微生物学基础知识讲义(修改稿).doc

食品生物污染控制与检验目录关于本教材第一章微生物基础知识第一节 微生物概论第二节 微生物类型第三节 微生物的形态结构第四节 微生物的营养与代谢第五节 微生物的生长与繁殖第六节 影响微生物生长与死亡的因素第七节 微生物的生态第八节 微生物的传染与免疫第二章 微生物检验基本技术第一节 显微技术第二节 染色技术第三节 灭菌和消毒第四节 培养基制备技术第五节 细菌的接种、分离纯化和培养基技术第六节 微生物常规鉴定技术第一章 微生物基础知识第一节微生物概论什么是微生物 微生物（microorganism, microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。包括属于原核类的细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体和蓝细菌（过去称蓝藻或蓝绿藻），属于真核类的真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物和显微藻类，以及属于非细胞类的病毒、类病毒和朊病毒等，见下表： m（微米）级：光学显微镜下可见（细胞） 小（个体微小） nm（纳米）级：电子显微镜下可见（细胞器、病毒） 单细胞 微生物 简（构造简单） 简单多细胞 非细胞（即“分子生物”） 原核类：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、 衣原体、蓝细菌 低（进化地位低） 真核类：真菌（酵母菌、霉菌）、原生动物、 显微藻类 非细胞类：病毒、类病毒、朊病毒微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可有含有50 亿个细菌。第二节微生物类型 酵母和霉菌统称为真菌。这些微生物在许多细菌不能生长的条件下如低PH值和低水活度值下也能生长。 霉菌是由多细胞构成，呈杂乱丝状结构称为菌丝体。单独的丝体称菌丝。霉菌常见的生长方式就是其菌丝变长，菌丝裂殖或产生孢子。 孢子是微生物适应周围不良环境时较常见的一种休眠形式。有些细菌也产生孢子(称芽孢)，由于其自然高度耐热，在食品加工工业中应对这些细菌引起高度重视。有些霉菌用于食品加工，如生产奶酪。霉菌也可导致食品腐败，有些霉菌种属产生霉菌毒素，这些毒性物质可引起严重疾病。 酵母是单细胞结构，明显比细菌要大。大部分繁殖是通过发芽来完成。酵母用来发酵葡萄酒，啤酒和发酵面包。其与食源性疾病无关，但能导致食品腐败，如果汁，糖浆，酸泡菜，糖蜜，果冻，肉，啤酒和葡萄酒。 细菌也是单细胞，在食品中通常有两种类型，球型或杆状。另外根据细菌其是否能形成芽胞可分成两类。芽胞是细菌生活周期的一种休眠状态。通常把芽胞比作植物的种子，一但条件适宜就会发芽生长。一般而言，芽胞对热、冷、化学物质具有高度抵抗力的。第三节微生物的形态结构 细菌细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5m,0.5-5m）、结构简单、细胞壁坚韧以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物，分布广泛。细胞的形态 主要有三种基本类型，即球状、杆状和弯杆状。分别称为球菌、杆菌、弧菌和螺旋菌。细胞结构由于细菌细胞壁结构和化学组成不同，根据革兰氏染色结果，将细菌分为两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。绝大多数细菌细胞都有细胞壁、细胞膜 和细胞核，某些细菌还具有荚膜、芽孢、鞭毛和菌毛等特殊结构。有些细菌还有细胞内含物，如光合细菌具有气泡。它们的存在可作为鉴定细菌种的依据。图1是细菌细胞模式图。图1是细菌细胞模式图。1细胞质膜 2 .细胞壁 3.荚膜 4.异染颗粒 5.菌毛 6.鞭毛7.色素体 8.核 9.核糖体 10.中体 11.横隔壁3、菌落的形态 细菌在适宜的培养条件下，会表现出该菌种特有的菌落特征，可作为鉴定细菌种的依据。 酵母菌 形态 酵母菌细胞的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。 菌落特征 大多数酵母菌在适宜培养基上形成的菌落与细菌的相似，但较细菌菌落大而且厚，菌落表面湿润，较光滑、有一定的透明度，易被挑起。其色多为乳白，少数量呈红色。菌落质地均匀，颜色均一，菌落的颜色、光泽、质地、表面和边缘特征，均为酵母菌菌种鉴定的依据。 霉菌 形态结构 霉菌是指那些菌丝体较发达而又不产生大型子实体的真菌，是丝状真菌的统称。菌体均由分枝或不分枝的菌丝构成。霉菌的菌丝有两类：即无隔膜菌丝和有隔菌丝。菌丝分化为营养菌丝、气生菌丝。一部分气生菌丝发育到一定阶段分化成繁殖菌丝。霉菌菌丝细胞均由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线核体、核糖体以及内含物组成。 菌落特征 霉菌的菌落和放线菌的接近，形态较大，质地比一般放线菌疏松，外观干燥，不透明，在固体培养基上呈蛛网状、绒毛状或棉絮状；不易挑取；菌落边缘和中心正反面的颜色常不一致；颜色多样。 繁殖方式 霉菌繁殖能力一般都很强，方式多样，主要靠无性和（或）有性孢子。 病毒 形态结构 病毒的形态基本可归纳为三种：杆状、球状和 这两种形态结合的复合型。没有细胞构造，病毒粒子的主要成分是核酸和蛋白质，在宿主细胞协助下，通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行增殖。病毒粒子通常形成螺旋对称、二十面体对称和复合对称。 病毒粒子是无法用光学显微镜观察的亚显微颗粒，但当他们大量聚集在一起并使宿主细胞发生病变时，就可以用光学显微镜加以观察。例如动、植物细胞中的病毒包涵体；有的还可用肉眼看到，如噬菌体的噬菌斑等。 繁殖方式 病毒只有在宿主细胞里才能进行繁殖，而且是通过复制的方式进行的。概括起来可分为吸附、侵入、脱壳生物合成、装配与释放五个步骤。 第四节 微生物的营养与代谢微生物的营养要求 微生物生长繁殖所需的营养物质主要有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。 水：水是各种生物细胞必需的。水是良好的溶剂，微生物的新陈代谢过程中的一切生化反应都离不开水。碳源：碳源是合成菌体成分的原料，也是微生物获取能量的主要来源。其中以糖类最易被利用。氮源：氮源主要是供给合成菌体结构的原料，很少作为能源利用。某些微生物（如固氮菌）能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐、硝酸盐合成有机氮化物。多数致病菌则必须供给蛋白胨、氨基酸等有机氮化物才能生长。 无机盐类：微生物需要的无机盐类很多，主要有P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe、等，其主要功能为构成菌体成分；调节渗透压；作为某些酶的成分，并能激活酶的活性等。 生长因子：有些微生物虽然供给它适合的碳源氮源和无机盐类，仍不能生长，还要供给一定量的所谓“生长因子”。其种类很多，主要是B族维生素的化合物等。生长因子可以从酵母浸出液、血液或血清中获得。微生物的营养类型根据微生物对碳源的要求不同，可将其分为自养菌和异养菌两大营养类型。凡能利用无机碳合成菌体内有机碳化物的，叫自养菌；不能利用无机碳而需要有机碳才能合成菌体内有机碳化物的，为异养菌。根据其生命活动所需能量的来源不同，可分为光能营养菌和化能营养菌。前者是从光线中获得能量，后者则从化学物质氧化中取得能量。因此，根据微生物所需的碳源能源不同，可将微生物分为光能自养菌、光能异养菌、化能自养菌、化能异养菌等四类。微生物的代谢 微生物在生长发育和繁殖过程中，需要不断地从外界环境中摄取营养物质，在体内经过一系列的生化反应，转变成能量和构成细胞的物质，并排出不需要的产物。这一系列的生化过程称为新陈代谢。代谢作用包括分解代谢(异化作用)和合成代谢(同化作用)。分解代谢实质是生物体将各种大分子物质降解成小分子物质并产生能量的过程。合成代谢是指将分解代谢所提供的或从环境中所吸收的小分子物质合成大分子物质的过程。第五节 微生物的生长和繁殖微生物的生长 单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个基本相似的子细胞，子细胞又重复以上过程。在单细胞微生物中，由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖。在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育。 细菌纯培养的群体生长规律 细菌具有特有的生长规律。细菌通过二分体裂解而繁殖，在条件适宜时，每20到30分钟繁殖一代。大多数细菌的繁殖速度都很快，大肠杆菌在适宜条件下，每20分钟左右便可分裂一次，如果始终保持这样的繁殖速度，一个细菌在48小时内，其子代群体将达到无法想象的数量。然而，实际情况并非如此，将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲线。生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。 (1)延迟期：少量细菌接种到新鲜培养基后，一般不立即进行繁殖，生长速度近于零。因此在开始一段时间，细菌数几乎保持不变，甚至稍有减少。这段时间被称为延迟期，又称为迟缓期、调整期或滞留适应期。处于延迟期细菌细胞的特点是分裂迟缓、代谢活跃。(2)对数期：对数期又称指数期。这一阶段突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。(3)稳定期：又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度又逐渐趋向零。 稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数最高；这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。(4)衰亡期：稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”，此阶段叫衰亡期。图二是细菌生长的典型曲线 细 菌 对 数 生 LAG期 长 值 时 间（小时） 图2：细菌生长的典型曲线 第六节 影响微生物生长与死亡的因素 温度：温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。在一般情况下，温度每升高10，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。因此，只有在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。微生物能在很宽的温度范围内生长，从华氏14度到华氏194度。根据其温度生长范围，微生物分为三类。温度（F）温度（F）最适温度范围嗜冷性小于683286嗜温性 包括PSYCHROTROPHS9850110嗜热性131110194 嗜冷性细菌在冷藏或接近冷藏条件或华氏32-86度下生长。嗜温性细菌在室温下或接近室温下即华氏50-110度下生长。嗜热性细菌在高华氏110度温度下生长。 除以上三个名词外，另外提出一词Psychrotroph。 这类细菌的最适温度同嗜温性细菌，但能在冷藏条件下生长。和食品公共卫生有关的微生物大都属于嗜温性， 他们的最佳生长温度接近人的体温。比较典型的是，温度愈高(在正常生长范围内)，生长速度愈快。出现这种现象可解释为由于酶的催化反应所致，因为温度每升高华氏18度，酶的催化速度增加一倍。 不仅温度是一个问题，而且食品接触这种温度下的总时间也需要控制。目的是减少食品在嗜温性细菌生长温度范围内的接触时间。建议食品保存在华氏40度以下或华氏140度以上。在许多情况下，要完全避免产品接触嗜温性细菌生长温度范围是不可能的。 氢离子浓度(pH)： 另一个能控制细菌生长的因素是PH.。环境中的酸碱度通常以氢离子浓度的负对数即pH值来表示PH=(-log of the (H+)。环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大。 PH实际上不难理解，就是反映食品的酸度。大部分细菌在酸性食品中不能良好生长。PH值范围为0-14，7为中性。食品的PH为4.6或以下，如大部分水果汁，称为酸性食品。食品的PH高于4.6，如肉类和蔬菜，称为低酸食品。微生物生长的PH范围革兰氏阳性细菌4.0-8.5革兰氏阴性细菌4.5-9.0霉菌1.5-9.0酵母2.0-8.5 微生物只能在一定PH范围内生长，酵母和霉菌能在较宽PH 范围内生长，而细菌条件较严格。革兰氏阳性细菌能在PH 4-8.5生长，革兰氏阴性细菌能在PH为4.5-9.0生长。所以通过利用PH能控制细菌生长。如果食品的最终PH值为4.6或以下，那么认为是处于安全的PH范围或货架稳定(保质期长)。 水活度(AW) 水活度(AW)是指供微生物能利用水的能力。水活度直接和某一溶液的水蒸汽压力相关，通过测量溶液在一密封容器中溶液上方空气的相对湿度即可获得。相对湿度除以100就等于水活度。 (AW) = RH/100 在装有水的密闭容器中，水上面的空气呈饱和状态， 相对湿度为100%，那AW为1.0。所以水的水活度为1.0。 食品其结构较复杂，所以食品中的所有水份并不都能供微生物利用。水活度可认为就是水可利用度。在纯水中水分子排列松散，能供微生物利用。水中一但加入某些物质如糖和盐，水分子就结合到添加的物质上，整个溶液的性质发生了改变。水变得受限制，只有少量的水可供微生物利用。食品的水活度差异很大。见表1，根据AW而分的食品主要种类。 表1 不同水活度范围的主要食品种类0.98以上0.98-0.930.93-0.850.85-0.600.60以下鲜肉鲜水产新鲜水果 和蔬菜奶和其它饮料罐装盐渍蔬菜罐装低糖饯水果淡炼乳番茄酱低盐渍的鱼猪肉和牛肉制品罐装咸肉制品发酵香肠蒸制香肠加工干酪古乌达干酪罐装高糖饯水果面包干制或发酵香肠干燥牛肉牛火腿成熟赛达干酪加糖炼乳中等水份食品干制水果面粉谷物果冻和果酱糖蜜高度盐制鱼制品肉浸出物坚果糖果巧可力蜂蜜面条脆点心土豆片干制蛋品奶制品和蔬菜 新鲜肉，鱼，蔬菜其水活度为0.98或以上。炼乳，咸肉，加工制干酪和面包其水活度在0.93-0.98之间；干燥肉类，成熟赛达干酪和加糖炼乳水活度在0.85以上、0.93以下。干制水果，谷物，面粉，果酱和果冻，高度盐制鱼制品和坚果是中等水份的食品，水活度在0.60到0.85之间。巧克力，蜂密和面条水活度都低于0.60。 大多数细菌包括那些与公共卫生明显相关的细菌， 一般在0.85 或以下的水活度不生长。许多酵母和霉菌在水活度为0.85以下也能生长，但主要引起腐败，一般不是食品安全问题。 干燥会导致细胞失水而造成代谢停止以至死亡。微生物的种类，环境条件，干燥的程度等均影响干燥对微生物的效果。休眠孢子抗干燥能力很强，在干燥条件下可长期不死。 渗透压： 适宜于微生物生长的渗透压范围较广，而且它们往往对渗透压有一定的适应能力。突然改变渗透压会使微生物失去活性，逐渐改变渗透压，微生物常能适应这种改变。对一般微生物来说，它们的细胞若置于高渗溶液中，水将通过细胞膜从低浓度的细胞内进入细胞周围的溶液中，造成细胞脱水而引起质壁分离，使细胞不能生长甚至死亡。相反，若将微生物置于低渗溶液或水中，外环境中的水将从溶液进入细胞内引起细胞膨胀，甚至使细胞破裂。由于一般微生物不能耐受高渗透压，所以日常生活中常用高浓度的盐或糖保存食物，如腌渍蔬菜、肉类及蜜饯等。 辐射： 紫外辐射 紫外线是非电离辐射，以波长265-266纳米的杀菌力最强。紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌剂。但由于紫外线穿透能力差，不易透过不透明的物质，故紫外杀菌灯只适用于空气及物体表面消毒。电离辐射 X射线与射线、射线和射线均为电离辐射。在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用 有机化合物： 对微生物具有有害效应的有机化合物种类很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白质变性，是常用的杀菌剂。 卤族元素及其化合物：碘：是强杀菌剂，一般都作外用药。氯气或氯化物： 氯气一般用于饮水的消毒，次氯酸盐等常用作食品加工过程中的消毒。氯气和氯化物的杀菌机制，是氯与水结合产生了次氯酸(HClO)，次氯酸易分解产生新生态氧，一种强氧化剂，对微生物起破坏用。 抑制剂食品中本身含有或人工添加一些化学物质，可以限制或防止微生物生长。盐就是供添加化学物质的一个很好的例子。化学防腐剂如亚硝酸钠，苯甲酸钠，丙酰钙也能抑制微生物生长。 第七节 微生物的生态微生物由于结构简单、繁殖快等特点，因此，它们在地球上分布远比动植物要广泛得多。（一） 土壤中的微生物土壤是微生物生活的最适环境。在土壤中分布着形形色色的微生物类群。 土壤具有微生物生命活动所必需的一切营养物质和适宜的生活条件， 土壤中的水分是一种浓度很稀的盐类溶液，其中含有各种有机和无机氮素及各种盐类、微量元素、维生素等，类似于常用的液体培养基。土壤大多是中性偏碱，适宜于大多数微生物生长，土壤中还含有气体，主要是CO2、O2和N2。大部分地区土壤温度的变化在0-30之间，并且在一年的大部分时间内其温度变化在10-25，为微生物的生长繁殖提供了有利条件。 土壤中含有大量固形有机物和矿质元素，是微生物的营养库。土壤中微生物可以分为如下几类：细菌：占土壤微生物总数的7090%，多数为腐生菌，少数是自养菌。放线菌：占土壤中微生物含量的530%，是一类异好氧菌。霉菌：主要生活在靠近地面的土壤中，在通气良好的土壤中，霉菌数量很多。酵母菌：普通作土中酵母菌含量很少。另外，作土中还分布有许多藻类及原生生物等。（二）、微生物在水中的分布 水具有微生物生命活动适宜的温度、PH、氧气等。因此，水中生长着众多的微生物类群，它们主要来源土壤、空气、动植物尸体、人和动物的排泻物、工业及生活污水。水中存在的微生物90%为革兰氏阴性菌，主要有弧菌、假单胞菌、黄杆菌等。鞘细菌及有柄附生细菌也常见于水体中。微生物在水体中表现为水平分布和垂直分布的规律。此外，相同水域的不同浓度微生物的含量及分布也不同。 通过水体传播的病原微生物主要有沙门氏菌属、志贺氏菌属、霍乱弧菌等。因此，做好水的卫生学检查至关重要。（三）微生物在空气中的分布 空气本身缺乏微生物生活所必需的营养物，日光对微生物也具有很强的杀菌作用，另外空气一般是干燥的，因此空气不是微生物生活的良好环境。 空气中的微生物主要来源于带有微生物菌体及孢子的灰尘，这类微生物大多数是腐生性的，还来源于人和动物，它们大多数是通过呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，悬浮在大气中。 空气中微生物的分布随环境条件及微生物的抵抗力不同而呈现不同的分布规律。空气中存在较多的、存活时间较长的是各种真菌、放线菌的孢子及细菌芽胞。空气中微生物的数目决定于尘埃的总量。 第二章 微生物检验基本技术第一节 显微技术显微技术是微生物检验最常用的技术之一。显微镜的种类很多，在食品微生物检验中最常用的是普通光学显微镜。光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜；机械系统包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座。普通显微镜的使用方法是先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。显微镜的设计一般是共焦点的。低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可用高倍镜观察。油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项：1）观察完后，移去观察的载玻片标本。2）用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭23次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。3）转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。4）将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或纱布等擦镜头。第二节 染色技术 微生物学用革兰氏阳性和革兰氏阴性区别不同类型的细菌。不同细菌具有不同的细胞壁。为便于通过显微镜观察细菌，应该进行染色。细菌有不同的细胞壁，故而染色结果不同。革兰氏阳性菌呈兰色，革兰氏阴性菌呈红色。 通过上述特征能反映食品中细菌的一些特点。例如，革兰氏阳性菌对酸性环境有一定的抵抗力，这类细菌对热也有一定的抵抗力，有些细菌产芽胞。 一般而言，革兰氏阴性菌则包括了那些肠道致病菌，这点十分重要，这就是食源性致病菌如何引起人体人体。 它和人体摄入食品后引起发病的速度相关，而且有助于检验员判定是哪种食品，因哪类细菌而导致发病。由于微生物细胞含有大量水分（一般在80-90%以上），对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都必须经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，任何一项技术都不是完美无缺的。染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态与结构均会发生一些变化，不能完全代表其生活细胞的真实情况，染色观察时必须注意。制片和染色的基本程序微生物的染色方法很多，各种方法应用的染料也不尽相同，但是一般染色都要通过制片及一套染色操作程序。1）制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水，用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，为避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层，若材料为液体培养物或固体培养物中洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可。2）自然干燥涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。3）固定标本干燥后即进行固定，固定的目的有三个：a.杀死微生物，固定细胞结构。b.保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。c.改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。固定常常利用高温，手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过34次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。以上这种固定法在微生物实验室中虽然应用较多普遍，但是应当指出，在研究微生物细胞结构时不适用，应采用化学固定法。化学固定法最常用的固定剂有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，12%的饿酸等。饿酸能很快固定细胞但不改变其结构，故较常用。应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的12%饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过12分钟后把标本从培养皿中取出，并使之干燥。4）染色标本固定后，滴加染色液。染色的时间各不相同，视标本与染料的性质而定，有时染色时还要加热。染料作用标本的时间平均约13分钟，而所有的染色时间内，整个涂片（或有标本的部分）应该浸在染料之中。若作复合染色，在媒染处理时，媒染剂与染料形成不溶性化合物，可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染，但也可以结合固定或染色同时进行。）脱色用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95%酒精和3%盐酸溶液。）复染脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对照，便于观察。革氏染色在酒精脱色后用番红，石碳酸复红最后进行染色，就是复染。）水洗染色到一定的时候，用细小的水流从标本的背面把多余的染料冲洗掉，被菌体吸附的染料则保留。）干燥着色标本洗净后，将标本晾干，或用吸水纸把多余的水吸去，然后晾干或微热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。）镜检干燥后的标本可用显微镜观察。以革兰氏染色法为例革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和直菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：a. 涂片固定。b.草酸铵结晶紫染1分钟。c.自来水冲洗。d.加碘液覆盖涂面染1分钟。e.水洗，用吸水纸吸去水分。f.加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。g.蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。第三节 灭菌和消毒消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法，而灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。1）利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。 干热灭菌法:a.灼烧灭菌法 利用火焰直接把微生物烧死。适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。b.干热空气灭菌法 这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。湿热灭菌法:在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。a.巴氏消毒法 有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。b.煮沸消毒法 直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养体和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.间歇灭菌法 上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100C，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。d. 加压蒸汽灭菌法 这是发酵工业、医疗保健、食品检测和微生物学实验室中最常用的一种灭菌方法。它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在1520分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。2）利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面：接种室、手术室、食品或药物包装室常应用紫外线杀菌。第四节 培养基制备技术、玻璃器皿的清洗在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。 1）新购的玻璃器皿除去包装沾染的污垢后，先用热肥皂水刷洗，流水冲净，再浸泡于的工业盐酸中数小时，使游离的碱性物质除去，再以流水冲净。对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上将水空干，即可使用。2）用过的玻璃器皿凡确无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用后可随时冲洗，吸取过化学试剂的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必须经过适当消毒后，将污垢除去，用皂液洗刷，再用流水冲洗干净。若用皂液未能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。洗液的主要成份是重铬酸钾和浓流酸，其作用是将有机物氧化成可溶性物质，以便冲洗。洗液有很强的腐蚀作用，使用时应特别小心，避免溅到衣服、身体和其他物品上。培养基根据培养基的用途来区分，可分为选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基等。选择培养基 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。增殖培养基 在自然界中，不同种的微生物常生活在一起，为了分离我们所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。鉴别培养基 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。、培养基制备的基本方法和注意事项 依据使用目的，按照标准方法中规定的要求进行配制。并作好培养基的制备记录 1）培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。完全称取完毕后，还应进行一次检查。 2）培养基各成份的混合和溶化培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。3）培养基pH的初步调正因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH，保证培养基的质量。PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。 4）培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此 ，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。5）培养基的分装培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。6）培养基的灭菌一般培养基可采用121C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50C左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。7）培养基的质量测试每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。将全部培养基放入361C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，培养2448小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。8）培养基的保存培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。第五节 细菌的接种、分离纯化和培养技术、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。在实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。常用的接种方法有以下几种：划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ）无菌操作培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌的条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上。这个过程叫做无菌接种操作。在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒剂擦洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也应越少越好。为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。用于接种的器具必须经干热或火焰等灭菌。接种环的火焰灭菌。方法：通常接种环在火焰上充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。在向培养皿内倒培养基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。、分离纯化含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。）倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在4050左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。）涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。）平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法如图3-1所示。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。）富集培养法富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。）厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。、培养微生物的生长，除了受本身的遗传特性决定外，还受到许多外界因素的影响，如营养物浓度、温度、水分、氧气、等。微生物的种类不同，培养的方式和条件也不尽相同。1）根据培养时是否需要氧气，可分为好氧培养和厌氧培养两大类。好氧培养：也称“好气培养”。就是说这种微生物在培养