实验：细胞化学染色POX.ppt

细胞化学染色 沧州医专医学技术系侯振江 细胞化学染色 是一种以形态为基础 结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位 定性及半定量分析的方法 用于研究血细胞生理 病理和化学结构 临床上为某些血液病的诊断 鉴别诊断 疗效观察 预后监测和发病机制的探讨 提供重要依据 血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构 反应产物应是有色沉淀物 具有一定的稳定性 血细胞化学染色可显示糖原 脂类 酶 蛋白质等 一 固定固定有物理法与化学法 物理法为干燥和火焰固定 化学法最常用的是甲醛 乙醇 丙酮和醋酸等 血细胞化学染色流程 二 显示1 偶氮偶联法 利用人工合成的酶底物 在酶作用下 产生分解产物 再与重氮盐结合引起偶氮偶联 使其形成不溶性的偶氮色素 以此证明酶的存在 2 联苯胺法 粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢 释放新生态氧 使无色的联苯胺形成蓝色沉淀 3 普鲁士蓝法 细胞内 外铁与酸性亚铁氰化钾作用 形成蓝色亚铁氰化铁沉淀 4 雪夫反应 过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基 醛基与雪夫试剂作用 使无色品红形成红色沉淀 5 金属沉着法其他尚有物理学方法 如脂溶性染料染色 显示脂质 荧光显示 放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断 三 细胞化学定量粗略估量 以染色反应的强弱 受色的深浅 人为地区别为阴性和各种程度的阳性 百分法 只能反映细胞阳性率 不能反映受色强弱 积分法 是常用的半定量法 将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低 又反映了细胞受色的强弱 下面介绍几种常用的细胞化学染色方法这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义 一 过氧化物酶染色 POX 一 四甲基联苯胺法 TMB 原理 粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过氧化物酶 POXorMPO 分解过氧化氢 释放新生态氧 使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺 后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞质内 POX 新生态氧 O 过氧化氢 基质中 四甲基联苯胺TMB 无色 联苯胺蓝 蓝色 亚硝基铁氰化钠 蓝色颗粒 浆内酶部位 粒 单核细胞胞浆 原理 四甲基苯醌二胺 棕色 自我脱氢氧化 试剂 1 TMB亚硝基铁氰化钠饱和溶液1 过氧化氢溶液稀过氧化氢溶液瑞氏染色液 操作 1 取0 1 TMB乙醇溶液lml 加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10 l 混合溶液呈淡棕黄色 2 在新鲜干燥的血片上 加混合溶液0 5ml 放置lmin后 再加稀过氧化氢溶液0 7ml 染色6min 3 瑞氏染液复染15 20min 4 油镜镜检 结果 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性 无颗粒沉着 颗粒细小 分布稀疏 颗粒较粗 局灶分布 颗粒粗大 分布较密 占胞质1 2 2 3 颗粒粗大 呈团块分布 全部胞质均部满颗粒 可覆盖胞核 骨髓片POX染色 临床意义 1 粒系 POX主要分布在粒细胞和单核细胞内 随着粒细胞成熟的程度而逐渐增强 中性分叶核粒细胞为强阳性 嗜酸性粒细胞阳性程度最强 其阳性颗粒比中性粒细胞粗大 有折光 碱性粒细胞为阴性 2 单核细胞 原始单核细胞为阴性反应 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应 颗粒细小 弥散分布 3 其他细胞淋巴细胞 浆细胞 幼红细胞 组织细胞 巨核细胞均呈阴性反应 4 血小板过氧化物酶主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上 可作为原巨核细胞的一种标志物 有助于FABM7的识别 5 过氧化物酶染色主要用于鉴别急性白血病类型 急性髓细胞白血病多呈阳性反应 以M3和M2型反应最强 MI和M5型反应较弱 故有助于区别M3和M5型 急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应 故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标 注意事项 涂片应新鲜制作 厚薄适宜 TMB配制在85 88 的乙醇溶液中染色效果较好 勿用90 95 乙醇 否则细胞表面蛋白质很快凝固 妨碍试剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失 过氧化氢溶液需新鲜配制 其浓度与加入量不能随意更改 涂片中粒细胞看不见阳性颗粒 红细胞呈棕色或绿色 即表示过氧化氢过浓 若过氧化氢加于血片上不产生气泡 则示无效 染色液适宜pH值应为5 5 若pH值 5 0会出现假阳性结果 试剂应置于低温暗处 防止光线照射失效 染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀 否则同一片子上细胞染色情况不一致 AML M1 M1 POX 二 苏丹黑B染色 原理 苏丹黑B sudanblackB SB 是一种能溶解于脂肪中的色素染料 可使细胞内的中性脂肪 磷脂和类固醇着色 即使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出来 试剂 1 10 甲醛液 2 苏丹黑B乙醇溶液 操作 1 干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定 2 自来水冲洗 3 放人染色液中 37 染色30 60min 4 用70 乙醇脱色1 2min 水洗lmin 5 瑞氏染液复染20 30min 结果 脂类呈黑色或棕黑色颗粒 定位于细胞浆中 颗粒很小 细小 稀疏 或胞质局部面积的1 4有致密的颗粒 颗粒较少 或胞质面积的1 2出现黑色颗粒 颗粒较密 或胞质面积的3 4出现黑色颗粒 颗粒极密 颗粒间无间隙 临床意义 1 粒细胞系早幼粒及以下阶段随着细胞成熟 阳性颗粒逐渐增加 早期原粒细胞一般为阴性 少数细小点状颗粒代表线粒体被染色晚期原粒细胞可出现阳性颗粒 其颗粒限于胞浆的某一区域 2 单核细胞系阳性 颗粒细小 分布弥散 形状不规则 原单核细胞为阴性 3 红细胞系 淋巴细胞系均呈阴性反应4 尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性反应 5 苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相似 主要用于急性白血病类型的鉴别 苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感 但特异性不如过氧化物酶染色 极少数急性淋巴细胞白血病可为阳性 M1 SBB M2 SBB 三 过碘酸一雪夫 PAS 染色 原理 胞浆内存在糖原或多糖类物质 如粘多糖 粘蛋白 糖蛋白 糖脂等 中的乙二醇基 CHOH CHOH 经过碘酸 periodicacid 氧化 转变为二醛基 CHO CHO 与雪夫 Schiff 试剂中的无色品红结合 形成紫红色染料而沉积于胞浆中 该反应称为过碘酸一雪夫 PAS 阳性反应 结果 1 粒细胞系 原粒细胞多呈阴性反应 也可弱阳性 自早幼粒细胞以后随着细胞的成熟程度 阳性反应逐渐增强 嗜酸粒细胞颗粒本身不着色 但颗粒间的胞质呈弥漫性阳性反应 嗜碱粒细胞为阳性反应 颗粒紫红色 大小不一 中性粒细胞糖原含量参考标准 胞质无颗粒 胞质呈淡红色 无颗粒 胞质呈红色 有少量颗粒 胞质呈暗红色 颗粒较密 胞质呈紫红色 颗粒极密 过碘酸 Schiff反应 PAS 2 淋巴细胞系 大多数淋巴细胞呈阴性反应 少数为 的阳性反应 淋巴细胞糖原含量程度参考标准 胞质内无颗粒 胞质内有颗粒 有较粗红色颗粒 有粗大红色颗粒 颗粒粗大并有红色块状 3 红细胞系 幼红细胞和红细胞呈阴性反应红细胞系列糖原含量程度参考标准 胞质无颗粒 有少数红色颗粒 有较粗红色颗粒或弥漫红色 有粗大红色颗粒或深红色 有粗大红色块状或紫红色 4 巨核细胞 巨核细胞和血小板染色反应均为阳性巨核细胞糖原含量程度参考标准 胞质无颗粒 少量糖原包涵体 中等量糖原包涵体 定位于核膜出或分散胞质中 占胞质1 3 大量糖原包涵体分散于胞质的1 2 糖原包涵体充满整个胞质 PAS巨核细胞 巨核细胞包涵体 5 单核细胞呈阴性或阳性 颗粒细小 往往位于胞质边缘 浆细胞大多呈阴性 少数为红色颗粒阳性 组织细胞为阴性反应 巨噬细胞可呈阳性 为红色颗粒反应 临床意义 1 M6与巨幼贫的鉴别M6的幼红细胞PAS可呈强阳性 积分明显增高 巨贫 再障 溶贫时PAS反应为阴性 2 急性白血病的类型鉴别ALL PAS呈大块状阳性 也可是阴性 AML为阴性 急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性 积分增高 阳性颗粒小而多 呈弥散分布 ALL L1 L1PAS AML M5 M5PAS AML M6 AML M6PAS AML M7 M7PAS 3 巨核细胞和Sternberg细胞鉴别巨核细胞PAS强阳性 Sternberg细胞为阴性或弱阳性 4 戈谢氏细胞强阳性 尼曼 皮克细胞阴性或弱阳性 5 淋巴肉瘤 霍奇金病等 淋巴细胞的糖原积分增高 一般的病毒感染 糖原积分在正常范围内 四 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 偶氮偶联法 Kaplow法 原理 中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH9 2 9 8缓冲液中 能水解磷酸萘酚钠 并释放出磷酸与萘酚 再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中 结果 坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒 坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀 一 阴性反应 胞浆中无阳性染色颗粒 胞浆中含有少量颗粒或呈弥散浅红色 或弥散紫色 2 胞浆中含有中等量颗粒或弥散受色 3 胞浆中有丰富的颗粒或弥散深色 胞核清晰 4 有极丰富的粗大颗粒 充满胞浆 或弥散深色 胞核不清晰 中性粒细胞碱性磷酸酶 NAP 偶氮偶联法 NAP积分法计数100个成熟中性粒细胞 按其反应强度分级 各级百分率与其级数乘积的总和 即为积分 例如 NAP反应结果 204020155积分 0 20 2 20 3 15 4 5 145参考值 正常人血细胞碱性磷酸酶除成熟中性粒细胞 杆状核及分叶核 可见阳性外 其他血细胞均为阴性 中性粒细胞NAP活性积分值一般为10 50分 但有时可高达162分 临床意义 1 生理变化 新生儿NAP增高 成人较儿童减低 老人更低 激烈运动增高 月经期经前增高 行经后降低 经后期恢复正常 妊娠期2 3月轻度增高 以后逐渐增高 分娩时达到高峰 产后恢复正常 2 病理变化增高 严重化脓性感染 类白血病反应 AA CML加速期 ALL CLL 恶性淋巴瘤 癌转移 MM 真红 骨髓纤维化等 减低 PNH CML 恶性组织细胞病 MDS 3 疾病鉴别诊断慢粒与类白的鉴别 CML减低 类白增高 急性白血病的鉴别 AML减低 ALL增高 PNH与AA鉴别 PNH减低 AA增高 病原微生物的鉴别 病毒感染减低 细菌感染增高 NAP CML NAP 五 骨髓铁染色 原理 正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中 骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用 形成普鲁士蓝反应 形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀 定位于含铁的部位 从而反映骨髓中铁的储存量 化学反应过程为 4Fe3 3K4 Fe CN 6 Fe4 Fe CN 6 3 12K 含铁物质 亚铁氰化钾 亚铁氰化铁 结果 1 细胞外铁的观察 细胞外铁呈蓝色的颗粒状 小株状或团块状 以油镜观察定级标准 无铁粒可见 少数铁粒或铁小珠 较多铁粒和铁小珠 很多铁粒 铁小珠和少数小块 极多铁粒 铁小珠并有很多小块 密集成堆 正常范围 占2 3 占1 3 细胞外铁 2 细胞内铁观察 细胞内铁指有核红细胞胞质内出现蓝色颗粒 以油镜计100个中 晚幼红细胞 记录胞质中含有蓝色小颗粒 即铁粒红细胞 的比值 并根据细胞铁颗粒的数目 大小 染色深浅和颗粒分布情况 将铁粒幼红细胞分为如下四型 型 仅含1 2个铁颗粒 型 含3 4个铁颗粒 型 含6 9个以上铁颗粒 型 10个铁颗粒 正常范围 30 90 平均60 多见 型 少见 型 无 型 细胞内铁 3 环形铁粒幼红细胞 指含铁颗粒 6个 其中2 3以上铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整环形 正常或非铁粒幼细贫血无环形铁粒幼细胞 铁粒幼细贫血中环形铁粒幼细胞 6 环形铁粒幼细胞 临床意义 1 缺铁性贫血时 骨髓细胞外铁明显减少 为 一 士 细胞内铁平均