微生物工程教案

第一章 微生物工程概论微生物工程Microbe Engineering课程安排绪论生产菌种的来源优良菌种选育菌种保藏原理和方法微生物的代谢调节和代谢工程培养基发酵工艺控制发酵过程的参数检测和自动控制微生物反应动力学下游处理微生物工程下游加工工程微生物工程生产设备微生物工程生产举例抗生素 氨基酸 柠檬酸 污水的生物处理 参考书目微生物工程，曹军卫，科学出版社微生物工程工艺原理，姚汝华，华南理工大学出版社当代食品生产技术丛书，化学工业出版社生物制药工艺学，吴梧桐，中国医药科技出版社环境工程微生物学，周群英，高等教育出版社第一章 微生物工程概论提纲微生物工程的概念微生物工程的发展简史 微生物工程的应用 微生物工程的概念利用微生物的生长和代谢活动产生的各种生理活性物质来生产商业产品的工程技术。利用生物特性和发酵理论，通过现代化的工程技术手段，进行工业化规模生产，使受培养的微生物或动植物细胞积累所需产品的一门技术学科。是微生物学、生物化学和化学工程学等多学科相结合的交叉性学科。微生物工程的基本内容微生物工程基本上可分为发酵和提纯两大部分发酵部分：菌种的特性与选育，培养基的特性，灭菌理论，发酵机理，发酵动力学，连续发酵控制和自动化理论等；提纯部分（后处理）：细胞破碎，过滤，沉淀，色谱，萃取，蒸发，结晶，干燥，包装等。发酵机理发酵：厌氧或兼性厌氧微生物在厌氧条件(anaerobic condition)下的主要产能方式，在这种方式中，有机物既是被氧化的基质又是最终的电子受体(electron acceptor)。微生物工程的发展阶段自然发酵时期【酿酒、酿醋、制酱等】“蓝色纪念碑”、裴李岗遗址、龙山文化纯培养技术的建立【发明显微镜（1667） 、巴斯德消毒法、纯培养技术】通气搅拌的好气性发酵工程技术的建立【青霉素的发现（1929）和大量生产（1945） 】人工诱变育种与代谢控制技术的建立【用发酵法制造谷氨酸（1956）等氨基酸】微生物工程的发展阶段DNA 双螺旋结构的发现（1953）基因工程的介入发酵连续化、自动化技术的建立【结合数学、动力学、化学工程原理、计算机技术和自动控制理论】微生物酶反应生物合成和化学合成相结合的工程技术的建立【维生素 C 生产】【化学合成：适用于低分子有机物生产；发酵：适用于生产复杂物质和有立体特异性的物质，设备简单，通用性好，但周期长，浓度低】微生物工业的定义与特点微生物工业的定义：又称发酵工业，是利用微生物具有的化学活性进行物质转换，从事各种发酵产品生产的工业。微生物工业的特点：原料广泛，产品丰富在常温、常压下完成，设备简单，通用性好微生物发酵工业的范围酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等）发酵食品工业（酱、酱油、酸乳等）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮等）抗生素发酵工业（青霉素、链霉素等）有机酸发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等）酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等）微生物发酵工业的范围核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸等）维生素发酵工业（维生素 B12 等）生理活性物质发酵工业（生物农药等）微生物菌体蛋白发酵（单细胞蛋白等）微生物环境净化工业（污水处理）生物能工业（沼气、纤维素等的利用）微生物冶金工业（微生物探矿、冶金等）近代微生物工业的发展趋势简单化合物（酒精） 复杂物质（SCP）自然发酵诱变与代谢控制基因工程化学合成生物合成生物与化学合成相结合大型化、连续化和自动化的趋势石油、天然气、纤维素等新原料的采用微生物发酵工业的比拟放大问题比拟放大问题：实验室小型试验(Laboratory-scale)中间试验规模(Pilot-scale) 大型生产规模(Production)（小试 中试 生产）本章知识结构微生物工程的定义与内容微生物工程的发展阶段微生物工业的定义与特点微生物工业的范围近代微生物工业的发展趋势微生物工业中的比拟放大问题预习内容微生物工业菌种的来源生物物质产生菌的筛选过程菌种分离的方法第二章 微生物工业菌种的来源提纲生物物质产生菌的筛选 微生物是生物活性物质的丰富资源 标本采集 标本预处理 菌种的分离 施加选择压力分离法 随机分离法 一、生物物质产生菌的筛选微生物工程工业生产三要素生产菌种生产工艺 (发酵、提取)生产设备菌种筛选流程取样预处理富集培养 初筛 复筛 鉴定保藏、微生物是生物活性物质的丰富资源分布广种类多适应极端环境而进化出许多特殊生理活性物质；在那里筛选？如何筛选？ 目的产物性质； 产生菌分布、特性、生态环境； 高选择性筛选法。 2、标本采集极端环境中存在适应环境压力的菌群(高温、高压、高盐、高 PH、低 PH、深海)土壤中菌种资源最丰富，不同土壤中含微生物种群不同特殊环境中可得到某些特定的类群难降解物、毒物水分解微生物；死虫肠道苏云金杆菌；炼油厂附近土石油分解菌、标本预处理提高分离几率方法物理法（温度、膜过滤）化学法诱饵法（头发、蛇皮、花粉） 二、菌种的分离1.施加选择压力分离法人为控制条件，利于目的菌，不利其他菌（温度、PH、渗透压、氧、碳源、氮源）加抗生素或试剂选择培养基中加入酶作用底物，产酶者长重复使用多种选择压力转种控制限制性基质稀释率的连续培养来富集菌种二、菌种的分离.随机分离法抗生素抑菌圈法稀释法扩散法生物自显影法抗肿瘤药物BIA 法、SOS 法酶抑制剂 “靶酶” 筛选法抗病毒药物检测病毒特有的 DNA 复制酶、核酸合成酶抑制剂生长因子影印法本章知识结构1、微生物是生物活性物质的丰富资源2、标本采集3、 标本预处理 4 、 施加选择压力分离法 5 、随机分离法 预习内容微生物优良菌种的选育微生物优良生产菌种的特征诱变选育菌种的分离杂交选育方法。基因工程技术第三章 微生物优良菌种的选育提纲微生物优良生产菌种的特征自然突变选育诱变选育 原理 基本方法杂交育种细菌 放线菌 霉菌 酵母菌原生质体融合基因工程技术基因表达系统利用大肠杆菌的基因表达系统利用酵母菌的基因表达系统基因工程菌的稳定性优良菌种应具备的特征对菌种的要求生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产 物的产量高，其它代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，不易变异退化安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素优良菌种应具备的特征选择生产菌种应注意的因素1.原料方面 ：广, 转化率高； 2.产物方面 ：目的产物含量高, 副产物少； 3.菌体方面 ：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定 4. 设备方面 ：产泡沫少，适宜大罐生产。 （培育条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强） 一、自然选育利用微生物自然突变进行的菌种选育。原因：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应结果：负变大于正变，应经常分离纯化方法：菌悬液 平板分离 上摇瓶检测选种保藏优点：简单易行，可与生产同步进行。缺点：频率低，10 -810-9 /次分裂。二、诱变选育诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和筛选两个步骤。原理：染色体畸变；基因突变。影响诱变的因素：出发菌株；诱变剂的种类与剂量。诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。初筛复筛确定最佳发酵条件.营养缺陷型突变株筛选酶缺陷，结果造成中间产物积累；解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降） ，末端产物少，中间产物积累。2.抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与不能结合或结合；结合，但不发生作用；结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；营养缺陷型回复突变株筛选3.组成型突变株筛选突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。加诱导酶合成抑制物交替培养法显色反应法.抗（敏感）性突变株筛选包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体抗生素抗性突变：提高产量抗噬菌体突变：消除噬菌体污染条件抗性突变：如温度，可提高产量物敏突变：如氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。三、杂交育种借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换1.细菌的杂交育种方法：转化、转导、F 因子转导、R 因子转移、接合。获部分合子。出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、温敏、发酵性能2.防线菌的杂交育种基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似放线菌的遗传体系和杂交原理异核现象；接合现象；异核系的形成；重组体的形成。放线菌的杂交方法混合培养法；平板杂交法；玻璃纸转移法三、杂交育种.霉菌的杂交育种准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程异核体的形成；杂合二倍体形成；体细胞重组。霉菌的杂交技术：诱变获具标记的亲本异核体的形成；双倍体检出；分离子检出。.酵母菌的杂交育种双单特性：存在单倍体和二倍体的生活史二倍体生活力强，生产能力高，可通过杂交得二倍体来育种。方法：获单倍体细胞；杂交。杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞；单倍体细胞间。四、原生质体融合育种借助原生质融合技术实现遗传物质的交换.原生质体融合的优越性：受限制小； 重组频率高； 遗传物质传递更充分； 可先用理化因子处理； 其诱变率更高。.原生质体融合法：原生质体制备原生质体融合和再生融合子的检出.原生质体融合技术在微生物育种中的应用：选育高产优质菌株产生新的产物五、基因工程育种定向育种，技术含量高，应用面广。应用：解决了一些药物或材料来源困难，或制造技术复杂，或造价昂贵而无法大量生产和应用的问题。 产生了巨大的经济和社会效益。工业生产的意义：基因的表达产量； 表达产物的稳定性；产物的生物活性； 产物分离纯化。（一）基因表达系统从育种的角度考虑,最重要的是目的基因的高效表达。.原核表达系统；.真核表达系统1.原核表达系统原核生物不适宜表达需后加工处理的那一部分真核基因不能切除 mRNA 的内含子；不能进行蛋白质的糖基化；不能对氨基酸进行修饰。大肠杆菌：遗传背景清楚；基因操作简便；易培养，世代短，生长快；适宜大规模生产注意：真核蛋白后修饰； 多为胞内产物；产物分离纯 化困难；内毒素；蛋白酶破坏产物；免疫反应。枯草芽孢杆菌：分泌能力强；胞外蛋白酶强链霉菌：使用安全；分泌能力强；具有糖基化能力2、真核表达系统产生的蛋白质与天然蛋白质具有一致的生理生化功能酵母：真核生物蛋白质的最佳表达系统优点：基因组小，操作方便； 世代周期短， 易培养；有单、双倍体形式；能糖基化；能分泌产物到胞外。应用：干扰素、乙肝表面抗原基因已经成功表达；酿酒酵母研究、应用最广泛。丝状真菌：特点：能进行翻译后加工； 表达产物分泌能力强；安全； 发酵、纯化工艺成熟。（二）利用大肠杆菌的基因表达系统.表达载体条件：能独立复制；有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记，位点位 于起动子后；有很强的起动子，能被大肠杆菌的 RNA 聚合酶识别； 有使起动子受抑制的阻遏子，受诱导时才转录，可人为的通过理化因素选择启动时机；有很强的终止子，使 RNA 聚合酶集中力量转录克隆的外源基因；产生的 mRNA 须有翻译的起始信号，即起始密码AUG 和 SD 序列。.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素目的基因的表达产量与每个细胞平均表达量和细胞浓度正相关。影响因素：外源基因的拷贝数；外源基因的表达频率；启动子的强度；AUG 和 SD 序列的间距；密码子的组成；核糖体结合位点的有效性表达产物的稳定性；细胞的代谢负荷。.在大肠杆菌中真核基因的表达形式融合蛋白： N 端原核序列， C 端真核序列表达高效、稳定，但影响免疫原性，可酶切。非融合蛋白：保持生物活性，但易被水解N 端常带甲硫氨酸，引起人体免疫反应。分泌表达蛋白：使外源基因位于原核蛋白信号肽下游（连接、构建） 。在周质空间酶切，释放产物。（三）利用酵母菌的基因表达系统.载体系统：多用穿梭载体，同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记，在两者中复制、选择。克隆载体的复制序列酵母附加质粒(YEP)酵母复制型质粒(YRP)酵母着丝粒质粒(YCP)酵母整合型质粒(YIP)表达载体在克隆载体中插入酵母表达盒和终止子等调控序列,即可构建酵母表达载体。需糖基化才有生物功能的重组蛋白必须是分泌型蛋白.要在外源DNA 上游加前导肽序列。2.影响外源基因在酵母中表达的因素外源基因的拷贝数：拷贝数，稳定性，整合位置；外源基因的表达频率：启动子：有上游激活序列、TATA 序列、起始密码子；分泌信号：包括信号肽、前导肽序列；终止序列：合成基因须加或利用载体上的；外源蛋白的糖基化：分泌过程中发生 N-糖苷键和 O-糖苷键连接的两种糖基化，其产物与天然产物完全相同宿主菌株的影响：生长力强、内源蛋白酶弱、性能稳定、分泌力强，用二、多倍体。(四)基因工程菌的稳定性分裂不稳定：分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌；结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失。1.产生原因：（常见是分裂不稳定）产不含质粒的子代菌的频率；两种菌的比生长速率。质粒拷贝数低时，可增加，但不宜太高（生长负势 ） 。条件有利，高比生长速率，拷贝数降低，但更稳定。质粒拷贝数过高，增加转录、翻译负担，产物未必增加。2.提高质粒稳定性的方法：两段培养法（先长菌，后表达） ；控制培养条件（温度、PH、培养基组分、溶解氧） 。本章知识结构1、微生物优良生产菌种的特征2、自然突变选育3、 诱变选育 4 、 杂交育种 5 、原生质体融合 6、基因工程技术预习内容菌种的保藏斜面保藏菌种沙土管保藏菌种 第四章 菌种保藏的原理和方法提纲菌种保藏的目的和意义菌种保藏的原理和方法斜面保藏法和穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法液氮保藏法菌种复壮种子扩大培养菌种保藏的目的和意义目的意义：保持优良菌种优良性状的稳定，满足生产的实际需要。优良菌种丢失（退化）的原因：世代短、易变异、易污染、死亡。菌种保藏机构：世界现有 700 多家专门机构。措施：创造条件，使微生物处于休眠状态，减少变异。低营养、低温、干燥、缺氧低代谢、低生长菌种保藏的原理和方法菌种保藏(Culture conservation)原理挑选优良的菌种，最好是休眠体创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）菌种保藏方法斜面(Slant)低温保藏法 传代培养，六个月砂土管保藏法 适用范围广，两年冷冻干燥(Freez-drying)保藏法 长达十年液氮超低温保藏法（130 C） (Liquid nitrogen ultra-low temperature storage) 一、斜面保藏法和穿刺保藏法1.斜面保藏法 ：（短期，3-6 个月） 范围 ：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌 方法 ：适宜培养基适温培养冰箱保藏（4-5） 到期转种 优点 ：设备、方法简单 缺点 ：转代多，易变异；污染机会多 一、斜面保藏法和穿刺保藏法2.穿刺保藏法：（好气菌，6-12 个月）方法：小试管或螺口管1琼脂培养基接种针穿刺培养盖 2-3mm 无菌液体石蜡冰箱保藏范围：细菌、放线菌、丝状真菌优点：范围较广，简便实用缺点：不适用能利用石蜡为碳源的微生物；不同种类，保藏期差异较大。二、沙土管干燥保藏法范围：产孢子的放线菌和丝状真菌，形成芽孢的细菌。方法：沙、土分别洗净烘干、过筛（80-100 目）1-2 1 沙土混合、装管 1cm121灭菌 2-3 次 无菌检验烘干备用孢子或悬液与沙土混匀真空抽干封口（熔封、石蜡封）干燥器中于冰箱 5保藏特点：设备简单，方法较繁，效果较好（长，2年，有长达 10 年） ，但范围受限制。三、真空冷冻干燥保藏法方法：1.安瓶管处理：8-10100-150mm，浸洗、烘干、 盖口；灭菌、干燥（60） 。2.保护剂：减少冷冻干燥对微生物的损伤，常用脱脂牛奶、血清（适当方法灭菌） 。3.菌悬液制备：斜面加保护剂 制悬液吸入安管4.冷冻干燥：快冷至-15- -30 ，抽真空到 66.661Pa，15分钟内；达 13.3322Pa，可升温至 20-30 ；真空封口。5.安瓶管保藏： 4-5 ，5-10 年。 （样品含水量 1-3）四、液氮保藏法方法：浓菌悬液加保护剂装安管 0.2-1cm 封口降温（1/min）至-25 ，入液氮罐，-150 -196 保藏。取出时，应于温水（38-40 ）中震荡 1-2min。特点：效果好（2-3 年，长达 9 年） ，方法简单，保藏对象广泛。五、菌种复壮原理与方法 单细胞分离复壮 改变培养条件复壮 六、种子扩大培养种子(Seed) 扩大培养：将保藏的生产菌种从斜面试管(Tube slant)接出后，进行摇床(Shaker)培养及种子罐(Seeding tank)逐级培养以获得一定数量和质量的纯种的过程，纯种培养物称作种子。六、种子扩大培养种子扩大培养的级数二【三】级发酵：斜面菌种-一级种子摇床培养-二级种子罐培养【-三级种子罐培养】-发酵罐生产 影响级数的因素 微生物自身的生长特性 发酵罐的生产规模 六、种子扩大培养影响种子质量的主要因素 培养基(Culture media) 中的成分配比 种龄(Cell age) 与接种量(Inoculation concentration) 温度 pH 值 通气(Ventilation) 和搅拌(Stirring) 泡沫(Foam) 染菌(Infection) 本章知识结构斜面保藏法和穿刺保藏法 斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法液氮保藏法悬液保藏法低温保藏法预习内容微生物的代谢调节酶活性调节机制；诱导酶和组成酶；酶合成调节的机制。第五章 微生物的代谢调节和代谢工程提纲微生物的代谢调节类型和自我调节酶活性调节酶合成调节分支生物合成途径的调节能荷调节代谢调控次级代谢与次级代谢调节代谢工程微生物的代谢调节和代谢工程原则：经济合理地利用和合成所需的各种物 质和能量，使细胞处于平衡生长状态。方式：反馈抑制、反馈阻遏、酶的诱导调节、酶的共价修饰。生产目的：高浓度地积累人们所期望的产物。办法：育种，得到根本改变代谢的基因突变株；控制微生物培养条件，影响其代谢过程。代谢工程：利用基因工程技术，扩展和构建、连接，形成新的代谢流。 （也称途径工程）一、微生物的代谢类型和自我调节1.代谢类型：分解代谢和合成代谢。相互关联，相互制约。细胞优先合成 异化可维持更快生长的化合物的酶。利用完后，再合成下一个酶。2.微生物自我调节部位：细胞膜的屏障作用（多数亲水分子）和通道；控制通量，调节酶量和改变酶分子活性；限制基质的有形接近，可存在于不同细胞器各个代谢库中，其酶量差别大。二、酶活性的调节代谢调节是指在代谢途径水平上酶活性和酶合成的调节。酶活性调节：激活剂酶激活作用；抑制剂酶抑制作用；可以是外源物，也可是自身代谢物。1、酶激活作用与抑制作用微生物代谢中，普遍存在酶既有激活作用又有抑制作用的现象。如：天门冬氨酸转氨甲酰酶受 ATP 激活，受 CTP 抑制（终产物） 。大肠杆菌糖代谢过程中，许多酶都有激活剂和抑制剂（表 5-1） 。共同控制糖代谢。2、酶活性调节的机制变构调节理论：变构酶基础上提出，酶有催化和变构调节位点。酶的多个亚基，多相同，也可不相同。化学修饰调节理论：变构酶与某物质共价结合而提高或降低活性。如：柠檬酸裂解酶的乙酰化。乙酰-酶+ 柠檬酸柠檬酸-S-酶 +乙酸柠檬酸-S-酶乙酰- 酶+ 草酰乙酸三、酶合成的调节酶活性调节：细，快；酶量调节：粗，慢。1、酶合成的诱导作用诱导酶的合成需要诱导剂，它可是底物，也可是底物的结构类似物。一种酶可有多种诱导剂，其能力与诱导剂的种类和浓度有关。2、酶合成的阻遏某种代谢物积累除抑制酶活性外，还可反馈阻遏酶合成，降低反应速度。末端产物阻遏：常普遍存在与氨基酸、核苷酸生物合成途径中。分解代谢物阻遏：如：“葡萄糖效应” 。其代谢物阻遏“ 缓慢利用能源 ”酶的合成。3、酶合成调节的机制操纵子模型：在 DNA 分子的不同区段上至少有四种基因，即调节基因 R（编码阻遏物） 、操纵基因 O（阻遏物结合、控制结构基因） 、启动基因 P（RNA 聚合酶结合位点）和结构基因S（转录 mRNA） 。操纵基因、启动基因和结构基因又构成了操纵子。 3、酶合成调节的机制单一效应物调节：负调节：调节基因 R 的产物阻止转录进行。如：大肠杆菌乳糖操纵子；正调节：R 基因的产物在诱导物存在下，成为转录激活 剂。如：阿拉伯糖操纵子。两种效应物的共同调节：乳糖操纵子的效应物（如：乳糖）和活化蛋白 （如： CRP）的调节。弱化调节大肠杆菌色氨酸合成操纵子的 R、O、P远离 S，除阻遏调节外，有弱化调节方式。色氨酸存在时，使转录未到终点时，80-90转录停止。是通过弱化子实现的。色氨酸贫乏时，核糖体停在 UGG，2、3 链配对，聚合酶过，酶合成；色氨酸充足时，转录至 UGA（69-71） ，3、4 链配对，不利于 RNA 聚合酶过，酶不合成。四、分支生物合成途径的调节1.同 功 酶 调 节：催化相同反应，但酶分子结构有差异；2.协同反馈调节：一个不能少；3.累加反馈调节：按比例累加，无协同效应，无拮抗作用；4.增效反馈调节：1+12；5.顺序反馈调节：按顺序逐步抑制；6.联合激活或抑制调节：途径产物各自调节，同一中间产物7.酶的共价修饰：一酶两形式，活力有差异，关键在有无共价连接物（腺苷酰基） 。五、能荷调节细胞的能荷计算式：ATP+1/2ADP能荷=ATP+ ADP+AMP能荷高时，ATP 的酶合成系统受抑制，ATP 消耗酶系统被活化。呈抑制与活化的中间状态的能荷大约是0.85，此时两种酶系统达到平衡。六、代谢调控根据代谢调节理论,通过改变发酵工艺条件( 温度、PH、风量、培养基组成 )和菌种遗传特性，达到改变菌体内的代谢平衡，过量产生所需产物的目的。1.发酵条件的控制2.改变细胞透性3.菌种遗传特性的改变1.发酵条件的控制各种发酵条件对微生物的影响同菌种，同培养基，培养条件不同，可获不同代谢产物（途径不同） 。啤酒酵母，用葡萄糖，中性产乙醇，酸性产 CO2，碱性产甘油。使用诱导物可用底物或底物类似物有效增加诱导酶的产量。添加生物合成的前体加前体，避开受抑制酶，大量合成终产物。培养基成分和浓度的控制速效碳、氮源可能引起分解代谢阻遏。应与迟效碳、氮源适量搭配。2.改变细胞透性培养基中加改变细胞透性物质，利于产物分泌，避免反馈抑制。如：1-5ml/L 生物素控制膜中脂质合成；青霉素抑制肽聚糖中肽链交联；土温 80 或阳离子表面活性剂使壁中脂类流出；控制 Mn2+、Zn 2+浓度干扰膜、壁形成；筛选透性突变株。3.菌种遗传特性的改变营养缺陷型突变株；如：利用谷氨酸棒状杆菌营养缺陷型（转氨甲酰酶缺陷）突变株生产鸟氨酸。抗反馈调节突变株；组成型突变株；抗性突变株。七、次级代谢与次级代谢调节主要包括：抗生素、刺激素、生物碱、维生素、色素、毒素等。1.初级代谢和次级代谢初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。生存必需；始终产；不同种，相同；环境敏感性小；酶专一。次级代谢：某些生物为避免某种代谢物积累造成不利作用而产生的一类有利生存的代谢。并非必需，但有一定价值；某一时产；不同种，不同；受环境敏影响大；酶专一性不强。2.次级代谢的调节类型酶合成的诱导调节有些酶也是诱导酶，以底物或底物类似物（内源、外源）为诱导剂。反馈调节次级代谢物的自身反馈抑制和反馈阻遏末端产物反馈调节；生产能力与抑制浓度正相关。分解代谢产物的调节葡萄糖等一些碳、氮源及代谢产物有反馈抑制、阻遏作用。初级代谢产物的调节；A 有共用合成途径，反馈抑制； B 初产物参与次合成，自反馈而影响。磷酸盐调节；A 抑制酶的作用；B 导致细胞能荷变化；C 竞争某些金属离子的作用。八、代谢工程代谢网络理论：将细胞的生化反应以网络整体来考虑，而不是孤立地来考虑。将代谢网络分流处的代谢产物称为节点，对终产物合成起决定作用的少数节点称主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、半柔性和刚性三类。1.改变代谢途径2.扩展代谢途径3.转移或构建新的代谢途径1.改变代谢途径改变分支途径流向，阻断其他产物合成，提高目标产物产量。加速限速反应改变分支途径流向构建代谢旁路改变能量代谢途径2.扩展代谢途径引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端产物；如：2-KLG 合成。引入外源基因后，使原来的代谢途径向前延伸，可利用新的原料。如：啤酒酵母淀粉产乙醇。3.转移或构建新的代谢途径将多基因酶克隆到不产目的产物的菌中，使之获得产目的产物的能力。 （建路）克隆少数基因，使原无关的两条途径联结，形成新途径，产目的产物。 （连路）将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一菌种中，使之发生代谢转移，产目的产物。 （改路）本章知识结构微生物的代谢调节类型和自我调节部位 诱导酶和组成酶 酶活性调节机制 酶合成调节的机制。 微生物其他调节 代谢工程 预习内容培养基不同碳源的利用速度碳氮比例的调节第六章 培养基及其制备提纲培养基的成分能源物质 碳源物质氮源物质 无机盐和微量元素前体物质 促进剂和抑制剂水分淀粉水解糖的制备：酸解法、酶解法、酶酸结合法营养物质的调节不同碳源的利用速度 氮源利用及与碳源利用的关系碳、氮比例的调节 前体的控制 补料培养基的类型培养基灭菌与空气除菌一、培养基的成分培养基 (Culture medium)：选用各种营养物质，经配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质培养基的组成和配比合适与否，对微生物的生长发育、产品的产量、提炼工艺的选择和成品质量都会产生相当大的影响。一、培养基的成分培养基的营养成分及其功能碳源(Carbon source)【糖类、脂肪、有机酸】：能源物质，构成菌体和代谢产物氮源(Nitrogen source)【无机氮源：氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠；有机氮源：发酵菌丝体、酒糟】：构成菌体和代谢产物，硝化细菌的能源物质无机盐类(Mineral nutrition)【Pb 、 Mg 、 S 、 P 、 Fe、Co、Zn 等】：维持酶活力，调节渗透压、pH 值、电位等特殊生长因子【生物素、硫胺素、肌醇等 】：构成辅酶的组成部分，促进生命活动水：溶解营养物质和代谢产物一、培养基的成分培养基的配置原则根据不同微生物的需要配置不同的培养基各种营养物质的浓度与配比，特别是 C/N将培养基的 pH 控制在一定范围内考虑利用价廉且易于获得的原料1.能源物质光能自养微生物：光能如：螺旋藻生产单细胞蛋白 化能自养微生物：氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等无机物如：细菌炼铜异养微生物：碳水化合物、石油、天然气及石化产品2.碳源物质碳源物质是培养基主要成分；占细胞干物质的 50左右，提供能源、碳架、代谢产物。碳源物质的易利用顺序：葡萄糖（单）蔗糖、麦芽糖、乳糖 （双）糊精淀粉其他碳源物质：脂类、有机酸、石油等也能作碳源。糖蜜：蔗糖等的结晶母液，含糖 50-70 ，成分丰富，物美价廉。淀粉水解糖的制备糖化(Saccharify)：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖。糖化的原料：薯类淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等。水解糖液的质量直接关系到生产菌的生长速度与代谢产物的积累，其中的低聚糖类与复合糖类等杂质越低越好。淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备酸解法 反应原理：淀粉 葡萄糖 优点：设备单一、时间短（几分钟） 缺点： 对设备要求高（高温、高压、高腐蚀） 副反应多，淀粉转化率低 对原料要求高，淀粉颗粒大小均匀 淀粉乳浓度不能太高 淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备几种水解方法的比较 从时间上看： 酸解法最快，酶解法最慢 从原料转化率和糖液质量上看： 酶解法 酸酶法 酶酸法 酸解法 3.氮源物质氮源物质是培养基的主要成分之一。提供菌体结构物质，能源（少） ，含氮代谢产物。有机氮源：豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、酵母粉、麦麸、鱼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素等。成分复杂，除含蛋白质、多肽、氨基酸外，还含糖、脂、无机盐、维生素及其他生长因子，对菌体生长非常有利。无机氮源：氨水、铵盐、硝酸盐被吸收、利用快，但成分单一，常作辅助氮源。4.无机盐和微量元素无机盐：酶的激活剂，生理活性物质的组成，生理活性作用的调节剂。主要包括：P、Mg 、S 、Fe、K、Na、Pb、Cl、Zn、Co 、Mn 等。较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用，而高浓度有抑制作用。不同菌种、不同生长阶段需求量不同。小试常加 P、 K 、S 、 Mg、Fe5.前体物质前体物质 (Precursor)：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分。在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。抗生素 (Antibiotin)发酵中常用的前体物质：三、前体物质影响前体物质效力的因素 菌种的特性与菌龄(Cell age) 前体物质的投入量(Inoculation concentration) 前体物质的毒性(Toxicity)6. 促进剂和抑制剂促进剂 Accelerator（刺激剂 Stimulant）并非前体或营养物，可影响正常代谢或中间代谢物积累、或提高次级代谢物的产量的一类刺激因子。作用原理：改变细胞的渗透性，或“ 启动”微生物体内的生产部位，否则这些部位是被阻遏的，因此促进剂的添加可以大大提高产量。常用促进剂：各种表面活性剂 Surfactant（洗涤剂、吐温 80、 EDTA、植酸等） 、大豆油提炼物、甲醇等6. 促进剂和抑制剂抑制剂 (Inhibitor)的作用原理：通过抑制某些合成其它产物的途径而使所需产物的合成得到加强。抗生素生产中的抑制剂：7.水分原生质的重要组分；优良溶剂；（物质进出细胞） 维持大分子结构的稳定；参与生化反应；重要的物理性质：如高比热；高汽化热；高沸点；冰的密度小于水等，保证生命活动的正常进行。其质量对产品质量影响很大。二、营养物质的调节培养基中各营养物的浓度和比例很严格。直接影响菌体的繁殖和产物的积累。尤其是碳氮比。（维持正常渗透压，节约原料也必需）1.不同碳源的利用速度2.氮源利用及碳源利用的关系3.碳氮比例的调节4.前体的控制5.补料1.不同碳源的利用速度不同菌能利用的碳源不同，同一菌种对不同碳源利用速度不同。如：青霉素产生菌利用葡萄糖快（30-40 小时） ，利用乳糖速度慢（6 天） 。一般情况：单糖比双糖快；双糖比多糖快；纯多糖比杂多糖快（淀粉最好） 。快者为速效碳源，慢者为迟效碳源。2.氮源利用及碳源利用的关系不同氮源的利用速度也不同。如：铵盐比硝基氮更容易利用。氨及铵盐等氮源的利用速度常随碳源的利用速度而变。糖代谢中间产物是氨基酸的前体。氨浓度过高或过低，特别是过高，对某些产物（如：青霉素）的形成不利。3.碳氮比例的调节碳氮比能直接影响微生物的生长和发酵产品的积累。碳氮比严格讲指元素比，但通常指原料比。一般情况：产物不含氮，细菌，100:0.2-2.0；酵母菌， 100:20；霉菌，100:10。产物含氮，碳氮比较高。如：谷氨酸生产， 100:15-21。4.前体的控制同前体对不同菌作用不同；不同前体对同种菌作用不同；同前体，同种菌，使用不同，效果不同。一般前体越多，增产越多；但大多毒性也增大。所以应该少量（0.05-0.1 ） ，多次（1 次/12 小时） 。同时要注意前体物质被作为营养物质利用。5.补料补料解决的问题：菌体早衰；料粘，搅拌能耗高，消泡难，溶氧降低，渗透压高。补料有利于：丰富培养基；产物合成旺盛期延长；控制 PH 和代谢方向；补足发酵液体积。补料的目的和方法：限制生长速度，仅维持呼吸，半饥饿状态，利于产物合成；控制好时间、速率和配比。三、培养基的类型培养基的类型分类依据 类型营养物质来源 天然、合成、半合成培养基物理状态 液体、固体、半液体培养基的成分和目的 基本、完全、鉴别、选择生产工艺的要求 孢子(Spore)、种子、发酵培养基的用途：筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产等三、培养基的类型按营养物质来源 1、 天然培养基这是一种利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，人们无法确切知道其中成分。优点：取材方便，营养丰富，种类多样，配制方便。缺点：成分不稳定也不 清楚。三、培养基的类型按营养物质来源2、 合成培养基又称组成培养基或综合培养基。是一类用多种高纯化学试剂配制成的，各成分的量都确切知道的培养基。优点：成分精确，重演性高。缺点：价格较高、配制麻烦。三、培养基的类型按营养物质来源3、半合成培养基 是一种既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。又称半合成培养基。琼脂未经处理的组合培养基也视为半组合培养基。优缺点：成分精确性、重演性、价格、 配制等介于合成培养基和天然培养基之间。三、培养基的类型按培养基物理状态 1 、液体培养基：呈液体状态的培养基。用于：大规模工业生产；实验室摇瓶试 验；微生物生理代谢研究。三、培养基的类型按培养基物理状态2 、固体培养基：用于菌种培养、分离、保存，育种。 A.固化培养基：液体培养基中加入适量凝固剂，如：斜面、平板；B.天然固体培养基：天然固态基质直接配置。如：孢子培养，药用、食用真菌生产。三、培养基的类型按培养基物理状态3 、半固体培养基：介于固态和液态之间（加 0.5%左右琼脂）的培养基。用于菌种鉴定、细菌运动性观察和噬菌体效价测定；厌氧菌培养、保藏。三、培养基的类型按培养基的成分和目的 1、 选择性培养基 ：就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是从混合菌样本中的选取优势菌，从而提高该菌的筛选效率。1)加富性选择培养基：用作加富的营养物主要是一些特殊的碳源或氮源，如甘露醇、纤维素、石蜡油、糖液等。2)抑制性选择培养基：选择性抑制剂有染料、抗生素、脱氧胆酸钠、叠氮化钠等。用于选择性的其他理化因素还有温度、氧、pH 和渗透压等。三、培养基的类型按培养基的成分和目的2、 鉴别性培养基培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即 EMB 培养基。三、培养基的类型按生产工艺的要求 1、孢子(Spore)培养基：固体；营养不太丰富（尤其是氮源） ；适当的无机盐浓度；适当的 PH 和温度；分天然和半合成两种类型。三、培养基的类型按生产工艺的要求2、种子培养基：液体；常用速效 C、N 源；P 较高；PH 稳定；尽量接近发酵培养基。三、培养基的类型按生产工艺的要求3、发酵培养基：液体；营养丰富，完全；C、N 源迟速搭配；应注意 C:N、PH、生长因子、前体等。本章知识结构培养基的成分不同碳源的利用速度营养物质的调节方法碳氮比例的调节 培养基的类型预习内容发酵工艺控制 温度对发酵的影响；氧的传递与传质方程式；影响供氧的因素 第七章 发酵工艺控制提纲温度控制pH 值控制溶氧控制二氧化碳控制泡沫的控制1、温度对发酵的影响对细胞生长的影响：温度升高，从酶反应动力学来看，生长代谢加快，但由于酶很容易热失活，所以高温时菌体易于衰老；对产物形成的影响：菌体生长速率、呼吸强度和代谢产物形成速率的最适温度往往是不同的；温度升高，一般产物生成提前；对生物合成的方向的影响：反馈抑制随温度变化而改变；对发酵液物理性质及溶解氧的影响：影响氧的溶解和传递，影响一些基质的分解，间接影响生物合成。2、影响发酵温度的因素发酵热的成分 生物热：微生物生长繁殖过程中的产热 搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热 蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量 辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量 显 热：空气流动过程夹带着的热量 Q 发酵 = Q 生物 Q 搅拌 Q 蒸发 Q 显 Q 辐射 3、发酵热的测定通过冷却水进出口温度和流量测定：Q 发酵 =Gcw(t1-t2)/VG冷却水流量；Cw水的比热；V发酵液体积。通过发酵液温度随时间上升的速率测定：Q 发酵 =(M1c1+ M2c2)SM1、 c1 发酵液质量、比热；M2、 c2 发酵罐质量、比热；S温度上升速率。4、最适温度选择与发酵温度控制温度变化的一般规律与控制的一般原则 接种后发酵温度有下降趋势，此时可适当升高温，以利于孢子萌发和菌体的生长繁殖； 待发酵液温度开始上升后，应保持在菌体的最适生长温度； 到主发酵旺盛阶段，温度应控制在比最适生长温度低些，即代谢产物合成的最适温度； 到发酵后期，温度下降，此时适当升温可提高产量。 选择是相对的，要考虑培养基成分、浓度；溶氧（温升氧降） ；生长阶段；培养条件等。 4、最适温度选择与发酵温度控制最适温度选择最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同，各阶段可用不同温度。如：青霉素分别为： 30和 24.7 。青霉素发酵的温度控制0-5h ： 30C6-35h ：25C36-85h ：20C86-125h ：25C4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制进行温度控制时应考虑的因素 不同菌种在不同生长阶段的生长和生产特性 参考其它发酵条件（通气、培养基成分和浓度、pH 值等） ，如通气条件差时，则最适发酵温度比通气良好时低。 4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制温度控制的方法 冷却是主要的方法，通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，如果气温较高，冷却水温度也较高时，多采用冷盐水进行降温。 发酵罐的热交换装置： 罐外夹套 罐内蛇管、列管 二、pH 值对发酵的影响及控制发酵液 PH 对菌体生长、繁殖和产物积累影响较大。生产前应进行试验和研究。菌体生长、繁殖和产物积累的最适 PH 不一定相同。整个发酵过程的 PH 是变化的。 1、 PH 对发酵的影响2、影响发酵 PH 的因素3、最适 PH 的选择和调节1、 PH 对发酵的影响微生物生长最适 pH 值范围不同的微生物具有不同的最适生长的 pH 值 细菌 6.5-7.5；放线菌 6.5-8.0；霉菌 4.0-5.8；酵母菌 3.8-6.0产物形成最适 pH 值范围微生物的生长和产物形成的最适 pH 值往往不同少数一致，大多不同；有的偏高，有的偏低。1、 PH 对发酵的影响pH 对微生物生长和产物形成影响的原因：PH 值影响菌体形态，如壁厚薄、长径比； pH 值改变使原生质膜电荷发生改变，影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的排出； pH 值直接影响酶活性； pH 值影响某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。 pH 影响生物合成的途径。 如：黑曲霉 PH=2-3 时产柠檬酸；近中性时产草酸、 葡萄糖酸。2、影响发酵 pH 的因素影响 pH 值的因素：培养基成份、微生物代谢特性决定发酵过程的 PH 变化。 （综合反映）此外，通气状况的变化，菌体自溶和杂菌污染都可能引起发酵液 PH 的变化。微生物改变培养液 PH 以适合自身生长的能力很强。发酵液的实际 PH 是“成分”和“途径” 的统一。确定和有效控制 PH 在菌体生长或产物积累的最适范围是高产的保证。2、影响发酵 pH 的因素生理碱性物质和生理酸性物质生理碱性物质：经微生物代谢后，导致 PH 上升（碱性物质生成或酸性物质消耗）的物质。如：有机氮源，硝酸盐，有机酸。 （产 NH3、NaOH）生理酸性物质：经微生物代谢后，导致 PH 下降（酸性物质生成或碱性物质消耗）的物质。如：糖类（产有机酸） ，脂肪（产脂肪酸） ，铵盐（氧化产硫酸） 。3、最适 PH 的选择和调节最适 PH 的选择和调节的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又可最大限度的获得高产。根据不同微生物的特性，在发酵过程中随时检查 pH值的变化，选用适当的方法进行调节。生长最适 PH 和产物形成最适 PH 的相互关系：两者相同，范围都宽；容易控制。两者相同，范围都窄；必须严格控制。两者相同，范围一宽一窄；必须严格控制。两者不同，范围都窄；分别严格控制。3、最适 PH 的选择和调节选择 pH 值的方法：通过实验确定。配制并始终调节控制不同 PH，检出菌体或产物最大值。 调节 pH 值的方法： 主要考虑培养基中生理酸、碱性物质的配比；补料调节：调节通气量、调整盐类、氮源、碳源的配比平衡；如：青霉素生产的葡萄糖补加控制 PH。（按需补糖比恒速补糖效果好。 ）添加弱酸或弱碱、加缓冲剂。 （一般效果不好） 三、氧对发酵的影响氧是制约发酵进行的重要因素 氧难溶于水，培养基中贮存的氧量很少； 【纯氧溶纯水，1.26mmol/L ；空气氧溶纯水，0.25；培养基更低】 高产株和加富培养基的采用以及发酵周期的缩短 加剧了对氧的需求； 形成产物的最佳氧浓度