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葡萄糖醛酸酶的研究进展葡萄糖醛酸酶的研究进展 摘摘 要 要 葡萄糖醛酸酶是木聚糖类半纤维素完全降解过程中必不可少的重要 酶 它在构建彻底降解半纤维素的基因工程菌和半纤维素酶制品的应用开发方 面的生物技术潜力正在越来越受到人们的关注 本文从木聚糖的结构着重介绍 葡萄糖醛酸酶的作用机理 酶活分析 酶纯化和基因克隆的研究进展 关键词 关键词 木聚糖 葡萄糖醛酸酶 作用机制 基因重组技术 木聚糖类半纤维素是仅次于纤维素的第二个重要的异源多糖 它以其数量 大 组分易提取成为最具潜力的可再生资源 1 因此 各国政府都不断投入对 木聚糖类半纤维素酶的研究 尤其是石油危机引起的价格战更促使了人们对半 纤维素发酵生产燃料乙醇的研究 我国科学工作者在半纤维素酶方面已经进行 了深入研究 并在食品加工 饲料 纸浆溶解及纸浆漂白上取得了可喜成绩 但主要是集中在内切木聚糖酶的研究上 1 我国是一个农业大国 每年有大量 的秸杆成为环保负担 而秸杆中约 94 的半纤维素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚 糖 1 如果将其生物降解为木糖和少量其它单糖 可以用作基本碳源生产各种 发酵产品 如有机酸 氨基酸 单细胞蛋白 糖醇 工业酶类 溶剂或燃料 但是 彻底降解木聚糖需要由多种水解酶组成的酶系统的协同作用 这个木聚 糖降解酶系是由内切木聚糖酶 木糖苷酶 阿拉伯呋喃糖苷酶 葡萄 糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶组成的 葡萄糖醛酸酶在开发木聚糖类半纤维素 中起着非常重要的作用 它的生物技术潜力正越来越受到人们的关注 目前 有关 葡萄糖醛酸酶的研究在国内还未见报道 本文将从木聚糖类半纤维素的 结构 酶作用机制介绍有关 葡萄糖醛酸酶及其基因的研究进展 1 木聚糖的结构木聚糖的结构 木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素 它是一个以 1 4 糖苷 键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基像乙酰基 阿拉伯糖基 4 O 甲 基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的 2 为了保证植物细胞壁的刚性 木聚 糖则与细胞壁聚合物果胶质和木质素相连接 其中阿魏酸与果胶质和木质素中 的酚酸残基形成共价键 并通过阿拉伯糖基连到木聚糖主链上 细胞壁的木质 素与 4 O 甲基葡萄糖醛酸之间则通过 4 O 甲基葡萄糖醛酸以酯键连接到木聚糖 主链上 3 大多数硬木半纤维素是 O 乙酰基 4 O 甲基葡萄糖醛酸木聚糖 它是一条约 70 个 木糖吡喃型残基通过 1 4 糖苷键相连的木聚糖主链 平均聚合度在 150 200 之间 平均每 10 个木糖残基就由 1 2 键连上一个 4 O 甲基葡萄糖 醛酸取代基 硬木木聚糖被高度乙酰化 每十个木糖单位的 C 3 和 C 2 位置上 带有 7 个 O 乙酰 用碱抽提木聚糖时 这些乙酰基很容易去除 4 软木和禾本科植物半纤维素中的木聚糖主要是阿拉伯糖 4 O 甲基葡萄糖醛酸 木聚糖 平均聚合度在 70 80 之间 平均每 6 个木糖单位带有一个 4 O 甲基 葡萄糖醛酸取代基 每 8 9 个木糖残基带一个 L 阿拉伯呋喃糖单元 与硬木 半纤维素相比 是未乙酰化的 2 4 秸杆半纤维素就属于此类 2 葡萄糖醛酸酶在木聚糖水解中的作用机理葡萄糖醛酸酶在木聚糖水解中的作用机理 由于异源木聚糖是高度分支的多糖 其主链和侧链含有不同的侧枝 主要 有乙酰基 阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸基等 当内切木聚糖酶随机作用木聚糖时 便受到这些基团的空间阻碍 而不能到达所作用的木糖苷键 所形成的产物只 能是带侧枝的低聚糖 因此 木聚糖的完全降解需要多种水解酶的协同作用 它包括主链水解酶 1 4 内切木聚糖酶 木糖苷酶和侧链水解酶 L 阿拉 伯呋喃糖苷酶 葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶 如图 1 4 这些酶的协 同作用 将木聚糖转化为它的组成分糖 葡萄糖醛酸酶 EC3 2 1 水解甲基葡萄糖醛酸 O MeGlcA 与葡萄 糖醛酸木聚糖主干上木糖残基间的 1 2 键 该键对酸水解很稳定 木聚糖中 的葡萄糖醛酸通常被甲基化为 O MeGlcA 自然界中的硬木 软木和禾本科 植物木聚糖中都存在着这种 1 2 糖苷键连接的 O MeGlcA 取代基 当主链 水解酶与木聚糖底物结合时 O MeGlcA 侧枝阻碍酶到达所作用的糖苷键 从而降低木聚糖的水解效率 Shao W 等报道 如果 葡萄糖醛酸酶与内切木 聚糖酶同时存在时 它们相互促进 加速低聚糖的产生 同时低聚糖也需要经 葡萄糖醛酸酶去除 4 O 甲基葡萄糖醛酸侧枝后才能被 木糖苷酶彻底降解 作用 5 因此 葡萄糖醛酸酶是木聚糖降解酶系中非常重要的一员 葡萄 糖醛酸酶的底物专一性依据酶源而不同 该酶的水解作用需要低分子质量的葡 Endoxylanase 内切木聚糖酶 Xylosidase 木糖苷酶 Glucuronidase 葡萄糖醛酸酶 Arabinofuranosidase 阿拉伯呋喃糖苷酶 Acethy Xylan Esterase 乙酰木聚糖酯酶 图 3 木聚糖降解酶系的木聚糖降解作用 Fig 1 xylan degradation of xylanolytic system 萄糖醛酸木聚糖为底物 它们能够从木聚糖内切酶水解产生的低聚木糖释放 4 O 甲基葡萄糖醛酸 葡萄糖醛酸酶只对聚合度 DP 大于 2 的取代低聚木糖有 效 4 3 葡萄糖醛酸酶活性分析方法葡萄糖醛酸酶活性分析方法 用于 葡萄糖醛酸酶活性分析的底物主要有 4 D 甲基葡糖醛酸基木二糖 木三糖 O MeGlcAX2 O MeGlcAX3 4 D 甲基葡糖醛酸基木糖醇 O MeGlcA xylitol 糖醛二酸糖醛三酸混合物和 O MeGlcA 取代的低聚糖混 合物 6 人工合成 p 硝基苯 葡萄糖醛酸被用于检测酶活性 但是 由于有些 微生物的 葡萄糖醛酸酶只对天然底物显示活性 而对人工生色底物不能分解 因此 到目前为止 该酶活性的测定还不能用人工生色底物替代 葡萄糖醛酸酶活性测定是利用带有糖醛酸的低聚木糖 4 O MeGlcAX2 4 与 葡萄糖醛酸酶反应 结果产生的 4 O MeGlcA 使得还原糖 增加而显示出其活性 最早采用的方法有气液色谱 薄层层析和硼酸盐复合物 离子交换色谱对酶降解产物的分离 其中 离子交换色谱是在 NaOH 培养基检 测 葡萄糖醛酸酶活性的有效工具 但是 该法操作比较繁琐 现在 葡萄 糖醛酸酶活性测定是利用酶降解下产生的 4 O MeGlcA 与砷钼酸钠的进行显色 表表 1 不同微生物的不同微生物的 葡萄糖醛酸酶的性质和基因葡萄糖醛酸酶的性质和基因 Table 1 Characteristics and gene of glucuronidase from microorganism Organism 生物种类 PI 等电点 M wkDa 分子质 量 optimum pH temp activity on 活性reported gene 报道基因 reference 参考 oligomers polymers 低聚物 聚合物 Agaricus bisporus2 6 2 9160 3463 3 3 8n d 10 Trichoderma reesei5 0 6 2914 5 6 0n d 11 18 Thermoascus aurantiacus n d 118 1074 565 12 Aspergillus tubingenis 5 2107 1004 5 6 070 13 8 14 Thermoanaerobact erium sp 4 7 74 1305 460 5 Clostridium stercoraium 4 31485 5 6 540 15 Schizophyllum commune 3 61254 5 5 5 7 Thermotoga maritima Thermoanaerobact eriumsaccharolytic um Trichoderma viride B stearothermophil us Phanerochaete chrysosporium Aspergillus niger 5 16 4 7 4 3 n d 4 6 5 3 76 140 78 71 142 100 112 130 150 6 3 5 5 6 5 5 0 3 5 4 8 85 n d n d 3 15 16 17 14 8 为稍有酶活性 为有酶活性 为无酶活性 为基因已被克隆 n d 为不确定 反应 最后在 600 660 nm 下用分光光度计测其吸收峰值 3 此法虽然较早期的 测定方法有了很大改进 但由于酶活性分析的 4 O 甲基葡糖醛酸基木二糖标 准底物的纯品难以获得 因此 目前所报道的 葡萄糖醛酸酶的研究 其酶活 测定所用底物各不相同 结果不同生物之间的该酶活性很难进行比较 6 7 目前 人们正在利用一种新型合成底物或通过检测转化产物的结构研究 葡萄糖醛酸 酶的底物专一性 8 4 葡萄糖醛酸酶的纯化和基因克隆葡萄糖醛酸酶的纯化和基因克隆 由于 葡萄糖醛酸酶在自然界出现不多 而且活性不高 因此直到 1986 年该酶才有报道 迄今为止 葡萄糖醛酸酶是木聚糖侧枝分解酶中报道最少 的 目前 只有少数几个酶被纯化和定性 经过基因克隆和分析的就更少了 见表 1 纯化的 葡萄糖醛酸酶是分子质量为 100 kDa 左右的大分子蛋白 质 采用的纯化技术主要为阴离子交换柱层析 疏水作用层析和凝胶过滤 第 一个 葡萄糖醛酸酶是从嗜热真菌 Thermoascus aurantiaus 中利用 DEAE Sephadex 离子交换柱层析和凝胶过滤纯化的 9 该酶能以相同的速度从聚合木 聚糖和低聚糖释放 4 O MeGlcA 目前所研究的 葡萄糖醛酸酶大多数只能作 用 4 O MeGlcA 取代的低聚糖或小型底物 因此 大部分 葡萄糖醛酸酶需要 同水解主链的木聚糖酶一起协同作用以便从木聚糖释放出相当量的 4 O MeGlcA 但是 Thermoanaerobacterium sp Aspergillus tubingenis 和 Phanerochaete chrysosporium 中的 葡萄糖醛酸酶对聚合木聚糖也有少量活性 来自 T aurantiaus 中的是这些纯化酶中对聚合木聚糖作用活性最高的 16 第一 个从细菌中纯化的 葡萄糖醛酸酶是来自嗜热厌氧细菌 Thermoanaerobacterium sp JW SY485 它是通过阴离子交换柱层析和疏水作用 层析纯化得到的 该酶存在于细胞内 对于低聚木糖上的葡萄糖醛酸侧枝有较 高的活性 5 有关 葡萄糖醛酸酶的基因是木聚糖降解酶系中报道最少的 目前 在 真菌和细菌中只有四个 葡萄糖醛酸酶及其基因进行了分子水平的研究 T Reesei 中编码 葡萄糖醛酸酶的基因 glr1 是第一个被克隆和定性的 18 它是 EmlilioMargolles clarky 从以 ZAP 为载体构建的 T ReeseiRut 30 的 cDNA 表 达文库中 通过 葡萄糖醛酸酶的多克隆抗体筛选到的 核酸序列分析表明 含有一个 2541 bp 的可读框架 ORF 编码一个 847 个氨基酸的蛋白质 一个 假定信号肽序列的切割位点被确定在距离起始密码子的 19 个氨基酸处 成熟蛋 白有 828 个氨基酸 与 Siika aho 等人报道的纯酶分子质量 91 kDa 相同 氨基 酸序列上有 8 个糖基化位点 Ruile P 等从 Thermotogo maritimn MSB8 基因文库 中 通过 葡萄糖醛酸酶活性筛选法得到 6 5kb 的基因组 DNA 并对其进行 核酸序列分析 缺失实验及在大肠杆菌中表达 最后分离到一个编码 674 个氨 基酸的 葡萄糖醛酸酶基因 重组酶的凝胶过滤纯分子量大于 630 kDa 最适 pH6 3 最大活性温度为 85 3 接着 De Vries R P 等从 A tubigensis 2 菌中纯 化到一个胞外 葡萄糖醛酸酶 14 经内切蛋白酶处理和反相 HPLC 分离后 得到 7 个末端和中间肽并对其进行 N 端测序 根据测得的氨基酸序列设计合成 九条简并引物 分别以 A tubigensis 基因组 DNA 为模板进行 PCR 获得一个 1 142 bp 的 葡萄糖醛酸酶基因的部分片段 然后以该片段作探针从 A tubigensis 的基因组文库中筛选到 葡萄糖醛酸酶的完整基因 该基因含有一 个 2523bp 的阅读框 编码着 841 个氨基酸的蛋白质 并含有一个 20 个氨基酸 的真核信号肽 最近 Choi I D 等又从 B sterothermophilus 中克隆到 葡萄糖 醛酸酶基因并测序 17 他们是根据 B sterothermophilus T Maritima 和 A tubingensis 3 个菌中的 葡萄糖醛酸酶基因的保守序列设计合成了两个简并引 物 经 PCR 扩增到一个 638 bp 的 PCR 产物用作探针 通过 Southern 杂交筛选 到一个带有 葡萄糖醛酸酶基因的克隆子 该基因含有一个 2073 bp 的开放阅 读框 编码 691 个氨基酸多肽 17 由氨基酸序列分析 T reesei 的 glr1 T maritima B sterothermophilu 和 A tubigensis 的 aguA 相互间具有明显的同源性 属于糖基水解酶第 67 族家族 5结结 语语 木聚糖类半纤维素是自然界大量存在的异源多糖 如果将其充分降解和有 效转化将为人类带来不可估量的效益 但是 完全降解木聚糖需要由多种水解 酶的协同作用 它包括内切木聚糖酶 木糖苷酶 阿拉伯呋喃糖苷酶 葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶 其中 葡萄糖醛酸酶是这个降解酶系中 很重要的一员 无论是硬木 阔叶树 还是软木 针叶树 和禾本科植物中的 木聚糖都含有 葡萄糖醛酸和 4 O 甲基葡萄糖醛酸侧枝 这些侧枝在木聚糖 的降解过程中阻碍木聚糖酶的作用 目前的研究表明 葡萄糖醛酸酶作用的 底物是木聚糖酶和 木糖苷酶相互协同作用产生的低聚糖 但是低聚糖需经葡 萄糖醛酸酶去除 4 O MeGlcA 侧枝后才能被木糖苷酶彻底降解 因此 葡萄糖 醛酸酶对木聚糖类半纤维素完全降解是极其重要的 目前 本实验室主要从事 以下几方面的研究工作是 1 研究能分解利用半纤维素的微生物 重点是 具有降解木聚糖类半纤维素微生物 2 将编码木聚糖类半纤维素酶的基因 转入现有的发酵工程菌以获取各种半纤维素酶制品 3 用基因重组技术构 建能分解利用半纤维素的发酵工程菌 其中本实验室正在研究的能有效利用半 纤维素生产乙醇的工程菌是国家自然基金资助项目 有望在秸杆半纤维素的综 合利用上取得突破性成果 葡萄糖醛酸酶是这些研究课题中必不可少的重要 酶类 由于它能协同其它木聚糖降解酶完全降解木聚糖类半纤维素 因此 开 发该酶在食品加工 饲料工业和纸造纸业等方面的应用价值将具有广阔的市场 前景 参参 考考 文文 献献 1 邵蔚蓝 薛业敏 以基因重组技术开发木聚糖类半纤维素资源 J 食品与 生物技术 2002 21 1 88 93 2 杨淑蕙 邱玉桂 谭国民 等 植物纤维素化学 M 第三版 北京 中国轻 工业出版社 2001 6 3 Ruile P Winterhalter C Liebl W Isolation and analysis of a gene encoding glucuronidase an enzyme with a novel primary structure involved in the breakdown of xylan J Mol Microbiol 1997 23 267 279 4 Sunna A Autranikian G Xylanolytic enzymes from fungi and bactera J Crtical Revieas in Biotechology 1997 17 1 39 67 5 Shao W Obi S K C Puls J et al Purification and characterization of the glucuronidase from Thermoanaerobacterium sp Strain JW SL YS485 an important enzyme for the utilization of substituted xylans J Appl Environ Microbiol 1995 61 1077 1081 6 Visser J Beldman G Kustersvan Someren M A et al Xylans and Xylanases M Elsvier Science Publishers B V 1992 213 224 7 Maija T Matti S A An glucuronidase of Schizophyllum commune acting on polymeric xylan J J Biochem 2000 78 149 161 8 Uchida H Nanri T Kawabata Y et al Purification and characterization of intracellular glucuronidase from Aspergillus niger 5 16 J Biosci Biotech Biochem 1992 56 1608 1615 9 Khandke K M Vithayathil P J Murthy S K Purification and characterization of the glucuronidase from a thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus Arch Biochem Biophysics 1989 274 511 517 10 Korte H Reinigung and chracteririering einer glucuronidaseaus Agaricus bisporus Lge Sing and Untersuchungen an substituierten xylooligomeren D Univercity of Hamburrg Germany p 159 1991 11 Siika aho M Tenkanen M Buchert J et al An glucuronidaseaus from Trichoderma reesei RutC 30 j Enzyme Microb Technol 1994 16 813 816 12 Khandke K M Vithayathil P J Murthy S K Purification and characterization of the glucuronidase from a thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus Arch Biochem Biophysics 1989 274 511 517 13 Poutanen K Zargaha C H M de Vries et al Glucuronidaseaus Aspergillus and their production by cloning and uses P PCT Int Appl WO97 43423 1997 14 De Vries R Poulsen C H Madrid S et al ageA the gene encording an extracellular glucuronidaseaus from Aspergillus tubingensis is specifically induced on xylose and not on glucronic acid J J Bacteriol 1998 180 243 249 15 Bronuenmeier K Meissner H Stocker S et al glucuronidase from the ylanolytic thermophililes Clostridium stercoraium and Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum J Microbiol 1995 141 2033 2040 16 Ishihara M Inagakim N Shimizu K 4 O methyl D Glucuronic acid rediuse liberating enzyme in the enzymatic hydrolysis of hardwood xylan J Bull For Pro Res Int 1990 359 141 157 17 Choi I D Kim H Y Choi Y J Gene cloning