数据定量分析.doc

使用自动定量设置未知化合物定量实验室练习6： 数据定量分析在这个实验中,您将建立具有三个浓度级别的校正数据库,并将其保存为方法的一部分。该方法用于未知物的定量计算。在这个实验中： 获取所需信息以设置校正方法 建立一个5 个浓度级别的含内标的校正数据库 定量一个未知化合物对以下化合物进行定量：内标目标化合物Tributyl phosphateAcetamide,N-phenylphenacetincaffein积分精确定量的重要因素之一是正确积分。1) 通过选择File/LoadDataFile调用C:MSDCHEM1DATAVOADATA CLWV020.D 文件，选择 Method / Load Method 调用DEFAULT.M 方法。2) 选择Chromatogram / Select Integrator 及 RTE Integrator 单击 OK。OK 对积分来说只是临时选择。现在让我们对 caffein 设定积分参数。3) 选择 Chromatogram / Extract Ion Chromatograms 完成图1 所示的需要输入的项目（注意时间范围）单击 OK。图 14) 现在编辑 RTE 的缺省积分参数。选择 Chromatogram / MS Signal Integration Parameters 完成图 2 所示的要输入的项目。须知当欲在最小峰面积 (minimum peak area) 中添入大于100 的数之前 必须选中Area Counts 选项框。 图 25) 单击 OK 接受所做的改变。 现在 通过选择 Chromatogram / Integrate 用这些参数做 积分。注意离子 194被积分，而离子67没有被积分。让我们降低最小面积来解决这一问题。6) 选择 Chromatogram / MS Signal Integration Parameters 完成图 3 中所示的各项内容。图 37) 单击 Save 和 OK输入积分文件名字 VOLATILE.P，单击 OK。图 48) 在积分参数框中单击OK 返回离子质量色谱。在Chromatogram / Integrate 用降低后的最小峰面积参数做 积分。注意此时离子67 和194都被积分了。现在我们建立并保存了积分参数，它将被用于定量数据库。9) 选择 Chromatogram / Draw Chromatogram 查看当前数据文件的 TIC 图。建立校正曲线：无论SCAN 和SIM 方式，用提取离子质量色谱做校正和定量比用总离子流色谱峰要好，因为能提高信噪比。用提取离子定量比用TIC 精度更高。TIC 则用于开始设置校正参数时确定保留时间。1) 选择 Calibrate / Set Up Quantitation.。2) Quantitation Database Globals 对话框会显示出来。完成图 5 中所需填入的内容。图 5注意标有NOTICE 处用了 RTE 积分参数文件。 3) 完成后单击 OK。Edit Compounds 框（图 6）会显示出来：图 64) 单击 Insert Above，图 7 会显示出来：图 7注意:必须首先输入内标。所有在内标之后输入的化合物都用它定量，直到遇到下一个内标。5) 将7-13 分钟范围内的色谱图放大在窗口中。对准窗口2 中10.7分钟处双击鼠标右键。在屏幕上会出现什么信息？_注意保留时间(箭头在X 轴的位置)被填写在QuantSetup 窗口。同时所指定保留时间的质谱显示在窗口1。6) 输入化合物名称。填入化合物名称。第二个化合物是 Tributyl phosphate 大约在10.7分钟。注意如果使用氘代内标时区分定量，化合物是靠信号而不是保留时间，因为内标和要定量的化合物共流出，因此峰会重叠。ISTD 选项被选中。7) 将箭头移到窗口 将箭头放在M / Z93 上同时击鼠标左右键。 会发生什么？_8) 用同样方法输入一个或几个特征离子。对于 Tributyl phosphate ，特征离子是 135 。9) 全部输入之后，在Quant Setup 窗口底部击 Save 键 。这就完成了需要在定量数据库中添加单个化合物的任务。10) 重复以上步骤，把表1 中每个化合物输入定量数据库。（注意 Tributyl phosphate 已经输入了。）化合物名称内标近似的保留时间目标离子特征离子Tributyl phosphateYes10.799155、211Acetamide,N-phenyl8.593135phenacetin11.1108109、179、137caffein12.2194109、67表 111) 最后一个化合物输入并保存之后, 在定量设置栏目击Exit。Edit Compounds 画面（图 9）再次显现。注意此时化合物的列出顺序。定量化合物永远在内标之后（不管保留时间！）有4个化合物列于表中。如有遗漏，点击遗漏的化合物，然后单击InsertAbove.。当定量设置栏再次出现时输入化合物名字，保留时间，目标 / 特征离子。然后单击 Save 并单击 Exit。一旦4个化合物全部输入，单击 Exit 退出编辑化合物对话框（图 9）。12) 系统提示目前的文件尚未定量。单击Yes 对文件定量。我们已经添加了化合物信息，现在要添加校正信息。13) Update Calibration 对话框（图 8）如下：图 814) 在 Update Calibration 选项框中，为该校正级别输入一个标识。缺省值是数字（如 “1”）但也可以输字母（如 “Low”）。为该级别输入化合物浓度 (20) 注意已经填入了ISTD 浓度。我们在哪里输入过这个量？_15) 单击 Do Update 键。定量更新程序会提取指定离子并对其进行RTE 积分。该信息存放在定量数据库中。Edit Compounds 画面（图 9）显示出来。图 916) 单击 View 键查看三页定量信息。在第3 页对错误的值进行编辑。17) Next 键用来查看第二个化合物的条目。单击 OK 离开该画面，而单击Exit 退出Edit Compounds 面板回到数据分析。现在我们拥有了含一个级别的校正数据库。下一步是为校正数据库添加第二个浓度级别。建立多浓度级别校正数据库1) 调用数据文件 C:MSDCHEM1DATAVOADATACLWV050.D.。 2) 选择 Calibrate / Update / Update One Level / OK 系统将提示该数据文件未定量，单击Yes 进行定量。 3) 下一步进入Update Calibration 对话框。将浓度改为 50，将校正级别改为2，单击 Do Update 自动为数据库插入新浓度级别。4) Exit 退出edit compounds 界面。从这一标准校正曲线更换保留时间和离子比例，会改写原来用光标输入的和这一标准的微小差别。 5) 选择Calibrate / Update / Update One Level / OK 填写图 10 所示各项内容，单击Do Update。图 106) 按照1) 至 5) 步骤输入下列浓度级别。不必再次输入保留时间和离子比例。数据文件和化合物浓度列于表 2 中：数据文件浓度浓度级别号CLWV100.D100ppm3CLWV150.D150ppm4CLWV200.D200ppm5表 2内标浓度与前两个标样相同 (50 ppm)。7) 5 个浓度级别输入之后，单击 View 以便检查浓度是否正确。8) 选择第一个化合物，单击Plot 看它的标准曲线，包括其校正因子和相关系数。出现什么信息？_由于画内标化合物的曲线是无意义的，您不可能画出内标化合物的校正曲线，为什么内标化合物曲线是无意义的？_9) 在Compound 窗口单击 Next（如必要击 OK 保存更改）画面，化合物 #2 以校验该化合物的第二个浓度级别的数据。在Plot 窗口单击Print 打印（这是获得方法文件的较好途径）。10) 打印之后击 OK，改变线性拟合方式取得最佳平均响应因子 (Avg of Response Factors)，再做曲线。反复用 Linear Regr，Force (0,0) 拟合包括原点在内的各点，加以比较。重新设置拟合方式Avg of Response Factors。对本次分析何种拟合方式更可靠，为什么？_11) 查看过三页化合物信息之后，选 OK 然后 Exit 退出该窗口。该校正数据库当前存储在计算机RAM 中，所以下一步是使其永久保存于硬盘中。校正数据库作为方法的一部分保存。 12) 选择 Method / Save Method.。13) 为新方法命名为 CLASSVOA.M。建立了新方法，原来的方法 (DEFAULT.M) 未改变。我们常用现有的方法作为模板建立新方法。方法自动存储在缺省地址 C:MSDCHEMnMETHODS 这里 n 是仪器编号。使用自动定量设置AutoQuant Setup（自动定量设置）提供了一种给定量数据库创建化合物列表的半自动方法。下列指南可引导您使用 AutoQuant Setup（自动定量设置）的全部步骤。该指南使用化学工作站随附的演示文件。在该指南中使用 default.m 和 evaldemo.d 之前，请先复制一份。1. 在 Data Analysis（数据分析）中，加载示范方法 C:MSDCHEM1METHODSDEFAULT.M 和示范数据文件 C:MSDCHEM1DATAEVALDEMO.D。2. 在 Spectrum / Select Library（谱图/选择谱库）下选择 DEMO.L。3. 选择 Calibrate / AutoQuant Setu（校准/自动定量设置）。4. 出现 Quantitation Database Globals（全局定量数据库）对话框时，进行如下更改：校准标题 键入 AutoQuant Tutorial使用 RTEINT 选中该对话框来使用 RTE 积分器（不选则使用化学工作站积分器）。单击 OK（确定）。5. 出现 Dodecane（十二烷）的 Choose Compound Name（选择化合物名称）对话框时，单击 Skip（跳过)。为了示范，您可以先跳过这个化合物，以后再把它添加到数据库中。6. 接下来出现 Biphenyl（联苯）。保持缺省名称，单击 Add（添加）。7. 接着出现 4-Chlorobiphenyl（4-氯联苯）。保持缺省名称，单击 Add（添加）。8. 接着出现 Methyl palmitate（十六酸甲酯）。要将它指定为内标，单击 ISTD（内标）。单击 ISTD 同时把化合物添加到数据库中。9. 当软件提示 Quantitate now?（现在定量？）时，单击 Yes（是）。文件量化后，出现 Update Calibration（更新校准）对话框。10. 选择 Add New Level（添加新校准级），输入如下内容：Calib Level ID = 50Cmpd Conc = 50ISTD Conc = 50然后单击 Do Update（执行更新）。11. 显示 Edit Compounds（编辑化合物）对话框时，注意十六酸甲酯处于列表顶端的正确位置，在其名称旁边有一个星号说明它是内标。12. 单击 Exit（退出）关闭对话框，或单击 View（查看）检查第 1 页、第 2 页和第 3 页中的各化合物参数。13. 要了解怎样向定量数据库中插入化合物，请选择 AutoQuant Setup（自动定量设置）。14. 选择 Insert Compounds in Database（在数据库中插入化合物），单击 OK（确定）。15. 出现 Quantitation Database Globals（全局定量数据库）对话框时，不要更改参数。单击 OK（确定）。软件会再次开始鉴定峰。出现 Choose Compound Name（选择化合物名称）对话框。16. 对话框中出现 Dodecan（十二烷）时，保持缺省名称并单击 Add（添加）。出现 Edit Compound（编辑化合物）对话框。17. 选中 Biphenyl（联苯），选择一个插入点并单击 Insert Above（插入上文）。18. Choose Compound Names（选择化合物名称）对话框中留存的 3 个化合物已经存在定量数据库中，因此单击 Skip（跳过）。跳过这 3 个化合物后，软件将问您是否 Stop Now?（现在停止?）单击 Yes（是）。这一特点在对大量化合物进行数据库操作时非常有用。19. 系统问您是否希望定量数据库时，单击 Yes（是）。20. 出现 Update Calibration（更新校准）对话框时，选择 Recalibrate（重新校准）并对 Responses（响应）和 Retention Times（保留时间）字段选择替换。单击 Do Update（进行更新）。21. 出现 Edit Compounds（编辑化合物）对话框时，单击 View（查看）并检查数据库中 4 个化合物中每个化合物的第 3 页。注意您加入的 D