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动脉粥样硬化兔血管平滑肌大电导钙激活钾通道KCMB1基因的mRNA表达量的变化研究双流县第一人民医院 帅锋利 苏代泉 提要：目的 研究动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)时动脉血管平滑肌细胞大电导的钙激活钾通道(Large-conductance Ca2+-activated K+ channel, BKca)1亚单位（KCMB1）基因mRNA定量表达,探讨KCMB1基因在AS发生中的作用。方法 建立兔AS模型，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），检测AS时胸主动脉KCMB1基因的mRNA表达变化。结果 大电导的钙激活钾通道KCMB1基因在动脉粥样硬化组胸主动脉中表达明显减少。结论 大电导的钙激活钾通道1亚单位调节血管平滑肌细胞的舒张，可能与AS的发生有一定的关系。 关键词 动脉粥样硬化；血管平滑肌；钙激活钾通道；基因表达；逆转录-聚合酶链反应；兔动脉粥样硬化（Atherosclerosis ,AS）是累及全身动脉系统的慢性血管疾病,其病变主要累及大、中动脉。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMC）是动脉粥样硬化斑块中的重要细胞成分，中膜平滑肌细胞向内膜下迁移并增殖是动脉粥样硬化病变的特征。离子通道是介导离子进出细胞膜的特殊蛋白质系统, 研究表明BKca通道活性改变导致血管张力变化，造成缺血的病理生理状态。血管平滑肌的BKca通道1亚单位，其基因为KCMB1。关于AS时KCMB1基因的mRNA表达量的变化，国内外均未从分子生物学水平对其作出研究。本研究应用RT-PCR技术研究兔AS时KCMB1基因mRNA表达量的变化，初步探讨 KCMB1基因在AS发病中的作用。1 材料与方法1.1 动物及AS模型的建立本实验采用3月纯系新西兰兔20只，体重2.00.2Kg，雌雄各半，由泸州医学院实验动物中心提供。随机分为AS组和对照组，每组各10只。实验组喂高脂饲料（由79.5%普通饲料+0.5%胆固醇+5%猪油+15%蛋黄粉组成），3周后减去饲料中的胆固醇，再喂9周，共12周。对照组仅喂普通饲料，喂12周。1.2 AS模型的鉴定喂养12周后，经兔耳缘静脉注射空气致死。取出胸主动脉，迅速剪取1.0cm的组织行后续的操作，余下的胸主动脉肉眼观察主动脉内壁AS病变特点，光学显微镜和透射电镜观察AS病变结构特征。以半定量法1判断每只兔主动脉损伤程度分值。1.3 总RNA的提取取新鲜兔胸主动脉组织50-80mg，剪成碎片放入研钵中加入Trizol Reagent l ml研磨，匀浆后加入0.2 ml氯仿，离心后吸取上清，加入0.5 ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，75乙醇洗沉淀， RNA溶于DEPC水，凝胶电泳和分光光度计检测纯度和浓度。1.4 逆转录步骤模板cDNA的合成，按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明进行操作。1.5 引物的设计与合成根据genebank中兔KCMB1和GAPDH基因序列设计两者引物，上下游引物均设计为跨过内含子；引物与TaqMan探针由上海生工合成并经质量检测。表1 KCMA1 和GAPDH的引物和探针序列：基因 引物名称 引物序列 扩增片段长度（bp） KCMB1 上游引物 5-GAAGTTGGTGATGGCCCAGAA-3 下游引物 5-CTGGGTCCACACGCTTTTCT-3 155 TaqMan 探针 5 FAM-CCAGGATGATAGGTGATGAC-TAMRA3 GAPDH 上游引物 5- GCCATCACTGCCACCCA -3 下游引物 5- CAGTGAGCTTCCCGTTC-3 139 TaqMan探针 5FAM -CCGCCCAGAACATCATCCCTG- TAMRA 3 1.6 RT-PCR扩增目的基因优化后的PCR反应体系为30l：10buffer(Mg2+ free)3l, MgCl2(2.5mmol/L)3l, dNTP(0.3mmol/L)1l,上游引物(0.3M)0.5l, 下游引物(0.3M)0.5l, 探针(0.3M)10l, Taq酶(0.05u/l)0.3l, ddH2O9.7l, cDNA 2l。用空白对照排除污染可能。配制混合物充分混匀后平均分配至96孔PCR板中，反应条件如下，94 3min，94变性10s，53退火20s、60延伸40min，共40次循环。1.7 待测样本中目的基因相对拷贝数的测定在同样的反应条件下行PCR扩增，绘制动力学曲线，得出待测样品的相对拷贝数。首先以循环数Ct为纵坐标，分别以KCMB1基因CDNA和GAPDH基因CDNA为标准品，各稀释度的起始靶DNA拷贝数的对数值为横坐标做标准曲线。只要标准曲线的相关性好，就从平行进行的标本Ct值和相应的内参照Ct值来估计靶基因的相对含量，应用公式为2，3：根据靶基因和内参照基因的标准曲线用公式Y=101/Ct（Ct 等于靶基因DNA每稀释10时，平均增加的Ct值数）；分别计算两者Ct值每减少一个循环时对应的模板DNA的增加倍数，求出Y值；分别求出正常对照组内参照基因GAPDH和靶基因KCMB1的相对含量，公式为Y靶Ct靶基因均值-Ct靶基因，公式的意思是正常组织中不同个体靶基因相对于靶基因Ct均值的模板数每减少或增加1个循环时对应的模板DNA增加或减少的倍数。同理可求出内参照基因GAPDH的相对含量公式为：Y内参照Ct内参照基因均值-Ct内参照基因；求出的同一个个体的靶基因和内参照基因的相对含量之比，代表这个个体正常组织中靶基因表达水平；同理可求出动脉粥样硬化组的靶基因表达水平；对靶基因在正常组织中和动脉粥样硬化组中的表达情况进行统计学处理。1.8 统计学分析所有数据用s表示，用SPSS11.5for Windows统计软件统计，进行独立样本t检验。2 结果2.1 AS 模型的鉴定主动脉损伤分值AS 组与对照组 (2.90.53) 分vs (0.180.32)分比较,差异有显著性意义( P 0. 01) 。2.2正常对照组动脉粥样硬化组的RNA浓度(80643)vs (82060)g/ml;两组OD260/OD280比值分别为1.850.11 vs 1.920.36,差异无显著意义（P 0.05）。2.3 标准曲线制作结果根据标准曲线的斜率，可以计算出多聚酶链反应每增加一个循环，GAPDH基因的cDNA模板扩增拷贝数增加1.93倍(图1)。图1 GAPDH基因扩增的对数标准曲线根据标准曲线的斜率，可以计算出多聚酶链反应每增加一个循环，KCMB1基因的cDNA模板扩增拷贝数增加1.83倍（图2）。图2 KCMB1基因扩增的对数标准曲线2.4 RT-PCR检测KCMB1基因mRNA表达量计算KCMB1基因cDNA拷贝数相对于GAPDH基因cDNA拷贝数的倍数，进行独立样本t检验，AS组KCMB1基因表达水平为0.820.30,对照组1.680.61。经独立样本t检验，AS中KCMB1基因的表达低于对照组，统计分析有显著意义。3 讨论血管平滑肌细胞钙激活钾通道参与细胞膜动作电位复极,在调节血管张力方面起着重要作用。BKca通道作为平滑肌兴奋调节因素的功能与1亚单位密切相关, 1亚单位通过调节该通道的钙敏感性,在翻译钙信号对血管调节这一主要生理功能的调控中,成为一种关键的组分。BKca通道对于钙的反应性依赖于和1亚单位之间的相互作用,敲除1亚单位的BKca通道对钙无反应3。在正常动脉平滑肌细胞BKca通道1亚单位的存在增加VSMC对胞内Ca2+和细胞膜电位的敏感性4。Amberg5等应用RT-PCR分析SHR（自发性高血压）大鼠脑动脉VSMC1亚单位的mRNA比正常血压鼠表达降低，而亚单位mRNA表达无改变，应用免疫荧光分析发现1 亚单位蛋白表达在SHR明显下降。而在血管紧张素引起的高血压鼠也发现脑动脉VSMC1亚单位的mRNA表达也降低6。这表明高血压时，BKca通道数量（由亚单位决定）并未改变，而是其1 亚单位表达降低导致BKca功能异常所致。有研究发现在1 亚单位基因敲除的小鼠中，钙离子的释放与超极化电流激活之间的偶联被阻断，导致血压升高。Nishimaru研究了随着增龄，幼年和老年F344大鼠的BKca功能和药理特性及冠状动脉细胞亚单位和转录水平变化，发现F344大鼠随着年龄的增加冠状动脉的1亚单位功能和分子表达会减少8。在老年F344大鼠平滑肌细胞发现1 亚单位转录也相应下调。本研究结果中，AS组BKca通道的1亚单位的KCMB1基因的mRNA表达下调，低于对照组。1亚单位在内向钙离子流（Ca2+sparks）BKca通道膜去极化、VSMC舒张的信号传导通路中起重要调节作用，1 亚单位在AS发生机制中的作用，可能是BKca通道1 亚单位表达的下调，使BKca通道和Ca2+sparks的不协调，细胞膜偏向于去极化而使细胞内Ca2+增加，VSMC收缩导致BKca通道在血管张力调节中负反馈调节作用下降，血管阻力增加。由于血管阻力增加，内皮细胞易受损，致使内皮功能障碍，促进动脉粥样硬化的发生发展。另外，推测钾通道1 亚单位mRNA的表达减少,可能与平滑肌细胞的增殖有关，促进动脉粥样硬化的发生。由于AS是一个复杂的病理过程,以往的研究多侧重于研究AS时BKca通道电生理特性的改变，本实验是在mRNA水平对BKca通道的1 亚单位的定量检测，可仅有这些研究是相对片面的，还需要做进一步全面和精确定量的研究。参考文献1. Mccully KS, Wilson RB. Homocysteine theory of arteriosclerosis J. Atheriosclerosis, 1975; 22(2): 215-2272. Livak KJ,Schmittgen TD .Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-time Quantitative PCR and the 2CT MethodsJ2001；25：402-4083. 孔 莺，陈 尧，周总光.直肠癌相关新基因的荧光定量PCR检测J. 实用肿瘤学杂志，2OO4;l8(6):401-4064. Brenner R, Perez GJ, Bonev AD, et al. Vasoregulation by the 1 subunit of calcium- activated potassium channel J. Nature, 2000; 407(6806):870- 8765. Amberg GC, Bonev AD, Rossow CF, et al. Modulation of the molecular composition of large conductance, Ca2+ activated K+ channels in vascular smooth muscle during hypertension J. Clin Invest, 2003; 112(5): 717- 7246. Amberg GC, Santana LF. Downregulation of the BK channel 1 subunit in gen