人少突胶质前体细胞培养.doc

1600Human Oligodendrocyte Precursor Cells人少突胶质前体细胞少突胶质前体细胞是Raff、Miller 和Noble于1993年首次发现，并已进行了深入的研究。在文献中，前体细胞指少突细胞型星形胶质细胞祖细胞或少突胶质细胞前体细胞。发育中和成熟的中枢神经系统都含有少突胶质前体细胞。少突胶质细胞，中枢神经系统中的髓磷脂组成细胞，来源于少突前体细胞。在培养中，少突前体细胞在基本的成纤维细胞生长因子存在的情况下可产生于神经祖细胞或神经干细胞，OPC在血小板衍生的生长因子或星形胶质细胞产生的生长因子存在的情况下才能增殖，并分化成为成熟的少突胶质细胞。正因如此，它们为研究发育转型提供了特殊的细胞种群。细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。将小瓶置于37C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。启封1.对于冰冻细胞：如果包装箱里干冰，并且你不想立即培养细胞，将冻存管立即放入液氮中。如果包装箱中没有干冰，立即融化培养细胞2.对于增殖的细胞：用70%的酒精喷洒培养容器(瓶，板或slide)以消毒。将细胞放入37C，5%二氧化碳培养箱中平衡两小时。细胞平衡好后，更换新鲜培养基。经过以下步骤后开始培养细胞1.用层粘连蛋白或多聚赖氨酸包被培养容器少突胶质前体细胞接种在层粘连蛋白或多聚赖氨酸包被的培养瓶中将促进细胞帖壁和神经突生长(多聚赖氨酸包被：浓度为 2 g/ml 包被培养瓶或培养板1小时，然后用无菌水洗三次)，这一点非常重要。2.培养基的准备：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。3.准备培养：为每一支冻存管准备一个T-75培养瓶。加入适量的培养基(推荐20 ml/T-75培养瓶)，将培养瓶放入37C，5%二氧化碳培养箱中至少平衡30分钟4.融化细胞：将小瓶入入37C水浴中，握住并轻轻的旋转小瓶直到完全融化。将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。用70%的酒精冲洗小管，擦去多余的酒精。小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。5.用1ml移液管在小管内轻轻地重悬细胞，然后转移到平衡过的培养容器中( 一个T-45 培养瓶)。推荐接种密度大于20,000 cells/cm2注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。6.盖好盖子，轻轻地摇晃培养瓶以使细胞分布均匀，如需气体交换则打开瓶盖。将培养容器放入培养箱中7.为了得到良好的结果，在培养开始后至少16个小时内不要动培养物。第二天更换培养基以去除残留的DMSO和未贴壁的细胞，然后每隔一天进行如上操作。培养良好的细胞将呈现正常的少突胶质前体细胞形态(单极或两极的小且圆亮的细胞体)。传代培养：1.细胞达到90%融合时需传代培养2.准备层粘连蛋白或多聚赖氨酸包被的培养瓶3.加热培养基，胰酶/EDTA消化液，胰酶中和液和DPBS(磷酸盐缓冲液)到室温。4.用DPBS冲洗细胞5.用5 ml胰酶/EDTA消化液消化细胞(T-45培养瓶)。直到80%细胞呈圆形(在显微镜下观察)。立刻加入3ml 胰酶中和液并轻轻摇晃培养瓶。注意：使用ScienCell实验室的胰酶/EDTA消化液，会把胰酶消化对细胞的损害减少到最低。6.收取细胞并将其移入15ml离心管中。另外用3ml生长培养基冲洗培养瓶以收集残留的细胞。在显微镜下观察剩余细胞数量以确定是否收集成功。剩余细胞数应小于5%7.以1000转离心收取的细胞5分钟，然后在生长培养基中重悬细胞8.细胞计数然后将它们接种中新的，多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，细胞密度以推荐数值为准。注意：处理人类来源的产品存在潜在的风险。尽管每一株细胞都经检测艾滋病毒，乙肝病毒，丙肝病毒呈阴性，检测不能达到100%准确，因此，必须采取适当的保护措施避免无意的暴露。操作这些产品时要带手套和安全镜。