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食品生物技术第一章 绪论一、什么是食品生物技术？（作业）答：食品生物技术是生物技术的重要分支。主要指生物技术在食品工业中的应用，其以基因工程技术为核心手段，包括细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等技术，贯穿于食品制造的全过程（上游过程和下游过程）。或者，利用生物体及其细胞、亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段研究及加工处理或制造食品产品的新技术。二、食品生物技术主要包含哪些内容？答：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程、食品生物工程下游技术、 现代食品生物技术与食品安全。（1）基因工程（ DNA重组技术）（Gene Engineering）应用人工方法把生物的遗传物质( DNA )分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品质；或者使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物( 多肽或蛋白质 )。基因克隆技术的一般步骤。（2） 细胞工程（Cell Engineering）应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行细胞水平上的培养、繁殖；或人为改变细胞的某些生物学特性，从而达到改良生物品种或创造新品种；或加速繁育动、植物个体；或获得某种有用的物质的过程。包括：动、植物细胞的体外培养技术；细胞融合技术（细胞杂交技术）；单克隆抗体技术；细胞核移植与动物克隆技术；干细胞技术。（3） 酶工程（Enzyme Engineering）利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术利用酶的催化作用进行物质转化，生产产品。酶工程技术路线（4）发酵工程（Fermentation Engineering）也称微生物工程。利用微生物生长迅速、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在合适条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品称为发酵工程。举例：酒精类饮料、醋酸和面包、氨基酸、香料、维生素和单细胞蛋白等。（5） 蛋白质工程（Protein Engineering）是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对天然蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质或设计制造新的蛋白质。包括蛋白质的分子设计与修饰、改造、拼接等。（6）生物分离工程Separating and Purifying Engineering（7）生物技术与食品安全性检测在食品检测中的应用：食源性病原菌快速检测；转基因食品检测（8）各生物技术体系之间的关系按照自己的愿望改造物种：采用基因工程或细胞工程方法。基因工程和细胞工程研究成果的产业化：通过发酵工程和酶工程来实现。 基因工程、细胞工程和发酵工程中所需要的酶，往往通过酶工程来获得。 酶工程中酶的生产，一般要通过微生物发酵的方法来进行。基因工程是核心，带动其他四大工程的发展，四大工程的发展又促使基因工程发展更迅猛。基因工程和细胞工程看作生物工程的上流处理技术，将发酵工程和酶工程看作生物工程的下流处理技术。三、生物技术在食品工业中有哪些应用？1. 食品资源的改造 ：一方面提高了农作物产量和改善农作物的抗虫、抗病、抗除草剂和抗寒等能力，另一方面使食品的营养价值、风味品质得到改善，食品储藏和保存时间有所延长。2. 食品加工过程和食品品质的改良：（1） 改良食品微生物的生产性能 1）提高发酵食品质量并使加工过程更合理化 2）实现重要产品的高水平、低成本生产（2 ）应用于食品酶制剂的生产3. 应用于食品保藏方面：利用基因工程、发酵工程生产用于农产品保鲜的“绿色”抗氧化剂、防腐剂等4应用于过程控制和安全检测：质量管理：提高食品质量管理的效率和保证食品质量和安全性（基因工程、酶工程检测，监控等）5应用于食品工业废物的处理，利用：废弃物处理：通过发酵工程和酶工程处理废弃物，提高资源的利用率并减少环境污染第二章 食品与基因工程1、什么是基因工程？基因工程的操作步骤有哪些？答：基因工程：指用酶学方法将异源基因与载体DNA进行体外重组，将形成的重组DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需的生物品种和产物，也称分子克隆或重组DNA技术。基因操作的基本步骤： 分离 剪切 拼接 导入 筛选 扩增表达从基因工程的步聚来看，从头至尾都是对基因进行操作，即基因工程是基因的一种操作平台与技术。基因工程五大基本操作单元：切，接，转，增，检 基因工程四大要素：工具酶、目的基因（制备）、基因载体、基因受体 （记）2、基因工程有哪些特点？答：分子水平的转移，细胞水平的表达；基因的切割、连接等操作依靠酶学的方法；基因工程整个过程体现不同种间进行无性繁殖，即为克隆过程；在体外建立无性繁殖体系，易于产业化和规模化。3、限制性内切酶及其作用机制与作用方式是什么？答：限制性内切酶概念：指一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。限制性内切酶作用机制和方式：（1）限制性核酸内切酶识别序列识别序列：限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列。（同分子中识别序列短的出现几率大，反之亦然）识别系列长度为4-8碱基对割位点位于识别系列的内部或两侧，识别系列为典型的回文结构。稀切酶：能够长识别序列及富含GC和AT的识别序列（几率小）的内切酶。同裂酶：识别相同序列的限制酶同尾酶：识别序列不同，但切割得到的DNA片段具有相通的黏性末端。各种类型见P18-19（2）切割方式黏性末端：被限制酶交错切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（5粘性和3粘性）平整末端：同一位点平齐切割DNA两条链而形成的双链末端。 4、限制性内切酶种类：答：I型酶：在识别位点很远的地方任意切割DNA链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。 II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需Mg2+，适合基因工程。 III型酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。 5、理想的基因工程载体应具备哪些特征? 基因载体的概念：将外源DNA或目的基因带入适当宿主细胞（host cell）的工具或运载体。载体应具备的条件：能自我复制。相对分子质量较小。能给宿主细胞（受体）提供可选择标记。有可供辨认的表形特征，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞便于筛选；只有单一限制性内切酶切点；即经某限制性内切酶切割后，即可把质粒DNA闭环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。基因克隆的主要载体类别：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体6、什么叫目的基因? 获得目的基因的方法有哪些?（作业）答：目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。获得方法：一.直接分离基因1、限制性核酸内切酶酶切分离法（要用于质粒和病毒等小分子量DNA）2、基因分离的物理化学法：分子杂交法、密度梯度离心法、单链酶解法二、构建基因组文库法把染色体DNA用限制内切酶切割，将所有片段链接到某载体上，转入大肠杆菌中增殖。再用适当方法筛选出含目的基因的的重组体菌落，从重组体菌落提取DNA，经酶切后获得目的基因。三、 化学合成法如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，可以利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。通常是先合成一定长度（200bp）、具有特定序列的寡核苷酸片段。然后将寡核苷酸适当连接组装成完整的目的基因。四、PCR扩增法（聚合酶链式反应） Polymerase chain reactionPCR技术是指模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列合成及扩增的技术。前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。7、PCR反应的原理及主要过程包括哪些？PCR原理DNA的天然复制PCR技术的实质为体内DNA复制的体外模拟：使双链DNA热变性而分开成为单链DNA，退火后在低温下，两个与模板互补的引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。每经过一次变性、退火和延伸为一个循环，所扩增的特定DNA序列数量按几何指数增长。Taq DNA聚合酶：水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74复制DNA，在95仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。PCR反应步骤 模板DNA的变性：模板DNA经加热至9495一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环“变性-退火-延伸”过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR的特点灵敏度高PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。特异性强引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。简便、快速、重复性好一次性加好反应液，2-4小时完成扩增。 .对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 。8、重组子的抗药筛选和蓝白斑筛选原理？（作业）答：抗药筛选：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。蓝白斑筛选：具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译LacZ基因编码半乳糖苷酶，该酶能水解生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。9、试述基因工程在食品工业上的应用。答：转基因食品（ Genetically Modified Food，GMF）：是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等。一、转基因微生物食品：提高食品产品的品质；简化生产工艺，缩短生产周期；食品的抗菌和防腐保鲜；食品级酶制剂生产菌的改良；保健食品功效成分的生产；食品微生物的快速检测。二、转基因动物食品：改变家畜生成速度；改善乳产品的营养组分，特别针对婴幼儿；通过生物反应器生产人血清蛋白等；改良动物食品性状 。三、转基因植物食品：（一）改善食品原料的品质 ：提高植物性食品氨基酸含量 ；增加食品的甜味 ；改造油料作物 ；改良植物食品的蛋白质品质；改善园艺产品的采后品质。（二）利用基因工程改进食品生产工艺：改良啤酒大麦的加工工艺；改良小麦种子贮藏蛋白的烘烤特性 ；改善牛乳加工特性。（三）利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品：生产氨基酸 ；生产黄原胶；超氧化物歧化酶(SOD)的基因工程；应用于生产保健食品的有效成分。概念补充：1、宿主细胞（受体细胞）：指在转化、转导和杂交中接受外源基因DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、感受态：指宿主细胞能吸收外源DNA分子而有效作为转化受体的某些生理状态。取决于受体细胞自身的生理状态及重组DNA分子的构型和分子大小，一般宿主细胞在对数生长期转化能力最强。感受态细胞：能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。3、扩增：将目的基因与载体切割后连接成重组子（重组DNA）后导入细菌细胞中，转化后的转化子（菌落）被置于含有标记抗菌素的丰富培养基上生长，细菌转化繁殖后即完成目的基因的扩增。第三章 食品与蛋白质工程1. 什么是蛋白质工程、理性分子设计和非理性分子设计？答：蛋白质工程：是指以蛋白质的结构及其功能关系为基础，通过基因修饰、蛋白质修饰等分子设计，对现存蛋白质加以改造，组建新型蛋白质的现代生物技术。 理性分子设计：在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，利用专一改变基因中某个或某些特定核苷酸序列，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建全新的蛋白质分子。 定向进化（非理性分子设计）：不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在实验室模拟蛋白质自然进化的过程，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变物，在较短时间内完成漫长自然进化过程，得到具有特性预期的新蛋白质的一种技术。2. 什么是定位突变，常用的定位突变方法及其原理。（作业）答：定位突变是在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DNA序列中取代、插入或删除选定的核苷酸，从而产生具有新性状的突变蛋白质分子的一种蛋白质工程技术。定位突变方法： 寡核苷酸引物介导：原理：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。包括：Kunkel突变法、基于抗生素的“抗性恢复”突变法、基于去除特定限制酶切点的突变法。 PCR介导：原理：利用PCR将插入和缺失的突变碱基均设计在引物中，先用两对引物分别对核酸进行PCR扩增，通过重叠延伸产生带有部分重叠序列的两个PCR产物，这些产物经过混合、变性、复性和链延伸后，再用一对与两个待接片段外侧互补的引物进行第二次扩增，从而产生全长的异源杂合双链DNA。 盒式突变：盒式突变，又称片段取代法，利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段。 包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。关键：1.目标基因序列中有适当限制酶切位点。 2.如何得到各种合适的用以取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段3. 蛋白质的定向进化、DNA改组、融合蛋白技术的概念。答：蛋白质的体外定向进化又称为分子进化，就是在实验室条件下模拟自然进化机制，对编码蛋白质的基因进行诱变、重组，再通过高通量筛选方法选择出性能更加优良的蛋白质。不需要已知蛋白质的结构信息。随机突变+定向选择目标突变体 DNA改组：将一群密切相关的DNA序列，在DNaseI作用下，随机酶切成许多片段，这些小片段之间有部分重叠碱基序列，可通过自身引导PCR重新组装成全长基因，从而建立分子多样性文库，对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮DNA改组模板，重复多次重排与筛选，直至获得性状较为满意的突变体。融合蛋白技术：有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因编码区首尾连接在一起，由同一调控序列 控制所构成的基因表达产物，进而表达所需的蛋白。4. 蛋白质体外进化的过程以及与自然进化的不同点。答：.通过随机突变或基因重组创造基因多样性，建立突变文库；.突变体在适当生物体内表达；.高通量筛选检出阳性结果，供进一步进化；.此过程不断循环，直至获得预期性状的新型蛋白。不同点：进化动力不同；进化方向不同；进化速度不同5. 蛋白质改性的方法。化学改性：主要是针对蛋白质的一些氨基、羟基、巯基以及羧基进行化学修饰，改变蛋白质的结构、静电荷、疏水基团，而起到改变基功能性质的目的。酶法水解改性：利用蛋白酶降解食物蛋白，使其溶解性、分散性、乳化性等蛋白性能得到改善。酶法聚合改性：利用转谷酰胺酶对蛋白进行聚合改性以提高食物蛋白的功能性质。物理改性：利用各种物理场效应改变蛋白质的功能特性。如组织化挤压改性、高压静电改性、高热高压改性、超声改性、高频电场改性和微波改性等。6. 蛋白质工程在食品中的应用情况。答：蛋白质工程在食品工业中的应用主要集中在食品工业专用酶制剂的改造方面。通过酶结构或局部构象的调整和改造，可大大提高食品专用酶制剂的耐高温、抗氧化能力，增加酶的稳定性（引入二硫键、转化氨基酸残基）和使用pH范围，从而获得性质更稳定、作用效率更高的酶；提高酶活力；改变酶的选择性。第四章 食品与酶工程1、提高微生物产酶量地措施： 选育优良细胞（基因重组技术） 强化生产过程： 添加诱导物；降低阻遏物浓度；添加表面活性剂；产酶促进剂。2、为什么要对酶分子进行修饰，酶修饰的方法有哪些 ？答：酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程酶分子修饰的意义：提高酶的活力 、增强酶的稳定性 、降低或消除酶的抗原性 、探索酶结构和功能的关系。酶修饰的方法：一、化学修饰：(一)酶的大分子结合修饰非共价修饰：使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。共价修饰：用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。（二）酶蛋白主链修饰(肽链有限水解修饰) ：利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。(三)酶分子的侧链基团修饰：采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。（四）分子内或分子间交联：某些含有双功能基团的化合物（又称双功能试剂），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，他们可使酶分子内或分子间肽链的两个游离氨基酸侧链基团之间形成共价交联，这样可以使酶分子的空间构象更稳定，从而提高酶分子的稳定性。（五) 氨基酸置换修饰：氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。(六)金属离子置换修饰：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。物理修饰：特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。3、什么是酶的非水相催化，非水相催化体系有哪些？有机介质酶催化反应体系有哪些类型？ 答：酶的非水相催化：水是酶促反应最常用的反应介质。但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。酶非水相催化的几种类型：有机介质中的酶催化、气相介质中的酶催化、超临界介质中的酶催化、离子液介质中的酶催化有机介质反应体系：微水介质体系、反束胶体系、均一体系、两（多）相体系。4、非水相催化反应特性反应体系中水的作用：酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在非水相介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。有机溶剂对酶催化反应的影响：在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别。极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。 有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。非水相介质中酶催化的特性：热稳定性、改变底物专一性、产生新的酶促反应、pH记忆。5、酶固定化方法有哪些，固定化后对酶性质的影响。答：固定化生物技术通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。 固定化酶：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。一、酶固定化方法：吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面，使酶吸附于其表面上。物理吸附法（physical adsorption）：作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 优点：操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。缺点：由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。 包埋法：将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法叫结合法。离子键结合法、共价结合法交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。 双功能试剂：常用的是戊二醛。戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。 缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。 各种固定化方法的优缺点比较二、固定化后对酶性质的影响（一）固定化酶的形状（二）固定化酶的活力 与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降，其专一性也会受到影响发生改变。 固定化酶活力下降的原因主要有： 酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化； 酶活性中心的重要氨基酸残基与裁体相结合。（三） 固定化酶的稳定性大多数酶在固定化后都不同程度地提高了稳定性延长了有效寿命。 固定化酶稳定性提高的主要原因： 固定化增加了酶构象的牢固程度；抵挡住了不利因素对酶的侵袭；限制了酶分子间的相互作用。（1） 热稳定性：大多数酶固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性，所以最适温度特随之提高。（2）对蛋白酶的抵抗力提高：溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。（3）操作稳定性：固定化酶在操作中可以长期使用。（4）贮藏稳定性：大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4下，120d 酶活力无变化。 （5）对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高：酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力。 （四） 固定化酶的催化特性 （1）底物专一性 （2）最适温度：因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以 最适温度也随之提高。 （3）最适pH：反应的最适pH和酶活力-pH曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。 带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。 (4)米氏常数Km的变化：固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。简单说，由于高级结构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。而这种Km 变化又受到溶液中离子强度影响:离子强度升高，载体周围的静电梯度逐渐减小， Km变化也逐渐缩小以致消失。6、解释固定化酶载体对酶的影响的三个效应。（作业）答：酶经过固定化后引起的性质改变，不外乎两种原因：一是酶本身的变化；二是受固定化载体的物理或化学性质的影响，就载体物化性质和固定化过程影响而言，主要存在一些三种效应：分配效应：由于载体和底物的性质差异引起了微环境和宏观环境之间性质不同。微环境是在固定化酶附近的局部环境，而将主体溶液称为宏观环境。由这种不同造成的底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，称为分配效应。空间障碍效应：固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制（因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障），使酶分子的活性基团不易与 底物或效应物的接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用，所造成的对固定化酶活力的影响效应，空间障碍效应。扩散限制效应：酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力1）外扩散阻力：是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。 外扩散阻力会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。2）内扩散阻力：是底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的主要原因，因此使用低分子量底物，小的粒径。载体孔径可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。7、一般性了解酶工程在食品行业的广泛应用答：改进啤酒生产工艺，提高啤酒质量；改进果酒、果汁饮料的生产工艺；食品保鲜；利用固定化酶生产高果糖浆；酶法生产新型低聚糖；酶法生产环状糊精；酶法应用于干酪制品的生产。第六章 食品与细胞工程一、名词解释：细胞工程：利用细胞生物学和分子生物学技术，应用工程的学的方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定的细胞、细胞产品或新生物品种的一门综合性科学技术。愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，而且还未形成组织的结构。外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材料。诱导物：一类能引起植物细胞代谢强度变化或代谢途径改变的物质。前体物：次生代谢合成途径中的某一中间化合物或是合成的起始物。毛状根：毛状根(hairy roots)是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物后，其Ri质粒上的TDNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或化学方法使其与适当载体相结合，作为固体催化剂利用。悬浮培养：把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增殖培养看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。植板率：是在平板上形成细胞团的百分率，即每100个铺在平板上的细胞有几个能生长细胞团。原代培养：将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。传代培养：用胰蛋白酶将出现接触抑制的贴壁细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液，分装到多个培养瓶中继续培养，这个过程叫传代培养。细胞系和细胞株：初次培养的细胞经第一次传代成功后，即称之为细胞系。从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止的现象。有限细胞系和无限细胞系：大多数细胞系在有限的代数内增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成无限细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化。细胞融合（体细胞杂交）：是指在外力的作用下，两个以上的异源（种、属）细胞或原生质体互相接触，不经过有性过程而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成一个杂合细胞的现象。细胞重组：将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，在融合介质作用下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。细胞拆合：把完整细胞的细胞核与细胞质用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的生物个体。核移植：所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。微细胞：核内染色体不完整的细胞。二、植物细胞培养培养基成分有哪些。答：植物细胞的培养基:通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂等。碳源和能源 ：培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。维生素 ：培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。氨基酸：虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好处的。此外，还使用蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有机添加剂还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等。植物生长激素：激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促进细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素，对芽的诱导具有重要作用。分裂素和生长素通常一起使用，来促进细胞的分裂、生长。配制培养基要注意的几个问题对于不同的植物种类、不同的组织，离体培养所需的营养成分是不同的。培养基中使用的无机盐、碳源、维生素和生长激素应该采用高纯度级的生化品。配培养基时采用蒸馏水或去离子水。固体培养基加琼脂。培养基要高温灭菌，对于热敏性化合物采用过滤除菌的方法。为了方便，往往配10倍或100倍使用浓度的培养基冷冻保存，使用时再进行稀释。三、植物单细胞分离和培养方法有哪些，这些方法的特点。（作业）答：（一）单细胞分离方法：机械法:将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。优点：不受酶的伤害，有利于细胞生理和生化研究。缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少。酶法：利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植物体，使细胞分离。加渗透压保护剂如甘露醇以防酶对细胞的损伤。加硫酸葡聚糖钾盐可提高游离细胞的产量。化学法：利用利用化学药剂使细胞分离的方法。草酸钙处理胡萝卜悬浮细胞培养物时，可获得分散细胞。秋水仙碱、2，4D或LH。（二）单细胞培养方法：看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。平板培养：将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显镜下对细胞进行定点观察。筛选效率高、筛选量大、操作简便。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成 毒害或影响组织吸收。微室培养：在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。四、大规模培养植物细胞的特点和主要的生物反应器类型。答：植物细胞大规模培养的特点：植物细胞对剪切力敏感。 植物细胞培养通常形成细胞团。 植物细胞生长速度慢，操作周期长 多泡沫。植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。大多数植物细胞培养需要光照。植物细胞培养生物反应器：1）悬浮培养生物反应器：机械搅拌反应器、非机械搅拌反应器、气升式玻璃发酵罐。2) 固定化细胞生物反应器：填充床反应器、流化床反应器、膜反应器。五、动物细胞培养形态类型和各自的生长特点。（作业）答：上皮细胞型：形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。生长特点：彼此紧密相连成铺石状薄层；生长时呈膜状移动；很少脱离细胞群而单个活动。成纤维细胞型：形态：胞体梭形或不规则三角形；胞质向外伸出23个长短不等的细胞突起；中有卵圆形核。生长特点：排列成放射状，漩涡状，不连成片。游走细胞型：形态：外形不规则且不断变化，细胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。生长特点：生长位置不固定，分散，呈活跃的的游走和变形运动。多型性细胞型：形态：外形不规则，细胞由略呈多角形的胞体和细长的、类似伪足的胞突两部分组成，胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。六、动物细胞大规模培养的工艺方式。1、分批式培养：指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。特点：分批式培养过程的环境随时间变化很大；细胞的生长阶段可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。2、流加式培养：是指先将终体积1/31/2的培养液装入反应器，接种细胞，进行培养，在培养过程中，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分又不断补充至反应器内，使细胞持续生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。特点：可避免某种营养成分的初始浓度过高；能防止营养成分在培养过程中被耗尽；整个过程反应体积是变化的。 3、半连续式培养：指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。特点：操作简便、生产效率高，可长期生产，细胞密度和产品产量一直保持在较高水平。4、连续式培养：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持反应条件处于一种恒定状态。特点：反应器培养状态恒定，保持细胞在优化状态下生长；适于大规模工业化生产；操作复杂、增加污染机会、细胞变异、设备仪器要求高。七、动物细胞固定化培养方式有哪些。答：固定化培养：是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式。微载体培养技术：用微珠作载体， 使单层动物细胞生长于微珠表面，可在培养液中进行悬浮培养。大载体培养技术；多孔载体培养；微囊化培养技术：将生物活性物质、完整的活细胞或组织包在薄的半透膜内。中空纤维细胞培养技术。八、细胞融合的方法有哪些？1、病毒诱导细胞融合病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。机制：两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透 、细胞核互相融合，进入正常的细胞分裂途径，形成杂种细胞。优点：融合率较高，适宜各种动物细胞，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养；缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。2、化学融合剂法利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。 聚乙二醇（PEG）诱导融合机制：PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合.。优缺点:聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。 NaNO3处理诱发融合 机制：一般认为是Na+造成了膜电位的改变。 存在的缺陷：就是融合频率低，而且对于来源于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。 高pH高浓度钙离子处理 3、电诱导细胞融合法原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在交流电场中，细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解，从而触发细胞融合。4、激光诱导细胞融合5、离子束诱导细胞融合在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理，发展了离子束诱导的细胞融合。九、细胞拆合的方法有哪些？答：细胞拆合 ：把完整细胞的细胞核与细胞质用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的生物个体。物理拆合法：机械方法或短波光化学拆合法：细胞松弛素十、简述植物原生质体制备的步骤及各步骤的主要方法。（作业）十一、原生质体分离的方法答：机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。十二、融合子选择的方法。 显微鉴别：根据两亲本原生质体的形状和结构的差异来鉴别杂合体。如一方细胞基本无色，另一方为绿色，则白绿色结合的细胞就是杂合细胞根据可见标记性状的机械选择法。 荧光标记：FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色；RITC (异硫氰酸罗丹明) RITC在荧光显徽镜下呈红色 互补选择法：互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。 代谢互补：利用两种营养缺陷型或两种抗性突变体的原生质体进行融合，在同时缺陷两种物质或同时含有两种有害物质的培养基上筛选杂种细胞，能生长的细胞团可以初步认为由杂种细胞形成。 生长互补：双亲原生质体的生长需要外源生长激素，而由双亲原生质体融合后形成对生长激素自养的杂种细胞，能在无外源生长激素的培养基上生长。 细胞学鉴定：利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。 同功酶鉴定：根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。 DNA分子标记鉴定：是在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。第七章 食品膜分离技术1.常用的工业膜组件类型及其特点。答：将膜、固定膜的支撑材料、间隔物和管式外壳等组装成的一个单元称为膜组件。 (1)板框式膜组件 这类膜器件的结构与常用的板框压滤机类似，由支撑板、膜、导流板交替重叠组成。支撑板是多孔筛板，其表面与膜相贴，对膜起支撑作用，它的两侧表面有窄缝，其内腔有供透过液通过的通道；导流板表面设有不同形状的流道，以增加液流的湍流程度和降低浓度的极化。 优点：体积紧凑。膜的更换，清洗、维护比较容易。压力损失少。原液预处理要求较低。 缺点： 对膜的强度要求较高；单位体积膜表面积小；能耗较大。(2) 管式膜组件 它的结构原理与管式换热器类似，管内与管外分别走料液与透过液。管式膜的排列形式有列管、排管或盘管等。管式膜分为外压和内压两种。管式膜组件特点 优点：流动状态好，流速易控制。安装、拆卸、维修方便。合适的流动状态可防浓差极化和污染。 缺点： 管膜制备较困难；单位体积有效膜面积小；管的封口较困难。(3)中空纤维膜组件特点 优点：单位体积有效膜面积大。尼龙中空纤维的物化稳定性好，耐用。不需要支撑材料。体积小，成本低。 缺点： 中空纤维膜制作技术复杂，管板制作困难；不能处理含悬浮固体的原水。(4)卷式膜组件特点 优点：设备比较紧凑、单位体积内的膜面积大。 缺点：清洗不方便，如膜有损坏，不易更换，尤其是易堵塞。2.膜分离工艺流程类型。答：段和级 段：指膜组件的浓缩液不经泵自动流到下一膜组件，每经一膜组件为一段。级：膜组件的产品经泵进入下一膜组件进行处理，透过液经n次膜组件处理，就称为n级。 一级一段连续式：透过液的回收率不高。 一级一段循环式：部分浓缩液返回进料液贮槽与原有的进料液混合后，再次通过组件分离。因浓