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中文编辑 侯美灵 8Y7 译摘要和图表发酵时间对灵巴菌质毒性成分含量的影响吴晓峰1，刘春美1，潘扬1*，蒋亚萍1，潘稚云2（1. 南京中医药大学药学院，南京 210029；2. 南京中医药大学生物制药专业，南京 210046）摘要 目的考察发酵时间对灵巴菌质中毒性成分总蛋白含量和脂肪油及主要成分含量的影响，为灵巴菌质的制备工艺提供科学依据。方法取发酵至第0、12、16、20、23、26、29、32天的灵巴菌质，采用经典的重量分析法和考马斯亮蓝G-250染色法分别测定其脂肪油和总蛋白的含量；所得脂肪油经甲酯化进一步利用GC-MS联用仪对其化学成分进行分析，并用面积归一化法计算各成分的百分含量。结果随着发酵时间的延长，灵巴菌质中毒性成分脂肪油和总蛋白含量整体呈现下降的趋势。总蛋白在第12至32 天、脂肪油在第23至32 天分别下降到最低水平，并保持相对平稳状态。通过GC-MS分析，脂肪油在整个发酵过程中共分离和鉴定出42种成分，其中相对含量在1.0%以上的11种成分至发酵第32天时，有6种成分与发酵刚开始（第0 天）时相比含量有所增加，有5种成分则有所减少，且至少产生了8种新物质。结论灵巴菌质的最佳发酵时间约为23至26 d。关键词 灵巴菌质；发酵时间；脂肪油；总蛋白；GC-MSEffects of Fermentation Time on the Contents of Toxic Ingredients in Lingba JunzhiWU Xiao-feng et al (School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029)Abstract Objective To investigate effects of fermentation time on the contents of two main toxic ingredients including fatty oil and total protein in Lingba Junzhi (LBJZ, a croton product fermented by Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst.). Method By using gravimetric analysis and coomassie brilliant blue G-250 staining method, the contents of fatty oil and total protein in LBJZ fermented at day 0, 12, 16, 20, 23, 26, 29 and 32 were determined and compared, respectively. After methyl esterification, GC-MS was adopted to further analyze the principal components of fatty oils quantitively and qualitatively whose relative contents in percentage were determined with area normalization method. Result The contents of fatty oil and total protein in LBJZ were all decreased on the whole with prolonging the fermentation time. The total protein and the fatty oil content were lowered to the lowest level from day 12 to day 32 and from day 23 to day 32 of fermentation respectively, and retained at a rather stable level. 42 chemical compounds in total were isolated and identified from fatty oils by GC-MS during the whole fermentation, among which 11 compounds comparatively contents were more than 1.0%. Compared with the first 0-day fermentation, contents of 6 compounds increased while 5 compounds decreased on the 32nd of fermentation, and at least 8 new substances were formed. Conclusion The optimal fermentation time of LBJZ is around 23 to 26 days.Key words Lingba Junzhi (LBJZ); Fermentation time; Fatty oils; Total protein; GC-MS 中药巴豆（FRUCTUS CROTONIS）为大戟科（Euphorbiaceae）植物巴豆（Croton tiglium L.）的成熟果实，载于现行中国药典中1。巴豆大毒，其毒性主要是两类成分，一类是脂肪油（巴豆油），含量达60%，既是毒性成分又是有效成分，口服后在肠内析出游离巴豆酸，使肠道分泌和蠕动增强，产生峻泻；另一类是蛋白质（巴豆毒素），能溶解红血球，使局部细胞坏死2-3。由于遇热可使这两类毒性成分含量降低或变性失活，因此目前通常取仁通过蒸、煮制熟后去油制霜（巴豆霜）的炮制方法，对缓和巴豆的毒性有积极意义4-5。“双向发酵”是笔者实验室创立的一种使药用真菌与药材间组合进行固体发酵的方法6，其为毒性中药减毒开辟了一条新途径7。前期笔者运用该技术对中药巴豆进行减毒试验，证实灵芝菌（Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst.）与巴豆形成的发酵品（简称为“灵巴菌质”）毒性显著下降。鉴于此，笔者考察发酵时间对灵巴菌质中毒性成分总蛋白含量和脂肪油及主要成分含量的影响，为灵巴菌质的制备工艺提供科学依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 原材料。生巴豆（FRUCTUS CROTONIS），购自河北安国市神禾中药材饮片有限责任公司，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为大戟科（Euphorbiaceae）植物巴豆（Croton tiglium L.）的果实，产地为四川。灵芝菌（Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst.），由南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所分离、保藏和复壮。1.1.2 主要试剂。牛血清白蛋白（No.：A8010），由Sigma公司进口分装；考马斯亮蓝G-250（No.：0615），由Amresco公司进口分装；95%乙醇、磷酸均市售分析纯。1.1.3 主要仪器。Agilent 6890N气相色谱仪，5973N质谱检测器，7683 serise自动进样器，Agilent色谱工作站配NIST05标准质谱检索库，由Agilent公司生产；UV-2401紫外分光光度计，由日本岛津公司生产；AE 240电子天平，由瑞士Mettler公司生产；HH-4数显恒温水浴锅，由国华电器有限公司生产；202型台式恒温干燥箱，由上海索谱仪器有限公司生产；THZ-D台式恒温振荡器，由太仓市实验设备厂生产。1.2 方法1.2.1 灵巴菌质的制备。按固体发酵的生产工艺进行操作8-9。将生巴豆果实粉碎成粗粒，并过10目筛。称取样品粗粒5 g，加适量水稍湿润，pH自然，填装试管约40支，混合均匀，扎口，121 高压灭菌50 min，冷却。从菌种斜面上切取绿豆粒大小的一块菌丝体（带培养基），移入发酵基质的表面（使二者须有接触），扎口，置于培养箱中272 恒温培养。每天严密观察灵芝菌在巴豆（基质）上的生长情况，于第12天后记录其半管期（生长至基质一半高度）、全管期（生长至基质全部高度）、旺盛度等，并分别在发酵至第0、12、16、20、23、26、29、32天后，掏取4支试管中的发酵物，60 下干燥46 h，即得灵巴菌质（简写为“LBJZ”）。1.2.2 脂肪油含量的测定1。取上述不同天数发酵的LBJZ样品2 g，粉碎成粗粉过20目筛。分别精密称定，置索氏提取器中，加乙醚100 ml，水浴回流提取至脂肪油提尽（约8 h），收集提取液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上低温挥去溶剂，在100 干燥1 h，移置干燥器中，冷却30 min，精密称定，计算样品中脂肪油含量（%）。1.2.3 总蛋白含量的测定10。1.2.3.1 考马斯亮蓝G-250溶液的制备。精密称取考马斯亮蓝G-250 100 mg，加入95%乙醇50 ml，再加入85%（W/V）磷酸100 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。1.2.3.2 牛血清白蛋白标准储备液的制备。精密称取牛血清白蛋白100 mg，用少量蒸馏水溶解并定容至1000 ml，即得0.1 mg/ml蛋白质标准储备液。1.2.3.3 标准曲线的绘制。精密吸取牛血清白蛋白标准储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml，分别置10 ml刻度试管中，先用蒸馏水补足体积至1 ml，摇匀，加入考马斯亮蓝G-250显色剂5 ml，混匀，放置5 min。然后以第一份为空白对照，于593 nm波长处测定吸光度，以对照品溶液浓度（C）为横坐标和吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，绘制标准曲线，计算回归方程。1.2.3.4 样品的测定。精密称取LBJZ样品0.5 g，置于50 ml容量瓶中，加20 ml蒸馏水，放震荡器中震荡提取2 h（150 r/min），3 600 r/min离心10 min。滤过，滤渣再加20 ml蒸馏水，放震荡器中震荡提取1 h（150 r/min），3 600 r/min离心10 min。合并滤液，定容至50 ml容量瓶，即得样品溶液。精密吸取LBJZ各样品溶液1.0 ml，按照“1.2.3.3”项下步骤操作，于593 nm波长处测定吸光度，标准曲线法计算出样品中总蛋白含量。1.3 脂肪油的GC-MS分析。1.3.1 GC-MS分析条件。气象气相色谱条件为：色谱柱：HP-5MS（30 m0.25 mm0.25 mm）；进样口温度：250；载气：氦气（纯度99.99%），流速：1.0 ml/min；分流模式进样，分流比：20:1；程序升温：初始温度设定为50 ，以5 /min升至210 ，维持3 min，再以5 /min升温至250 ，维持5 min。质谱电离方式：EI源；离子源温度：230 ；四级杆温度：150 ；接口温度：280 ；溶剂延迟时间：2.5 min；电子倍增器电压：1 623 V；质量扫描范围：40500 m/z。1.3.2 样品的GC-MS分析。精密称取巴豆油70 mg，加6 ml硫酸-甲醇（V/V, 1:10）混合溶液，于60 水浴回流4 h（甲酯化），加10 ml水使样品液冷却，然后再加6 ml正己烷分振荡萃取，分离上清液，过滤，无水硫酸钠干燥，低温浓缩至干。残渣加丙酮使溶解并定容至10 ml，有机相针式滤器（13 mm0.45 mm）过滤，低温密闭保存。取样液各1 ml，按仪器工作条件，注入色谱仪进行测定。对各样品总离子流图中化学色谱峰通过气相质谱分析工作站NIST标准图库进行检索并参照有关文献 11-12进行初步鉴定，按峰面积归一化法计算各组分相对百分含量。2 结果与分析2.1 线性关系考察 牛血清白蛋白标准溶液的回归方程为：A = 6.990 89C -0.000 91，r =0.999 6，表明总蛋白在0.020.1 mg/ml范围内有良好的线性关系。2.2 不同发酵时间时灵芝菌在巴豆基质上的生长情况 灵芝菌在巴豆药性基质中生长良好，菌丝生长旺盛，菌丝体浓密呈白色，与巴豆药性基质无法分开。菌丝体长满半试管的时间为14.931.13天，长满全试管的时间为21.651.54天。2.3 脂肪油和总蛋白含量的测定结果 发酵时间对灵巴菌质中脂肪油和总蛋白含量的影响如图1。由图1可知，随着发酵时间的延长，灵巴菌质中毒性成分脂肪油和总蛋白含量整体呈现下降的趋势。总蛋白在第12 d至32 d、脂肪油在第23 d至32 d分别下降到最低水平，并保持相对平稳状态。在发酵前期（第12 d至23 d），灵芝菌代谢活动旺盛，急需利用巴豆中的脂肪和蛋白质类化合物作为碳源和氮源；而到了发酵后期（第23 d至26 d后），灵芝菌生命活动相对减弱，代谢缓慢，导致菌质中的脂肪油和总蛋白保持相对恒定。图1 不同发酵时间对灵巴菌质中脂肪油和总蛋白含量的影响Fig. 2 1 The content changes of fatty oils and total proteins of LBJZ at different fermentation periods2.4 脂肪油的GC-MS分析结果 见表1。通过GC-MS分析，脂肪油在整个发酵过程中共分离和鉴定出42种成分。其中相对含量在1.0%以上的11种成分至发酵第32 d时，有6种成分（峰7、9、12、21、24和34）与发酵刚开始（第0 d）时相比含量有所增加；有5种成分（峰18、22、32、33和39）则有所减少；且至少产生了8种新物质（峰14、15、25、26、28、36、41和42）。表1 GC-MS分析不同发酵时间对灵巴菌质中脂肪油成分的影响Table11 GC-MS analysis of fatty oils of LBJZ at different fermentation periods峰号Peak No.化合物名称Compound分子式Molecular formula保留时间tR各化合物相对含量/%Relative content/%0 d12 d16 d20 d23 d26 d29 d32 d12-甲基丁酸甲酯C6H12O23.050.100.180.252四氯乙烯 C2Cl43.460.060.050.030.040.030.040.040.0532-甲基-2-丁烯酸甲酯C6H10O24.370.410.370.410.470.430.60.550.614已醛二甲基乙缩醛C8H18O26.65 0.080.280.280.340.220.250.230.195辛酸甲酯C9H18O210.440.250.220.210.220.220.220.20.1864-癸烯酸甲酯C11H20O215.400.080.060.070.070.070.077癸酸甲酯C11H22O215.771.721.411.381.591.671.871.821.8382, 4-双 (1, 1-甲基乙基) 苯酚C14H22O20.560.120.070.090.150.110.140.149十二烷酸甲酯C13H26O220.721.331.091.081.281.411.611.631.6610壬二酸二甲酯C11H20O421.360.350.280.220.370.230.260.21118, 8-甲氧基-2-辛醇C10H22O322.520.710.590.530.580.500.460.480.3512十四烷酸甲酯C15H30O225.225.394.454.084.434.855.666.046.0613十四烷酸C14H28O226.050.1214十五烷酸甲酯C16H32O227.310.070.080.130.160.160.1515(Z, Z) -9, 12-十八碳二烯-1-醇C18H34O28.680.080.10.10.110.1016(Z) -7-十六碳烯酸甲酯C17H32O228.810.080.10.120.1217(Z) -9-十六碳烯酸甲酯C17H32O228.900.070.070.090.0818十六烷酸甲酯C17H34O229.316.616.105.314.854.794.744.544.9419二丁基邻苯二甲酸酯C16H22O430.110.2320十七烷酸甲酯C18H36O231.200.080.080.080.090.080.08218, 11-十八碳二烯酸甲酯C19H34O232.5537.9737.3836.535.3837.2541.3140.3940.3822(E) -9-十八碳烯酸甲酯C19H36O232.6315.9816.8915.614.3813.6512.8411.9311.682311-十八碳烯酸甲酯C19H36O232.720.770.970.790.850.710.270.740.7324硬酯酸甲酯C19H38O233.112.502.952.923.032.712.422.442.5925(Z, Z) -9, 12-十八碳二烯酸C18H32O233.320.060.100.130.150.270.330.2326(E) -9-十八碳烯酸C18H34O233.410.120.150.170.330.380.3127(E, E) -9, 12-十八碳二烯酸甲酯C19H34O234.510.070.0828十九烷酸甲酯C20H40O235.420.090.10.10.10.110.1129(Z, Z, Z) -8, 11, 14-二十碳三烯酸C20H34O236.110.35306-丁酰基-1, 4-环庚二烯C11H1836.760.27316, 9, 12-十八碳三烯酸甲酯C19H32O236.840.263211, 13-二十碳二烯酸甲酯C21H38O237.080.881.061.060.930.860.650.540.543311-二十碳烯酸甲酯C21H40O237.2111.4315.3915.214.7412.739.498.388.9834二十烷酸甲酯C21H42O237.763.996.027.449.159.219.2911.5512.01352, 2-亚甲基双6- (1, 1-甲基乙基)-4-甲基苯酚C23H32O239.770.170.210.150.130.20.1736二十一烷酸甲酯C22H44O239.840.160.180.210.220.210.220.2637苯甲酸苯甲酯C14H12O240.580.230.2538十七烷C17H3641.120.239(Z) -13-二十二碳烯酸甲酯C23H44O241.271.170.651.021.190.980.990.880.7940二十二烷酸甲酯C23H46O241.740.690.450.600.770.830.880.820.7841二十三烷酸甲酯C24H48O243.490.170.10.110.110.1342二十四烷酸甲酯C25H50O245.440.130.150.170.150.170.213结论与讨论3.1 灵芝菌在巴豆药性基质中生长良好，菌丝生长旺盛，菌丝体浓密呈白色，与巴豆药性基质无法分开。菌丝体半管期为14.931.13天，全管期为21.651.54天。3.2 随着发酵时间的延长，灵巴菌质中毒性成分脂肪油和总蛋白含量整体呈现下降的趋势。总蛋白在第12 d至32 d、脂肪油在第23 d至32 d分别下降到最低水平，并保持相对平稳状态。在发酵前期（第12 d至23 d），灵芝菌代谢活动旺盛，急需利用巴豆中的脂肪和蛋白质类化合物作为碳源和氮源；而到了发酵后期（第23 d至26 d后），灵芝菌生命活动相对减弱，代谢缓慢，导致菌质中的脂肪油和总蛋白保持相对恒定。3.3 通过GC/MS分析，脂肪油在整个发酵过