Tube,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,检测对象CO2 O2检测手段颜色 荧光发光元素培养基改良Middle Brook 7H9营养添加剂抑菌剂 灵敏，快速，安全,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,简单的工作流程,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,BACTEC MGIT 960 阳性结果判读1.抗酸染色2.普通培养血平板3.MPB64抗原检测,结核病诊断金标准结核分枝杆菌培养,BACTEC 9120 只能做血培养？标本：血液、无菌体液,我可以的！-普通细菌、真菌分枝杆菌,结核分枝杆菌体外药敏试验,结核杆菌体外药敏试验,MIC测定法,固 体培养法,液体仪器法,液体微量法,结核分枝杆菌体外药敏试验,药敏系统采用NCCLs 推荐的比例法(MOP)，判断的临界值为1%药敏试剂包括:SIRE Kit (Streptomycin, Isoniazid, Rifampin and Ethambutol) 4-13天PZA Kit 4-21天SIRE Susceptibility options:另有单独包装的高浓度药物S，I，E (在低浓度耐药情况下，可用于高浓度实验),BACTEC MGIT 960 药敏系统,结核分枝杆菌体外药敏试验,MGIT PlasticTubes,BACTEC 960 SIRE KIT,Myco/F Lytic25 pack,BACTEC 960PZA Kit,960 directLIS,BACTEC 960 for G&D,ManualMGIT,BACTEC 460TB,BACTEC9000MB,2003 BD is always the LEADER,结核分枝杆菌药敏试验的金标准-MGIT960,EpiCenter forthe 960,结核分枝杆菌体外药敏试验,Drug free Isoniazid Ethambutol Inoculum media 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 + + 3 10-5 26 9 0 % resistant 34.6 0.1Interpretation Resistant Susceptible,结核分枝杆菌体外药敏试验,1,2,3,4,挑取菌落磨菌、稀释,接种菌液,孵育7-10天,显色，读取结果,结核分枝杆菌液体微量药敏,结核分枝杆菌体外药敏试验,结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验 收集我院2015年8月至11月的临床分离菌株511例，使用液体微量显色法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的体外药敏试验 。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。,结核分枝杆菌体外药敏试验,结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验 收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株117例，使用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、 利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、 氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的比对实验。 总符合率超过90%。,结核病分子生物学诊断,一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术,结核病分子生物学诊断,结 果 判 断,结核病分子生物学诊断,收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在96%以上。并对耐药结果不相符的11株菌进行了基因测序分析，均证实有耐药基因突变。,结核病分子生物学诊断,二、结核分枝杆菌RNA检测(TB-RNA)RNA作为临床分子诊断靶标的优点：RNA 拷贝数 DNA拷贝数更具临床意义: 生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定，病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标,结核病分子生物学诊断,统计今年我院住院患者179例，分析涂片、培养和TB-RNA检测报告，结果如下：,我院涂片、培养阳性率分别为：15.1%和37.9%；TB-RNA的总阳性率为35.8%。,结核病分子生物学诊断,三、EasyNAT TB-DNA检测（恒温扩增法）原理：将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异性引物、一对特异性探针，同时 一次性完成TB DNA的扩增及杂交 过程，然后用一次性核酸检测装 置进行定性诊断。检测目标片段:目标为结核分枝杆菌 特异性IS6110片段。,结核病分子生物学诊断,操作步骤,结核病分子生物学诊断,2015年6月，我科参加CTCTC“EasyNAT结核分枝杆菌核酸检测试剂盒现场应用评估”项目,结果如下：,注*：1例培养阳性最终鉴定为非结核分枝杆菌,结核病分子生物学诊断,四、Gen-Xpert MTB/RIF进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、 rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变容易使用，不需要进行分子生物学培训操作完全自动化， 使用起来既容易又安全。,结核病分子生物学诊断,Xpert MTB/RIF与PCR TB-DNA检测的比较：阳性符合率99.03，阴性符合率92.61，总符合率95.31,结核病分子生物学诊断,涂片阳性肺结核: Xpert 检出率=99.35涂片阴性肺结核: Xpert 检出率=35.32,结核病分子生物学诊断,Xpert MTB/RIF与BD960液体培养比较实验：阳性符合率95.52，阴性符合率95.51，总符合率= 95.51,结核病分子生物学诊断,Xpert MTB/RIF与比例法药敏比较实验：阳性符合率 96.88，阴性符合率 95.53，总符合率 95.73，,结核病分子生物学诊断,WHO关于Xpert MTB/RIF的建议Xpert MTB/RIF 应该用于MDR-TB的高危人群、以便尽早发现MDR-TB患者，有效控制疫情。Xpert MTB/RIF 在MDR或HIV问题不十分严重的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步检测。,体外r-干扰素释放试验,蛋白质水平,结核菌素试验（TST）,T-SPOT.TB,QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI),体外r-干扰素释放试验, 干扰素检测阴性,干扰素检测阳性,体外r-干扰素释放试验,特异性 只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508) 灵敏度 基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655),体外r-干扰素释放试验,实验效果图,体外r-干扰素释放试验,检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散快速48小时出结果,体外r-干扰素释放试验,阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：感染阶段不同；少数免疫系统功能不全/疾病；实验非正常操作。 阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）,体外r-干扰素释放试验,WHO 2014 潜伏结核感染管理指南建议：1、在HIV感染人群、与肺结核患者密切接触的成人和儿童、开始接受抗肿瘤坏死因子（TNF）治疗的患者、接受透析治疗的患者、准备接受器官或血液移植的患者、以及硅肺患者中开展LTBI系统检测和治疗。检测LTBI建议使用-干扰素释放试验（IGRA）或结核菌素皮试（TST）。2、对于羁押人员、医务人员、来自结核病高负担国家的移民、无家可归者、以及吸毒人员，可以有条件地开展LTBI系统检测和治疗。3、对于糖尿病人、酒精依赖者、吸烟成瘾者、低体重者，如果他们不属于以上1和2的情况，并不建议常规开展LTBI的系统检测。,体外r-干扰素释放试验,LTBI筛查和诊断的建议流程,体外r-干扰素释放试验,Menzies等在2007年发表的一篇纳入8项研究的meta分析论文中指出，IGRA对于普通人群，尤其是曾经接种过卡介苗的人群诊断LTBI具有较高的特异度；但和TST一样，IGRA的敏感度差强人意，两者均不能区别LTBI和活动性结核病 -Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research. Ann Intern Med, 2007, 146: 340-354.,IGRA诊断LTBI的价值,体外r-干扰素释放试验,IGRA诊断活动性结核病的价值 在南非进行的1项募集到491例痰涂阴疑为肺结核患儿的研究中，结合临床资料、胸片以及TST结果诊断肺结核的曲线下面积为85%（95%CI 80% 90%）。该研究最重要的价值在于发现，T-SPOT.TB相对于临床资料、胸片以及TST的综合判断价值而言，并没有增加额外的诊断价值。 Ling DI, Nicol MP, Pai M, et al. Incremental value of T-SPOT.TB for diagnosis of active pulmonary tuberculosis in children in a high-burden setting: a multivariable analysis. Thorax, 2013, 68: 860-866.,体外r-干扰素释放试验,无论是HIV感染者还是非HIV感染者，IGRA的诊断效率与TST相比较均无优势。这些资料清楚地表明，在中低收入国家，IGRA和TST一样对于诊断成人活动性结核病没有任何价值1。另有研究指出，IGRA较低的阳性预测值限制其在中低收入国家成为临床常规检测活动性结核的手段2。实际上，世界卫生组织专家组基于现有的证据明确指出，在中低收入国家不能以IGAR代替常规的微生物诊断方法用于肺结核和肺外结核的诊断3。1.Metcalfe JZ, Everett CK, Steingart KR, et al. Interferon-gamma release assays for active pulmonary tuberculosis diagnosis in adults in low- and middle-income countries: systematic review and meta-analysis. J Infect Dis, 2011, 204: S1120-1129.2.Kang YA, Lee HW, Hwang SS et al. Usefulness of whole-blood interferon-gamma assay and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis. Chest, 2007, 132: 959-965.3.WHO. Strategic and Technical Advisory Group for Tuberculosis (STA