转基因动物及其在医学中的应用.doc

转基因动物及其在医学中的应用转基因动物是指通过加减特定的DNA片段而改变了基因构成和性状的动物，也可以认为是指体内基因组中稳定地整合有外源基因的动物。该项技术始于80年代初，很快便成为研究动物基因表达特性及其功能的重要手段，在基因表达的调控机制等方面的基础理论研究、家畜家禽的遗传性状改造、培育能为人类提供器官移植材料的家畜、培育人类疾病的模型动物、作为生物反应器主产工业和医学所需要的珍贵生物活性蛋白等方面被广泛应用。本文主要对其在人类医学方面的应用现状及前景作以论述。1 转基因动物的制备技术用以培育转基因动物的技术叫做转基因技术或基因转移。其总体过程是：首先从某种动物分离目的基因或人工构建该目的基因，把该目的基因在体外进行重组和扩增，然后再把加工好的目的基因设法导入另一个同种或异种动物受精卵的原核内(或细胞质内)，使其稳定地整合到受体细胞的基因组中，最后使该受精卵发育成携带外源目的基因的个体，即产生了转基因动物。目前常用的转基因技术主要有：1)原核内显微注射法 是将在体外构建的目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵的原核中，让这种外源基因通过某种方式整合到受体细胞的基因组中去，以实现转基因的目的。2)转染技术 主要以RNA病毒或DNA病毒为载体，在体外将目的基因或连同启动子等序列一同重组到病毒的核酸载体上。再让该病毒感染受精卵或胚胎于细胞，利用载体病毒具有主动整合到受体细胞基因组中去的特性，让其连同所携带的目的基因等也一同整合到受体细胞的基因组上去。90年代后又出现了两种较新的方法，即基因剔除和基因楔入技术。3)细胞载体技术 主要使用胚胎干细胞(ES)作为操作对象。胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离得到的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，一旦回复到适当的环境条件下即可形成胚系集落。可以用转基因技术将外源目的基因转移到胚胎干细胞中，通过同源重组或转换的方法使外源基因整合到胚胎干细胞的基因组中。而且，还可以根据由于外源基因的插入所产生的基因表达方面的改变，来对胚胎干细胞进行预筛选，从而大大提高转基因的成功率。被转基因后的胚胎干细胞经鉴定后可被移植到正常发育的囊胚中，再将囊胚导入假孕的代理母亲子宫内发育而产生出嵌合体动物，然后与正常的雄性动物交配即可获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。目前还有用快速分裂的哺乳动物乳腺肌上皮细胞或小鼠精子作为细胞载体。2 转基因动物在医学中的应用21 转基因动物在生物制药方面的应用 生物制药的主要目标是比较经济地生产能够从容易获取的流体(如培养发酵液、乳汁、尿或血液)中提取的贵重人用(或兽用)治疗蛋白。而用转基因动物进行生物制药，尽管可以从动物的尿或血液中获取药用蛋白，但是，目前来看，最好的途径是从大动物的乳汁中来获取。不但乳汁的产量特别高，而且乳汁中的蛋白含量也高(依动物不同约在3060g/L)，乳汁不进入体内循环，其中所表达的外源蛋白质不会影响到转基因动物本身的生理代谢过程；另外，从乳汁中提纯蛋白相对要比从其他液体中提纯更为容易，而且在乳汁中所表达的蛋白已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。甚至有时还可直接应用乳汁作为治疗所需的终产品。因此，人们将转基因动物的乳腺称为生物反应器。从乳汁生产来考虑，首选动物一般是牛、山羊、绵羊、猪和家兔。上述生物制药工艺的第一步就是构建能在转基因动物乳腺定位表达所需蛋白质的DNA构建物。此构建物通常含有为目的蛋白编码的序列和一个乳汁蛋白特异性启动子。有时还要在构建物上加上另外的调节因子，以促进转基因的高效表达或者不受整合位置影响地表达。目前已经发现至少有一种特异性蛋白启动子山羊-酪蛋白启动子可以启动若干种以cDNA为基础的构建物的高水平表达而不需要其他调节因子。有了这样的启动子，则直接连接上结构基因就可以了，不再需要另外的调节因子。工艺的第二步是把基因构建物导入所选择动物的受精卵中，然后使其在代养母体内发育出生(当然有时也可通过细胞载体方法生产出转基因动物嵌合体)。在仔动物出生后，检测其基因组中是否组合有转入的外源目的基因。牛、羊的后代整合率可达510。一旦鉴定转基因成功，此动物就被称为“祖先”动物，应细心把它饲养至性成熟，并把雌性祖先动物配种使其产乳。同时，用所获得的雄性祖先动物与其他动物杂交，以产生转基因雌性后代并检测其乳汁中是否有转基因蛋白表达。转基因在乳用动物中表达的最高值一般都类似或高于在预试验小鼠乳汁中的表达值。在某些物种，现已有办法来诱导转基因于性成熟前或性成熟后马上在乳汁中表达。这样就可以使样品的检验及下游的提纯方法的研制提前进行。自乳汁中提纯治疗蛋白的基本原理与从细胞培养液中提纯重组产品一样。首先要除去乳中的酪蛋白分子团(假如酪蛋白不是所需蛋白)和脂肪球；然后，经过常规层析方法分离出适合人用的高纯度(99.9)蛋白质。由转基因动物乳汁中提取的蛋白质的药物检验标准与其他基因工程蛋白的一样，必须向有关部门提供诸如特性、纯度、稳定性和安全性等关键指标。目前，已从转基因动物乳汁中生产出的治疗蛋白主要有：在奶山羊乳汁中高效表达的抗凝血酶III和-1-蛋白酶抑制因子，在绵羊乳汁中表达的-1-抗胰蛋白酶、人凝血因子IX，在牛乳中表达的-乳白蛋白、乳铁蛋白，在兔乳汁中表达的-葡萄糖苷酶等。这些蛋白在医疗上都有重要作用，如-1-抗胰蛋白酶可以治疗北美洲常见的肺气肿病，凝血因子IX是治疗血友病的珍贵药物。除了从转基因动物的乳汁中可得到上述珍贵药物外，目前还从转基因小鼠或猪的血液中得到人类血红蛋白、人免疫球蛋白重链等贵重产品。22 转基因动物在人类遗传病分析治疗中的应用 部分医学工作者认为，几乎所有人类疾病(除外伤之外)都有一定的遗传因素参与，在一定程度上都可看作是遗传病。这提示我们研究人类遗传与疾病的关系是非常重要的。而我们的近代遗传学知识几乎都是从微生物或低等动物的实验中得来的，而从人类遗传病中得来的知识是相当少的。利用转基因制造出各种遗传病的动物模型，则给研究人类遗传疾病带来了极大的方便。由于小鼠与人类基因的同源性很高，故小鼠的许多遗传病模型与人类相应的疾病具有可比性。而且现在实验用的小鼠都有明确的遗传背景、又易于饲养与繁殖，人们对小鼠有着成熟的遗传操作技术，因而使转基因小鼠被广泛应用于医学基础理论的研究。目前，应用转基因技术已成功地制备了与人类多种遗传病相应的遗传性改变了的转基因小鼠模型。人们可以通过基因剔除技术完全排除其他基因的影响，以检测一个确定的遗传改变所产生的效应，以确定致病基因的功能和致病机理，阐明其结构及其在染色体上的定位，并探究基因型与环境因素的关系。另外，用小鼠cDNA为探针，还可以克隆得到相应的人类基因，这是一种简便而快捷的克隆人类致病基因的方法，将使人类能够深入洞察遗传性疾病的发病机理，弄清人类基因组调节控制人体各种遗传性状的规律，从而进行科学的诊治。目前，在培育人类遗传疾病模型动物方面已经培育出了动脉粥样硬化、镰刀形红细胞贫血、初老期痴呆症、自身免疫病、淋巴组织生成、真皮炎及前列腺癌小鼠等多种疾病的模型动物。23 应用转基因动物生产可供人类移植用的器官 在人用器官供体培育方面，最早是用小鼠进行实验，现在已经生产出了可为人类提供器官的转基因猪。目前转基因猪的肝脏可用于虚弱的无法接受肝脏移植手术的急性病人进行离体灌注。这些猪经过遗传工程改造，可表达能封闭补体介导的高敏排斥反应的蛋白质，从而减少排异反应。目前，这样的器官还只能是短期代用，不能永久移植。从长远看，还必须研究出可永久性移植的器官来。3 转基因动物在人类医学中的应用前景展望转基因动物的研究和应用是最近十几年发展起来的一项高新技术。其在人类医学中的应用还仅仅是在试验性的初期阶段，与其说它给人类医学带来了什么实际效益，倒不如说它给人类医学带来了更多的希望和广阔的应用前景。在转基因动物乳腺生物反应器方面，虽然已经生产出了十余种珍贵产品，但由于技术上的不成熟，目前在产品成本上还没有显示出多大的优越性。随着技术上的不断成熟，这种现象将会大大改观。据国外经济学家推算，若用其他生产工艺(如哺乳动物细胞株培育技术)来生产1g药物蛋白，成本需要8005000美元，而利用转基因动物则只需要0.020.5美元。从实用性上来说，就目前的认识水平而言，还找不到其他任何一种生物(除人类本身外)能够象转基因哺乳动物的乳腺那样生产出与人类蛋白最接近的，经过修饰加工的，对人类来说具有高水平生物活性而又相对比较稳定的蛋白质。尽管经过了几千年的文明史，人类的科学技术有了极大的提高，而维持我们生命所需要的食物还仍然是依靠