复旦大学生化课件噬菌体策略.ppt

第四章噬菌体策略Phagestrategies 一些概念 噬菌体 bacteriophage 感染细菌的病毒 virus 噬菌斑 plaque 噬菌体裂解宿主细胞的斑裂解感染 lyticinfection 细菌被噬菌体感染后致使细菌死亡并释放出子代噬菌体溶源 lysogeny 噬菌体以原噬菌体形式成为细菌基因组中稳定的组分而继续存活原噬菌体 prophage 噬菌体的基因组通过整合 integrate 成为细菌线性染色体的一部分免疫 immunity 原噬菌体可以阻止同类其他的噬菌体感染同一个细胞诱导 induction 原噬菌体通过诱导解除溶源化的限制 1裂解周期 lyticcycle 有些噬菌体只有一种生存方式 strategy 在感染了一个易感宿主之后 破坏了宿主的功能而同时产生大量子代噬菌体颗粒 宿主细菌则裂解死亡一个典型的裂解周期中 噬菌体DNA 或RNA 注入宿主细胞 其基因以一定的顺序转录 并且复制出噬菌体的遗传物质 合成噬菌体颗粒需要的蛋白质成分 最后宿主细菌裂解而释放出组装好的子代噬菌体 噬菌体颗粒 particle 感染 infection 附着 attach DNA被注射进细菌早期发育 earlydevelopment 产生DNA合成酶类DNA复制开始晚期发育 latedevelopment 产生基因组 头 尾DNA包装进头 尾附着裂解 lysis 细胞破裂释放出子代噬菌体 裂解发育的2个时期 早期发育从噬菌体DNA进入到复制开始 主要合成与DNA复制相关的酶 DNA合成 重组和修饰的酶 导致基因组不断的复制和重组晚期发育从复制开始到细胞裂解释放出子代噬菌体 噬菌体颗粒的蛋白质成分被合成 结构蛋白和装配蛋白 噬菌体通常拥有保证使噬菌体DNA优先复制的功能基因 复制起始或新的DNA聚合酶 噬菌体的mRNA被优先转录 改变RNA聚合酶的起始和终止能力或更换RNA聚合酶 噬菌体通常利用宿主的合成机器合成自己的蛋白质 裂解发育的基因表达 早期基因 earlygene 最初阶段必须依赖宿主转录机构表达的基因 噬箘体中为早早期immediateearlygene 中期基因 middlegene 获得早期基因编码的调控蛋白后表达的基因 或称迟早期delayedearlygene 晚期基因 lategene 中期基因编码的调控因子控制的基因 裂解表达的级联控制 噬箘体基因位置组成 遗传图谱 反映了裂解进程的次序 它的操纵子是一个极其有序的结构 编码相关功能蛋白质的基因成簇排列使得调控最为经济 使得裂解的进程能由少数的调控开关控制裂解周期受到正调控 噬菌体的基因只有接受到恰当的信号才被表达 在这个级联反应中 上个步骤合成的蛋白质将是下一个步骤要表达的基因所必须的在每个表达的阶段 一个或多个活跃的基因就是下个阶段所需的调节因子 这些调节因子可以是一种新的RNA聚合酶 改变宿主RNA聚合酶特异性的sigma因子 或是能使之通读的抗终止因子 级联控制的2种途径 转录起始 识别新的噬菌体启动子 用一种 因子取代宿主酶的 因子 spo1 或合成新的RNA聚合酶 新 因子或RNA聚合酶生成后 早期基因表达可被终止抗终止作用 早期基因与下一期基因相邻 由终止位点隔开 如果终止作用被阻止 RNA聚合酶便通读至另一边基因 这样早期基因与晚期基因一起表达 2溶源 lysogeny 另一些噬菌体有两种存在方式 裂解和溶源溶源的结果是原噬箘体整合到细菌基因组上 并与细菌基因一起遗传由于含有一个原噬箘体 溶源菌会对同样类型的噬箘体产生免疫 一个细菌基因组只包含一个拷贝的同一类型的原噬箘体有两种策略的噬菌体可以进行溶源和裂解生活周期的交替 溶原和裂解的相互转化 由裂解周期产生的一个噬菌体进入一个新的宿主细胞后 或者会重复裂解周期 或者进入溶源状态 这取决于感染的状态及噬菌体和细菌的基因型在诱导 induction 的过程中 原噬菌体被切除下来 从而脱离溶源生存方式约束获得自由 产生一个自由的噬菌体DNA 由此进行裂解旁路噬菌体以何种方式繁殖是由转录调节来控制的 噬菌斑 plaque 最初一个噬菌体感染一个细胞 裂解释放的子代噬菌体又感染旁边的细胞 感染的连锁反应呈放射状分布 逐渐形成一个噬菌斑烈性噬菌体形成清晰的噬菌斑温和的噬菌体形成浑浊的噬菌斑 3 噬箘体的表达调控 lambda 噬箘体基因组 48502bp线性双链DNA两端有12碱基的粘性末端 cohesivecos 进入细胞后变为环状DNA DNA环化后 晚期基因在转录时是完整的 噬箘体基因组编码约35个蛋白质 噬菌体的操纵子 早早期基因 PR PL迟早期基因 PR PL裂解晚期基因 PR PL PR 溶源晚期基因 PRE PaQ PI溶源维持基因 PRM 3 1 噬菌体的裂解途径 噬箘体DNA进入一个新的宿主细胞后 裂解与溶源以相同的途径启动第一阶段是利用宿主的RNA聚合酶进行早早期 immediateearly 基因的转录 噬菌体只有两个早早期基因 各自独立地由宿主RNA聚合酶表达 噬菌体的裂解级联反应建立在抗终止作用基础上 早早期基因的表达 从启动子PR向右转录到tR1 可以表达cro蛋白cro蛋白有双重功能 抑制阻遏物的合成 对裂解进行是必需的 关闭早早期基因的表达 在裂解周期晚期已不需要 cro在后面还要详细介绍 从启动子PL向左转录到tL1 可以表达N蛋白pN是一个抗终止子 它作用在nut位点将允许转录过程进入迟早期基因从启动子PR 向右转录到tR 无任何编码序列 抗终止 antitermination 抗终止作用提供了病毒控制从早期基因到下一期基因表达转变的一种机制抗终止作用依赖于基因位置的特殊安排 早期基因与接下来要表达的基因非常接近 由终止子隔开如果终止子位点被抑制 聚合酶越过通读另一边的基因 同样的启动子继续被RNA聚合酶识别新基因的表达只在于伸长RNA链 使之在5 端含有早期基因 在3 端含有新的基因抗终止是正控制 病毒必须先合成早期基因的产物 然后才能表达下一组基因 抗终止依赖特定的位点 噬菌体的pN能分别解除终止子tR1 tL1等的终止作用pN的抗终止作用是高度特异性的 但抗终止事件并不是由终止子tR1和tL1决定的抗终止作用的识别位点在转录单位的上游 是在与作用完成的终止子位点不同的其它区域pN识别位点 nut位点 Nutilizationsite nutL nutR分别决定向左或向右抗终止作用 nut位点 nutL在PL的起始点和N编码区域的开始之间 接近于起始子nutR位于cro基因的末端和tR1之间 接近于终止子qut位于起始子之前这个作用涉及rho 依赖性终止子的抗终止 但是pN也可抑制非依赖终止子的抗终止作用 PR迟早期基因表达 从PR开始的迟早期 delayedearly 转录本表达转录一直到终止子tR3 除了cro外还有cII蛋白 溶源中重点介绍 O P蛋白 噬菌体复制所必需Q蛋白 另一个抗终止因子 Q是晚期基因表达所必需的 PL迟早期表达 除了N蛋白 从PL开始的早期转录本还表达 cIII xis int蛋白 后面溶源中介绍 裂解级联依赖抗终止 早早期宿主RNA聚合酶从PL PR起始转录N和cro迟早期pN允许转录越过N和cro后继续 产生pQ晚期从Q与S间的启动子PR 开始 如果缺少了pQ 晚期转录将在tR3位点终止 转录产物194nt 为6SRNApQ出现后 抑制tR3的终止 6SRNA得以延伸晚期基因的转录不在特定点终止 持续转录所有晚期基因乃至走出这个区域晚期基因左端的转录时也有相似的情形 经过重组功能区后仍继续每个方向上进行的转录可能在聚合酶撞到一块前就终止了 3 2 噬菌体的溶源途径 如果要在E coli中建立溶源 噬菌体必需做到 合成阻遏物噬菌体整合到宿主染色体上既便噬菌体选择溶源途径 早早期基因的表达与裂解途径相同 PR迟早期表达 pN作用下的迟早期转录 从PR开始一直到终止子tR3表达cII 其他蛋白在裂解中起作用 前面已介绍 cII是溶源生长所需的转录激活因子 可以激活3个启动子 PRE PaQ和PIcII不稳定 对蛋白酶敏感cIII能够保护cII防止其降解 pN作用下的迟早期转录 从PL开始的转录表达cIII xis int N蛋白不再介绍 cIII可以保护cII蛋白cII单独存在的半衰期 1min 有cIII时的半衰期 5minXis一般认为是原噬菌体切除所必需的Int一般认为是前噬菌体整合所必需的值得注意的是 这里的xis和int由于sib位点的反向调节 retroregulation 并不表达出蛋白 PL迟早期表达 反向调节 retroregulation 在pN作用下 由PL的转录越过终止子 形成了核酸酶的靶位点sibsib首先被RNaseIII剪切 接着核酸外切酶从3 5 降解mRNAsib是int基因下游的负调节位点 降解由下游向上游进行 故称为反向调节sib突变是阻止了RNaseIII识别靶位点 rnc 的突变具同样效果由PI的转录在tI终止 具终止子结构的mRNA稳定 可以表达蛋白 cII是溶源所必需的 没有或者量不够 都不能进行溶原生长cII是建立溶源所必需的 但维持溶源是不需要的 细胞中cII的水平 与宿主蛋白酶的水平相关HflA和HflB是两类消化cII的蛋白酶 HighFrequencyofLysogenization 基因hflA座位实际上编码3个基因 其中HflC和HflK是消化cII的蛋白酶HflB编码的蛋白酶可以消化cII和s32宿主细胞的蛋白酶水平与生长状态相关 营养丰富的细胞蛋白酶水平高 饥饿的细胞水平低与cII cIII的基因剂量有关感染复数 multiplicityofinfection 10倍的细胞cII半衰期可以长40 50倍野生型的模糊噬菌斑由于不同的moi引起诱导的不可逆性是由于原噬菌体的一份基因不足以重新建立起溶原 CII激活的转录 2020 3 17 39 可编辑 PRE晚期表达 由cII激活的转录 从启动子PRE开始的转录直接表达cI细胞中有cI蛋白的积累 就可以通过与操纵基因OR的结合激活自己的启动子PRM因为从PRE转录的mRNA与cro的mRNA 从PR转录 有一段反义 anti sense 序列 由于编码区是双链RNA而导致cro不能翻译 这属于反义控制 Antisensecontrol PRM和PRE RE repressorforestablishmentoflysogenyRM repressorformaintenanceoflysogeny由PRM起始转录的mRNA缺少SD序列 翻译效率差由PRE起始转录的mRNA较长 有SD Shine Dalgarno 序列 翻译效果好 得到的cI蛋白量比由PRM启动得到的量多6 7倍 PaQ晚期表达 由于自我终止 从PaQ开始的转录产物是一段短的60nt的反义RNA 用于调节Q蛋白的表达它与PR的mRNA的核糖体结合位点 SD序列 互补 抑制Q蛋白的表达由PaQ PRE启动的转录抵消 counteract cro和Q在推动裂解进程中的作用 PI晚期表达 由于PI位于xis的内部 从PI开始的转录终止于tI 只有Int蛋白能表达 适合噬菌体整合为原噬菌体 进行溶源化生长 3 3 噬菌体的表达调控 调控区 基因组内与调控有关的基因和位点集中在cIII到cII范围内调控区内有4个启动子 PR PL PRE 和PRM与乳糖操纵子不同 噬菌体的启动子P与操纵基因O序列相互重叠 且有6个与阻遏物 cI和cro 结合的位点OR3 OR2 OR1 OL3 OL2 OL1PR与OR2 OR1重叠 PL与OL2 OL1重叠 PRM与OR2 OR3重叠每个操纵基因上3个位点和阻遏物的亲和力各不相同 这种差异对裂解或溶原途径起重要的作用 操纵基因 每个操纵基因由17bp组成 之间间隔3 7bp 间隔序列大多为A T6个序列相似 都表现一定程度的回文对称性烈性突变 方框中的突变 减弱了回文对称性 减弱了与cI的亲和力合成的参考序列 有绝对的回文对称性 具最大的亲和力 操纵基因突变 操纵基因突变减弱对称性的突变 结合cI的能力弱 溶原性弱 烈性噬菌体增强对称性的突变 结合cI的能力强 溶源性强 温和噬菌体间隔区突变OR3与OR2之间 cI基因上游第33个碱基对 C G T A 造成PRM启动功能缺陷OL2与OL1之间 N基因上游第31个碱基对 C G T A 破坏了PL的启动功能都发生在间隔区唯一的C G对上 调节蛋白 cI cII和cIII野生型的噬箘体感染 其噬菌斑浑浊而不透明 因为其中包含了一部分溶源未裂解的细胞cI基因突变的结果会阻止溶源 因此噬菌斑只含有裂解的细胞 感染产生了透亮的噬菌斑 clearplaque c 基因cI cII和cIII就是由于他们所涉及的表型而得名cro蛋白controlofrepressorandotherthings 各种 噬箘体突变型的溶原化频率 cI蛋白是阻遏物 cI基因突变 宿主不被溶源化 说明cI的作用是阻遏 噬菌体的活动 与lacI相似 cI的作用不但阻止原噬菌体活动 也阻遏继续感染的 噬菌体的活动 免疫性 具反式功能 蛋白cIts在低温 30 保持溶原 在高温 42 裂解生长 说明cI产物对温度敏感 蛋白质 cI产物作用在 噬菌体的特定位点 imm434 imm21的免疫区被取代 可以在溶原化的细菌中复制繁殖cI蛋白是专一性的 一种噬菌体的阻遏蛋白只作用它本身的免疫区 cI蛋白的结构 cI蛋白是一种酸性蛋白 由2个相同的亚基组成cI蛋白每个亚基236aa 两端各有一个结构域 domain N端富含赖氨酸 Lys 和精氨酸 Arg 9 26 35 与操纵基因结合C端不但聚合为二聚体 并且能使两个二聚体缔合cI蛋白结构分析遗传学分析生化分析 遗传学分析 基因内互补实验 一种 cIts先在34 感染 获得溶原化细菌 再用另一种 cIts去感染 再在42 培养 观察是否裂解互补 不裂解不互补 裂解在N端的突变型和在C端的突变型能够互补同在N端或同在C端的突变型不能互补 生化分析 用木瓜蛋白酶水解cI蛋白 水解点集中在75 150氨基酸位置 N端和C端都不被水解 说明这两个区域折叠起来甲基化分析cI蛋白 N端片段 DNA 用硫酸二甲酯处理 嘌呤甲基化 六氢吡啶溶液中 甲基化的嘌呤断裂 而蛋白保护的DNA片段不断裂N端片段与操纵基因结合的部位和完整cI蛋白与操纵基因结合的部位一样分子量测定 C端片段可以聚合成为低聚物而N端片段不能聚合 cI蛋白对操纵基因的保护 1 OR1DNA中加入cI蛋白的N端2 OR1DNA中加入完整的cI蛋白3 OR1DNA cI与操纵基因的结合 cI蛋白N端与操纵基因的结合 cI蛋白与3个操纵基因亲和力 OR1 OR2 OR3邻近位点上的cI蛋白二聚体由于缔合作用而有协同效应cI蛋白的N端片段不具有协同效应 cI蛋白与操纵基因亲和力 cro蛋白的结构和功能 有66个氨基酸残基cro蛋白与cI蛋白无序列同源性 但功能相似 以二聚体形式和操纵基因结合cro蛋白也能和OR1 OR2 OR3三个位点结合和cI蛋白结合力下降的突变和cro蛋白的结合力也下降cro蛋白与3个操纵基因亲和力 OR3 OR2 OR1没有协同效应 cro蛋白与操纵基因的结合 cro和cI对转录的影响 cro蛋白对cI基因和cro基因的转录都起负控制作用cI蛋白对cro基因的转录起负控制作用 对cI基因本身的转录既有正控制又有负控制cro蛋白和cI蛋白相互竞争 相互制约 的调控存在于