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药物化学杂志文章临床候选癌症药物的第二代核苷类似物Tipifarnib Anti-Chagas药物的发现James M. Kraus, Hari Babu Tatipaka, Sarah A. McGuffin, Naveen Kumar Chennamaneni, Mandana Karimi,Jenifer Arif, Christophe L. M. J. Verlinde, Frederick S. Buckner,*, and Michael H. Gelb*,收录于2009年9月2日我们此前曾报道说,癌症药物临床候选药物tipifarnib杀死了恰加斯病的病原体，库氏锥虫，通过阻止极层面的生物的合成从而抑制羊毛甾醇 14 R-去甲基化酶的合成。Tipifarnib是一种最新的人类蛋白质抑制剂。我们的tipifarnib合成物,不仅绑定到最新的蛋白质而且显示出其增加了杀死寄生虫的效力。实现这一结构指导样式改变了取代基苯基附加到组tipifarnib的4-位喹环和Ome的氨基取代。最新发现subnanomolar抑制一些库氏锥虫的化合物并将其杀死在缺乏蛋白质的浓度。这些化合物结果优于其他羊毛甾醇 14 R-去甲基化酶的抑制剂,他们只显示适度的抑制的人类细胞色素P450(3 A4)的效力。因为tipifarnib显示口服生物利用度高和可接受的动力学特性,新近发现的tipifarnib核苷类似物是理想的前导药物来治疗恰加斯病。介绍恰加斯病是由于原生动物寄生虫感染，库氏锥虫(T. cruzia)。当不恶劣卫生条件的传播,感染是由于暴露于血液或锥蝽臭虫的粪便,它们生活在泥泞中和不合格的住房在从南美的南部部分和美国南部州部分的面积。一旦感染,个体通常会变成一个终身的对寄生虫的寄主,因为没有任何现存的治疗是完全有效的治疗慢性疾病阶段。8到11万人在拉丁美洲感染了T cruzi,30%的人预计会轻则有点terminal并发症不等。1 在这个时间没有有效的治疗方法用于恰加斯病。这两种药物被用于硝基呋喃、硝呋莫司、替硝唑和苄硝唑药物。这些药物的毒性是与他们模式的影响,和不可避免地由多个不良副作用凡人陪同治疗。超过1200种的新药发现在1975年至1997年期间，只有4种是一个直接的研究和开发工作制药业的研究成果来治疗人类的热带疾病，其中一种(硝呋替莫)不再被广泛的使用。2 在我们努力为抗药物发现的理念的合作研究中哲学指导的一个那就是我们可以在大部分研究工作上“捆绑”正在进行中制药产业。3 自从他们成为这种最新开发的抗癌代理人以来，药用化学和药理学数据的蛋白质抑制剂被广泛的应用。4 我们当时认为,我们可能找到一个人类蛋白质的最新抑制剂,这样也可以与克氏锥虫的同源基因具有高度亲和性。因此,我们以前调查了对许多寄生虫包括克氏锥虫的已知蛋白质最新抑制剂,其中一个化合物,能高度有效的杀死克氏锥虫(临床相关的寄生虫生命周期阶段,生长在哺乳动物宿主细胞)在一个体外测定5是tipifarnib(化合物1,图1)。6 这种化合物是一种由约翰逊和约翰逊药品开发的抗癌候选药物。7 令人惊讶的是，我们的后续研究表明，化合物1，是通过破坏甾醇的生物合成受到抑制14R-脱甲基羊毛甾醇（TC-L14DM）而不是通过阻止蛋白质杀死锥虫的方法。6 克氏锥虫无鞭毛体使用麦角甾醇，作为其重要组成部分膜和不能使用宿主细胞源性胆固醇。自1显示了高度的口服生物利用度，有理想药代动力学特性，以及在人类的耐受性，我们认为作为一个突出铅1反南美锥虫病的药物的发展。我们的目标转移到1类似物的设计，不再绑定到人类蛋白质法尼基转移，并继续作为TC-L14DMand的高度抑制剂，锥虫无鞭毛体的细胞毒性药物。为此，我们用X射线1结构绑定到哺乳动物蛋白法尼基转移1 homologymodel的TC-L14DM与对接intothe主动发展与新型tipifarnib类似物的基点所需的属性。在图2里所示我们的模式1所示为双-半径范德华表面。在这种描绘下，如果激活的基点的残留物是在范德华与1接触，这些残留物棒表示大约导致增加了一倍范德华表面上的抑制剂。从图1可以看出，1填补了活性基点TC-L4DM的1咪唑氮以血红素铁的协调。我们的模式领导到复合2（图1），这实质上是缺乏哺乳动物法尼基转移抑制蛋白（IC50值5000 nMversus1纳米为1），大约是10倍，更有效地杀死克氏锥虫无鞭毛体（EC50值大于1=0.6nMversus4 nMfor1）。模型分析显示额外的甲基组2与活性中心的3 - 氯苯环蛋白质法尼基转移冲突，但被TC-L14M的活性部位耐受。此外，1氨基酸组参与了法尼基转移蛋白活性中心的氢键网络但不是在活性中心的TC-L14M。虽然2是到今天为止，最有力的抗T锥虫化合物之一的报告，随后的研究表明，阻碍连接3 - 氯苯基组旋转键和喹诺酮类环，大概是因为邻甲基组和喹诺酮类环烯质子之间的冲突。图2 tipifarnib立体图（化合物1）停靠到TC-L14DM的活性中心。3 - 氯苯基组显示橙色其氯品红。4 - 氯苯基组其氯洋红，浅粉色，其余的抑制剂以红色显示。血红素是在黄色与青色的血红素铁。活性中心的蛋白残留枝。抑制剂显示其一倍范德华表面半径。方案1 由5 Bromoisatoic的酸酐合成Tipifarnib类似物方案2 以R1=邻卤素Tipifarnib类似物的合成方案3 合成取代5 - 苯甲酰 - N1-alkylimidazoles因此，2是异构体amixture的邻甲基组高于或低于喹诺酮类平面环。这是显而易见的，由1核磁共振光谱，2显示了共振峰倍增（见支持信息）。此外，加倍甚至不塌陷当温度升高到65（未显示），表明异构体是在生理温度非常稳定。化合物2还含有一个手性中心，所以它是一个4个稳定的异构体的混合物，这大大削弱了其作为一个潜在的候选药物。这是因为不同的同分异构体可以预计有不同的TcL14DM亲和力，它是可能的，只有4个异构体1生物活性。此外，所有4个化合物的药代动力学和毒性资料会分别成为研究与候选药物的选择方向走。因此，我们继续设计新的类似物，或者缺乏2 - 3 - 氯苯基环上取代基或有一个C2对称环是为了避免rotamer的形成。在这项研究中，我们报道了这两种方法的结果。我们也开展这些额外的结构活性来研究tipifarnib类似物。化学方案1显示了用于合成一些在这项研究中报道的化合物的路线。市售5 bromoisatoic苯酐转换魏因勒卜酰胺3，这反应了各种phenyllithiums（原位形成苯基卤化物使用2摩尔的n-丁基锂，1摩尔需要deprotonate的NH）酮4。此外试剂的顺序重要的是要避免溴化锂N-丁基锂和芳-Br键3之间交换。分子环封基的氨基酸组的乙酰给予喹诺酮类5。5至化合物10的转换（图1）进行了描述是我们前面的研究。我们也感兴趣的类似物，其中R1是2 - 卤或2,6-dihalide。的使用2-chlorophenyllithium是因为苯炔形成问题。我们成立了2,6 - difluorophenyllithium却发现它的反应slugglishly魏因勒卜酰胺3的过程中，也形成了苯炔。因此，我们制定的准备方案2的其他类似物。市售卤化肉桂酸11转换为酸性氯化物，然后4 - 溴苯胺反应给酰胺12。分子的Friedel-Crafts烷基化进展顺利，用浓硫酸给内酰胺13。转换喹诺酮类完成13个氧化2,3 - 二氯-5，6 - 二氰基-1,4 - 苯醌给14。后者被转换成所需tipifarnib类似物的使用步骤方案1。方案3显示了两条航线，使themethanones需要方案1中的步骤 f。结果与讨论我们合成了1类似物品种并测试他们他们能够杀死锥虫无鞭毛体在哺乳动物宿主细胞（3T3细胞）增长。如上所述，增加了我组在123 - 氯苯基环位置和导致2取代的氨基甲酯，这是相比1泯灭法尼基转移酶抑制蛋白和10倍以上在强有力的杀害寄生虫。在试图让类似物不存在一个稳定的异构体对（见上文），2个合成类似物，3 - 氯-2 - 甲基环产生变化。杀死锥虫无鞭毛体的EC50值列于表1。化合物3缺乏邻甲基组但保留了氨基甲酯替代。该化合物是100倍的蛋白法尼基有力相比1并保持低纳摩尔对克氏锥虫效力。这一结果表明，邻甲基组和OME组2行为，以减少结合蛋白法尼基。我们也让化合物，其中有像2邻甲基组和氨基到OMe的变化，但缺乏3 - 氯组。2，3 - 氯组的性质不要求锥虫生长强效抑制非常相似邻甲基组重要的是减少蛋白质法尼基转移的约束力。然而，化合物4仍然存在一双稳定的异构体，所以不构成我们需要的解决方案。同样的画面出现在化合物5，其中有一个邻CF3，而不是Me。 我们做了化合物缺乏邻甲基组（因为rotamer问题），但包含替换3 - 氯组希望减少结合蛋白法尼基转移，同时保留对克氏锥虫效力的要求。更换氯与氟，Me，或CF 3减少亲和力蛋白法尼基100 - 2000倍的要求同时保持良好的对克氏锥虫药效（见6-8，表1）。这一结果表明，氯离子取代法尼基转移给出了蛋白质活性部位最佳组合。这是明显从X-射线结构1约束蛋白质法尼基转移。下一步，我们9化合物，其中含有的邻F而不是邻ME，希望较小的F不会干扰立体烯氢。化合物9更像2中它的蛋白质结合更弱法尼基相比1并在其优于1能够杀死锥虫。然而，9个被发现存在稳定不同异构体在1H NMR谱中（没显示）。当温度提高到75核磁共振峰合并（未显示）;然而，异构体持续在生理温度。化合物10，缺乏邻取代（所以没有异构体是可能的），也缺乏3 - 氯组，这是非常重要的结合蛋白法尼基。这种化合物跻身最有力的对克氏锥虫的化合物和显示一个中间法尼基转移酶蛋白质的亲和力损失（500倍）。化合物11-13缺乏邻位取代基和包含单一非氢取代在上文段的位置。全部3个化合物表现出良好的药效，杀死锥虫和重大损失结合蛋白法尼基，11显示最大的损失。wealso推断，除了一个非氢组如果两个邻位位置是取代的邻位是可以接受的，因为在这种情况下这两个异构体的的化学性质相同。化合物14含有2,6 - 二甲基苯基环，像含2 - 甲基化合物2，它是缺乏蛋白质法尼基转移酶抑制活性和显示器良好的杀虫效力。化合物15和16显示14个类似性质。化合物15和16显示14个类似性质。2,6 - 二氟苯基化合物16是对克氏锥虫系列中最强大的EC50为0.3纳米。这种化合物是强有力的作为在我们的打击吨锥虫体外amastigote posaconazole的杀伤方法。这些都是我们都知道最有力的抗T锥虫化合物。化合物17含有3,5 - 二苯基组。这是高度有效的抗寄生虫，并显示了600倍蛋白法尼基相比减少亲和力1。在我们以前的研究我们发现，与-萘取代4 - 氯苯tipifarnib模拟显示120倍以下的亲和力蛋白法尼基组比1并显示打击的EC50克氏锥虫的45纳米。鉴于EC50值降低和损失蛋白质法尼基亲和力1氨基酸组甲酯取代OME，我们准备了化合物18。事实上，这化合物现在是一个蛋白法尼基非常弱的抑制剂杀死锥虫的EC50下降到2纳米。表2给出了一个更广泛的变化，以取代OME作用1氨基酸组。取代氢氧产生氨基只有轻微的蛋白质法尼基亲和力的减少。据推测OH基团的活性部位仍然可以进行氢键网络。更换的氨基组有OMe，OET，OPR，NHMe具有一个更加显着效果。模型显示，氨基组不接触TC-L14DM残留。它很可能是改进杀死锥虫效力时，氨基甲酯取代更好的更为疏水的的渗透的结果跨宿主细胞和寄生虫膜复合。这是我们准备OET，OPR和NHEt类似物的动机。然而，OMe保持在最好组EC50值。我们试图准备模拟含N（Me）2，但它据推测是不稳定的打破在SN1类型的反应。表3数据显示化合物中的咪唑的N-Me等被N-取代。化合物26是作为比较有力打击T.cruzi的N-ME，化合物3，但克氏锥虫3，它结合1500倍较弱蛋白质优于法尼基转移比1。同样，化合物是OME组优越的打击克氏锥虫。化合物26也缺乏异构体（无邻位取代）。我们做了补充修改为1进一步测试我们同源模型（图2），表4总结有效性结果。模拟结果表明，4 - 氯苯1组的氯填补了活性部位。这可以看出，这置换Me和CF3氯耐受性，更大的组ET和I-PR导致较少的化合物打击克氏锥虫。模拟还表明，氯3 - 氯苯基组填充的TC-L14DM的活性部位以及（图2）。置换该CL，pH值较大的组和BN，导致在打击克氏锥虫的寄生虫效力显着减少。图3 16来重组种结合不同的光谱TC-14DM。化合物16在200 nm至2微米与TC-14DM浓度为1.4M。 我们测试了我们最有力的抗T锥虫化合物，16，结合体外重组的TC-L14DM。图3所示，当1.4M的TC-L14DMis滴定0.2-2M的16，血红素Soret带可见吸收光谱经历了光谱漂移（差光谱，图3）。光谱特征有力地表明氮16咪唑的坐标直接指到血红素铁。当不同的spectrumis量化函数等值物16添加酶，它被发现当酶1等效加入抑制剂，频谱中停止变化（未显示）。这表明，复杂的酶抑制剂的平衡解离常数，KD，是比1.4M少得多的酶浓度。从这个结果，我们可以说，有16个紧密结合TC-L14DM，但我们不能确定精确的Kd值。我们倾向于排列我们的tipifarnib EC50值的原因杀死锥虫无鞭毛体为基础的类似物（表1-4）。EC50值是最重要的参数作为我们努力的发现药物，因为该化合物不仅具有绑定到目标的酶，但还具有交叉宿主细胞和寄生虫膜。由于这些tipifarnib类似物含有咪唑环，有些人担心，他们可能是肝细胞色素P450的抑制剂。我们测试了一些对我们最好的在一系列化合物的主要药物抑制代谢酶，细胞色素P450 CYP3A4的亚型，在体外试验使用。完善的CYP3A4抑制剂酮康唑是一种测量值为11纳米的IC50强效抑制剂（见表5）。我们也测试泊沙康唑因为它正在考虑临床试验作为一个反南美锥虫病的药物。这种化合物是未来最有效的抑制剂（IC50= 82纳米）。tipifarnib以前报告是一个较弱的P450酶抑制剂（10000 nm），我们也观察到对CYP3A4相对较弱的抑制（IC50=4060纳米）。tipifarnib类似物在这些研究中设计了约微摩尔水平的IC50值