（有机化学专业论文）甜味蛋白thaumatin晶体生长及重原子衍生物制备方法研究.pdf

中山大学硕士学位论文 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制备方法研究 专业：有机化学 硕士生：莫凌霄 指导老师：蔡继文教授 摘要 本实验以一种提取自植物果实的甜味蛋白质t h a u m a t i n 作为研究对象，对其 进行基础的晶体学研究。同时在前人对甜味蛋白机理的研究成果上，希望通过共 结晶法制备对t h a u m a t i n 甜味有影响的几种盐和蛋白质的共结晶物，以研究甜味 蛋白的致甜机理。 研究重点集中在蛋白质晶体生长影响因素和晶体重原子衍生物的制备上。寻 找蛋白质晶体生长的优化条件一直是晶体生长工作者的目标，虽然不同的蛋白质 有着不同的生长条件，很难提出一个适合所有蛋白质晶体生长的条件，但是我们 可以通过研究一些常见因素对某种蛋白质晶体生长的影响来为其他蛋白质晶体 生长的研究提供一些经验指导。对于t h a u m a t i n 晶体重原子衍生物的研究并不多， 在已有研究中没有发现有关金属离子在t h a u m a t i n 蛋白晶体中结合位点的报道。 制备重原子衍生物一方面可以研究重原子与蛋白质的结合位点，另一方面常被用 来解析未知蛋白质的结构。 在对晶体生长影响因素的研究中，我们用悬滴法通过观察、对比不同条件下 晶体的生长情况，得到主要的影响因素以及每种因素对晶体生长的影响规律。主 要考察因素为温度( 2 7 7 k 和2 9 3 k ) 、蛋白质溶液浓度( 4 0 m g m l 和2 0 m g m l ) ， 沉淀剂浓度( 包括酒石酸钠钾盐和乙二醇) 、悬滴中蛋白质溶液和池液比例 ( 3 p l ：2 t t l 和2 l ：2 此) 。研究手段为显微镜法观察悬滴中溶液状态及晶体生长 情况，用x 射线衍射实验的方法来对晶体进行表征。 在重原子衍生物制备研究中，我们采用浸泡法来制备衍生物。同时由于s a d 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制备方法研究 结构解析法的种种优点，我们也尝试用新报道过的碘扩散法来制备可以用于s a d 法的碘原子衍生物，并尝试了用于s a d 法数据收集方法。 最终我们在所研究的4 种影响因素中找到了主要影响因素及其影响规律。得 到了高质量，高衍射分辨率的t h a u m a t i n 单晶，并且在可重复制备蛋白质晶体的 基础上用碘扩散法得到了晶体的碘原子衍生物。 关键词：甜味蛋白，晶体结构，s a d 法，碘原子衍生物 中山大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h ec r y s t a l g r o w t ho ft h es w e e tp r o t e i n t h a u m a t i na n dt h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so ft h eh e a v y a t o md e r i v a t i v e s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：l i n g x i a om o s u p e r v i s o r ：p r o f j i w e nc a i a b s t r a c t w et a r g e to nt h es w e e tp r o t e i nt h a u m a t i nw h i c hi se x t r a c t e df r o mt h ef r u i to fo n e a f r i c a np l a n t7 ，妇“肋c c l 龉d a n i e l l i it os t u d yo nt h ef u n d a m e n t a lc r y s t a l l o g r a p h y m e t h o d s t og e tab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h es w e e tm e c h a n i s m , w ea l s o 廿i e dt o o b t a i nt h e 眦r y s t a l so f s w e e tp r o t e i na n dt h ec o m p o u n d sw h i c h 撒r e p o r t e dt oa f f e c t t h es w e e td e n s i t yo f t h a u m a t i n o u rs t u d yf o c u s e do nt h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h eg r o w t ho fp r o t e i nc r y s t a l s ，a sw e l la s t h e p r e p a r a t i o nm e t h o d so fh e a v ya t o md e r i v a t i v e s a sw e a i l k n o w , t h e c r y s t a l l o g r o p h i e ra l w a y sw a n t e dt of i n do u tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rp r o t e i n c r y s t a lg r o w t h d i f f e r e n tp r o t e i n sm a yh a v ed i f f e r e n tg r o w t hc o n d i t i o n s ，a n di t s i m p o s s i b l et of i n do u tag e n e r a lc r y s t a l l i z i n gc o n d i t i o ns u i t e df o ra l lp r o t e i n s o u r s t u d yo nt h e f a c t o r sa f f e c t i n gac e r t a i np r o t e i nm a ys o m e h o wo f f e ru ss o m e e x p e r i e n c e so no t h e rp r o t e i n s c r y s t a lg r o w t h b yn o w , t h e r ei sl i t t l es t u d yn e i t h e ro n t h eh e a v ya t o md e r i v a t i v e s , n o r0 1 1t h em e t a lb i n d i n gs i t ei nt h ec r y s t a l so f t h a u m a t i n s ot h es t u d yo nt h ep r e p a r a t i o no f h e a v ya t o md e r i v a t i v e sw h i c hc o u l ds h o wt h ed e t a i l i n f o r m a t i o no nt h ec o r r e s p o n d i n gb i n d i n gs i t e so ft h ep r o t e i nm i g h th e l pu sf i g u r eo u t t h es w e e tm e c h a n i s m 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制备方法研究 b ys t u d y i n gt h ea f f e c t e df a c t o r si nt h ep r o t e i nc r y s m lg r o w t h ，w ec o m p a r e dt h e p h e n o m e n o ni np r o t e i nd r o p su n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n su s i n gt h eh a n g i n gd r o p d i f f u s i n gm e t h o dt of i n do u tt h ek e yf a c t o r sa n dt h er u l e sb yw h i c ht h e ya f f e c t e dt h e c r y s t a lg r o w t h f o u rf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e da t2 7 7 ka n d2 9 3 k ，t h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i ns o l u t i o n f o r4 0 m g m la n d2 0 m g m l ，t h ec o n c e n t r a t i o no f p r e c i p i t a t e s i n c l u d i n gs o d i u mp o t a s s i u mt a r t r a t ea n dg l y c o l ，a n dt h ep r o p o r t i o no fp r o t e i ns o l u t i o n a n dw e l ls o l u t i o n t h em i c r o s c o p ew a su s e dt ow a t c ht h ep h e n o m e n o ni nt h e d r o pa n d t h ec r y s t a lg r o w i n gs i t u a t i o n ，a n dt h ec r y s t a l sw e r ec h a r a c t e r i z e db yt h ex r a y d i f f r a c t i o na n a l y s i s 。 i nt h es t u d yo ft h eh e a v ya t o md e r i v a t i v e sp r e p a r a t i o n ，s o a k i n gm e t h o dw a su s e dt o p r e p a r et h ed e r i v a t i v e s w ea l s ot r i e dt h en o v e lm e t h o dc a l l e dv a p o ri o d i n el a b e l m e t h o dt oo b t a i nt h ei o d i n ed e r i v a t i v e s ，b e c a u s et h i sk i n do fd e r i v a t i v e sc a nh e a p p l i e di ns i n g l ea n o m a l o u sd i f f r a c t i o nt os o l v et h ep h a s ep r o b l e m f i n a l l y , w ef o u n do u tt h ek e yf a c t o r so ft h ef o u ri n v e s t i g a t e do n e sa n dt h ep a t t e r n s t h e ya f f e c t e d f o l l o w i n gt h ep a r e m s ，w eo b t a i n e dh i g hq u a l i t yc r y s t a l sw h i c h d i f f r a c t e dw e l li nx r a yd i f f r a c t i o ne x p e r i m e n t s b e s i d e s ，t h ei o d i n ed e r i v a t i v e sw e r e p r e p a r e ds u c c e s s f u l l yb yt h ev a p o ri o d i n el a b e lm e t h o d k e y w o r d s ：s w e e tp r o t e i nt h a u m a t i n ，c r y s t a ls t r u c t u r e ，s i n g l ea n o m a l o u sd i f f r a c t i o n ( s a d ) m e t h o d , i o d i n ed e r i v a t i v e s 中山大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1蛋白质结构研究背景 1 1 1蛋白质结构研究及其研究方法的发展 了解蛋白质的三维结构及其与功能的关系现在已经成为科学研究的前沿。这 是由于生物大分子( 蛋白质、多肽、核酸等) 以及其复合物参与了生物体内几乎 所有的生命活动，是生物体内各种生物功能的主要执行者，而生物大分子三维结 构的解析可以为认识这些生命活动提供更加全面的信息，可以帮助解释很多生物 方面的实验数据，同时精确的三维结构信息让定点突变和基于结构的药物分子设 计成为可能。所以蛋白质以及其复合物的三维结构的测定是解释生命活动机理， 研究生物体中分子结构和功能关系，揭示生命现象本质的研究基础。目前为止已 经解析出了很多生物大分子的三维结构，其中对这些三维结构进行的深入研究使 得我们了解到了很多生物大分子结构和活性之间相互关系。 研究蛋白质三维结构主要有三种方法，分别为x 射线蛋白质单晶衍射、核 磁共振( n m r ) 和三维电镜的方法。其中，n m r 法只能测定生物大分子在溶液 中的结构，所以其一般被用于研究分子在溶液中的动力学特性。其缺点是只能解 析相对小分子量的蛋白质( 约小于3 0 k d ) f i 】，而且分辨率不是很高。三维电镜 适用于研究大的生物大分子复合物体系、膜蛋白以及全病毒的结构。除此以外， 还有如中子衍射、荧光、电子衍射之类的光谱技术和显微技术以及计算机模拟的 方法也对生物大分子的结构研究有一定的辅助作用。x 射线单晶衍射技术则适用 于研究各种大小的蛋白质结构，可以测定分子量达l o7 d 的全病毒以及2 5 x1 0 6 d 级别的核糖体1 2 3 1 ，同时其可在原子水平上对蛋白质等的精细三维结构进行研究。 这些优点使得其在结构生物学研究中一直占据着不可替代的位置。 1 9 1 2 年l a u e 发现晶体对x 射线衍射，这就预示了x 射线晶体学的时代的 到来 4 1 ；随着b r a g g 点阵理论的发现，无机小分子晶体结构的测定，直到早期 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制备方法研究 d h o d g k i n 教授应用这个方法得到了胆固醇、维生素d 、青霉素和维生素b 1 2 的 结构，至今的1 0 0 年间x 射线晶体学技术一直飞快的发展着。蛋白质等生物大 分子的结晶学可以追溯到十八世纪三十年代，此后人类基因组的发现和后基因组 时代的到来让蛋白质晶体学的三维结构解析成为揭示很多生物生理活动以及相 关疾病的重要部分。 伴随着新的生物技术，如自动化筛选技术、重组d n a 技术等的不断发展， x 射线衍射大分子结晶法已经成为最重要的测得大分子结构的方法之一。而近年 来结构测定方法和所用仪器的快速发展及改进更加巩固了x 射线单晶衍射技术 在蛋白质结构测定中的主要地位。可变波长的同步辐射加速器的使用和多波长反 常散射方法的发展让我们更容易获得高分辨率和高质量的衍射数据：冷冻技术的 应用使得能在低温收集数据，降低了对晶体的辐射损害和对晶体的质量要求：各 种面探测器和c c d 的出现很大程度上提高了数据的收集速度；而计算机技术的 日益更新更加为晶体学的发展提供了强有力的计算工具。截至到2 0 0 7 年4 月1 2 日，在发表的4 2 7 5 2 个生物大分子结构中，有3 6 3 2 6 个结构都是用x 射线单晶 衍射技术得到的( 统计数据来自p r o t e i n d a t a b a n k 官方网站) 。蛋白质晶体结构 这种常用的技术方法可以为我们提供丰富的信息，比如特定原子的位置及其间的 作用关系、溶剂的亲合力、分子内的弹性区域等等，一般3 a 以上分辨率的结构 就可以得到这些基本信息了。 1 1 2蛋白质结构的应用 蛋白质结构的贡献之一就是蛋白质3 d 结构信息在生物化学和生物研究中的 显著作用。如果我们想要明白生物作用过程和机理，就要研究生物体内细胞中的 动态过程，对这种动态过程的应答机制，外界化学和物理作用力怎么对大分子作 用以及这种作用是怎么被调节的，怎么被传递的；那么首先我们就要知道大分子 或是它们的复合物的结构。这样以精确的三维结构为基础可以并且已经揭示了很 多重要生命过程。有名的例子之一就是细菌光合作用中心复合物以及细菌集光蛋 白复合物三维结构的阐明，比较完整地揭示了细菌光合作用的运行机理和光能高 效传递的时空关系和分子机制。 中山大学硕士学位论文 此外，3 d 结构信息有助于在新药的研制和发现中进行合理药物设计【5 ，6 l 。因 为一旦我们得到一个有活性位点的有效酶的结构，就可以合理地设计可能的先导 化合物，通过看它们是否可以抑制或者影响酶的作用来进行筛选：同时一些病毒 蛋白结构的发现也为病理学研究提供了重要依据，比如，h i v 蛋白酶以及与h i v 有强结合能力的糖蛋白c d 4 的三维结构的报道，还有抗体抗原复合物结构的测 定使我们对免疫反应机制和规律有了深入了解。 另一个重要贡献是其在蛋白质基因工程中的应用，也即有一种结构指导使得 能有目的得，而不是盲目地对蛋白质进行基因水平上改造。观察到突变后的结构 改变后，我们可以更有效的改变化学或是物理因素来进行突变从而达到改造目的 川。 1 2 蛋白质晶体特性及x 射线衍射法研究蛋白质结构的过程 1 2 1 蛋白质晶体与小分子晶体比较 作为结晶中的“大人物”，蛋白质晶体的特性也很重要。了解蛋白质晶体的 特性有助于我们在结晶实验中更好地对实验进行设计。 由于蛋白质的特殊性质，蛋白质晶体同小分子晶体的差别是很大的。 首先，晶体中的溶剂含量不同。通常蛋白质晶体中平均含有5 0 左右的溶 剂，虽然这个含量从2 0 到9 0 不等，但也远比小分子晶体中的含量要大。这 使得晶体中的溶剂与周围溶液很容易交换，让小分子自由扩散进出晶体，同时晶 体中蛋白质问有相对更大的空间可以容纳相关小分子。一个实证就是酶结晶通常 表现出强的催化活性。 其次，蛋白质晶体中分子间作用键( 盐桥、氢键、疏水作用力等) 的数目与 分子质量的比例比起通常的小分子要低很多，这导致了蛋白质晶体中晶格作用力 很弱。 此外，溶剂通道和充满溶剂的空穴造成了蛋白质结构的复杂性和构象动力学 作用，并且由于分子间相对大的空间和晶体间弱的晶格力，使得晶体中的分子不 占据一定的位置和取向，所以即使在一个特定晶体中蛋白质分子也可能在多肽链 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制各方法研究 或是侧链基团的相对位置上有微小的结构变化，这种结构易变性造成了衍射花样 中有限的精确度，也使得蛋白质晶体有形态多样性( 如图1 1 ) ；即使对于同一种 蛋白质，在不同条件下结出的晶体也可能有完全不同的形态和外型，甚至是晶胞 参数等【8 】。 图l l 几种蛋白质的晶体( a ) 促黄体生成激素的p 亚单位，( b ) 烟草花叶卫星病毒 ( s a t e l l i t et o b a c c om o s a i cv i r u s ) ，( c ) c h 2 结构域切除的人体抗体，( d ) 甜味蛋白 t h a u m a t i n ，( e ) 雀麦草( b r o m e ) 花叶病毒，( f ) 种子中的刀豆球蛋i ! t ( c a n a v a l i n ) 小分子晶体一般有强的晶格力，相对高度有序的。它们一般物理强度较大比 较硬，易破碎，在空气中稳定，所以容易操作：有很好的光学特性，适于x 射 线衍射。相比较起来，蛋白质晶体衍射实验对蛋白质晶体的体积要求就高一些， 而且蛋白质晶体比较软，暴露在空气中容易失水、风化成粉，对温度和射线敏感， 故操作起来难度要高很多：此外它们的光学特性不如小分子晶体，在x 射线衍 射中表现也差一些。 除了上面提到的不同点外，蛋白质晶体还有其他不同于普通小分子晶体的三 个特点：第一，大分子可能呈现不同的形态，比如沉淀，油状物，凝胶或者晶体， 其中很多是在动力学上有利的。第二，对大分子而言，要达到使其长出晶核的超 4 中山大学硕士学位论文 饱和状态比维持晶核生长的状态要高得多，通常高出两到三个数量级。第三，由 于体积大，扩散度低，相互作用弱并且不易从成核转入生长状态，大分子晶体成 核和生长的动力学比普通小分子慢很多。 蛋白质晶体的这些性质使得蛋白质结晶比小分子结晶复杂很多，两者的生长 方法和解析过程都有很大的差异。在后面的实验中我们可以看到这种差异。 1 2 2x 射线衍射法研究蛋白质结构的简要过程 第一步结晶：解析蛋白质晶体结构的前提是制备均一的蛋白质样品并得到 其单晶。在多数情况下，这一步需要通过大量的条件筛选和优化以使长出的单晶 符合衍射实验的条件。 第二步数据收集：通常利用x 射线光束照射在一定角度范围内旋转的蛋白 质晶体，同时记录晶体对x 光散射的强度。强度值被转换为结构测定中的结构 因子振幅( 1 f i ) 。 第三步相角的测定：结构因子振幅( i f i ) 及相角( c t h u ) 是物理上相对独 立的量。由于结构因子相角的全部信息在收集数据时丢失，因此必须通过其他途 径来得到它们的信息。相角问题是续晶体获得之后的又一个难题。 第四步相角的改进：电子密度图的质量及其后的可解释性主要决定于相角 的准确性。有的情况下采用晶胞不对称单元中等价部分的电子密度平均，有可能 大大改善误差较大的初始相角，使其得到优化。 第五步电子密度图的计算：相位确定后可以开始计算电子密度图。对于高 分辨率的数据( 衍射数据至少达到3 5 a ) ，从电子密度图就可以跟踪出肽链走向、 二级结构等，从而可能推出肽链的三维折叠方式等。再在一级结构( 氨基酸序列) 的基础上构建出原子坐标形式的蛋白质结构模型。 第六步结构精修：结构的修正可以采用程序中的自动修正，或者手工进行。 精修可以键长、键角，b f a c t o r 等的限制为依据来进行。此外精修中需要加入位 于蛋白质周围并同其有直接作用的水分子，从而方便考查氢键作用。精修这步一 般需要反复进行，以取得更好的数据和更精确的结构。 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制各方法研究 1 3 甜味蛋白t h a u m a t i n 研究背景 1 3 1蛋白质来源 t h a u m a t i n 是一类存在于热带植物t h a u m a l o c o c c u $ d a n i e l l i ib e n t h 果实中的 甜蛋白。该蛋白具有组织表达特异性，仅发现于这种植物的肉质假种皮中。1 9 7 2 年，荷兰科学家v a n d e r w j l 首次将其从该植物浆果中提取出来 9 1 。天然提取出 来的t h a u m a t i n 结构并不完全一样，其由一个多基因的家族编码，最少存在6 7 种相近的蛋白质产物，其中最主要的两种蛋白为t h a u m a t i ni 和i i ，其分子量分 别为2 2 ，2 0 9 d a 和2 2 ，2 9 3 d a t t o l 。这两种蛋白由2 0 7 个氨基酸组成，只有5 个残基 的不同。 目前t h a u m a t i n 的来源主要有两个方面：一、天然植物提取 9 1 ：从果实原料 中一般采用提取单一的水抽提法，为了保持产品的天然特性，仅利用物理方法进 行过滤和超滤，再通过凝胶过滤、离子交换色谱分别得到纯的t h a u m a t i ni 和i i 。 据报道l k g 果实可提取出9 0 0 m g 的t h a u m a t i n ：二、利用基因工程：将重组的 t h a u m a t i n 基因在微生物或植物中进行表达，再将其提取出来。此外改变基因序 列可以得到不同味道特性的蛋白【】。 1 3 2 t h a u m a t i n 的特性 研究发现这种甜味蛋白是一种碱性蛋白。极易溶于水，但是不易溶于有机溶 剂，其等电点约为1 2 0 ，并且其等电点和甜味活性按着c ，b ，孔i 和i i 的顺序依次增 加【”j 。肽链中存在的1 6 个半胱氨酸可以形成8 个二硫键，二硫键被还原的 t h a u m a t i n 会有一种快速的自我水解作用，并且在合适底物存在的情况下，被还 原的t h a u m a t i n 会显示出蛋白酶、酰胺酶及酯酶活性。有文献 t 3 l 通过研究 t h a u m a t i ni 和i i 的光谱学性质发现在温度逐渐升高的情况下蛋白会发生可逆的 构象改变，并且在固定温度下改变p h 时，会发生不可逆热变性。在p h i 5 0 时天 然构象最稳定，此时加热至q 7 5 c ，构象变化也是可逆的。还有研究发现在p h ，j , 于5 5 ，温度高于1 0 0 c 时这种蛋白质也不会失去甜味【1 4 1 。即使在巴氏杀菌法的条 6 中山大学硕士学位论文 件下蛋白质也仍然是稳定的，将t h a u m a t i ni x 一个小时后，一旦其冷却下来它的 甜味就会恢复【1 5 l 。这种稳定性可能跟其二硫键有判1 6 1 。还有研究报道1 1 7 1 3 1 对蛋 白质中赖氨酸等残基进行突变可以影响其甜味，所以这些残基可能在其引起甜味 的过程中起到重要作用。 t h a u m a t i n 的另一个特性就是可作为食品。这种蛋白可以引起甜味，并且它 的甜度是等质量蔗糖的3 0 0 0 倍。它的甜味持续时间长。对人体和动物都无害，并 且不会引起牙病，可被糖尿病人食用【1 9 1 。早在1 9 7 9 年，t h a u m a t i n 就已经在日本 市场上被作为甜味剂和调味剂商品来出售了，并被美国的f e m a 批准用于口香糖 生产中刚。 1 3 3t h a u m a t i n 的主要研究方向 迄今为止关于t h a u m a t i n 的研究集中在3 个方面： 1 3 3 1 晶体学基础研究 由于t h a u m a t i n 是最早通过x 射线单晶衍射法得到三维结构的蛋白质之一，又 因为其提取纯化比较简单，蛋白质容易得到，所以t h a u m a t i n 经常被用于基础的 晶体学研究中。 在一些基本的理论研究中，t h a u m a t i n 常被做为实验对象进行研究来为蛋白 质晶体学研究提供数据。比如在失重情况下生长t h a u m a t i n 的晶体，通过对其结 晶的动力学研究，来观察失重情况对蛋白质晶体的生长影响 2 1 1 。为了考察一些物 理化学因素对蛋白质结晶的贡献，有人通过动态光散射方法对t h a u m a t i n 的结晶 体系进行研究 2 2 1 ；在a f m 法 2 3 1 研究大分子结晶中的表面形态学、生长动力学、 结构缺陷等方面和考察压力和凝胶( 如甘油) 对蛋白质晶体质量和生长影响 2 4 2 s ! 时，t h a u m a t i n 也被作为主要研究对象之一。此外在晶体性质研究中，t h a u m a t i n 被用作标准蛋白，通过凝胶穿刺技术探讨毛细管中晶体生产速率而用来模拟生长 细胞中晶体的生成情况瞄】。 1 3 3 2 甜味机理的研究 虽然甜味剂使用时间已经长达一个世纪了，但是甜味剂，包括甜昧蛋白和小 分子甜味剂的致甜机理都还一直没有弄清楚。而t h a u m a t i n 作为一种典型的甜味 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制各方法研究 蛋白自然是一直以来的研究对象。对t h a u m a t i n 的甜味机理研究一般从两个方面 入手：一方面在t h a u m a t i n 本身构效关系研究中，通过其晶体结构及衍射结构数 据，再结合味觉实验等手段，了解其结构与甜味产生间的关系。比如，知道侧链 氨基酸的排列方向，可以确定哪个侧链与受体分子相互作用，或者同另一侧链的 疏水或氢键作用。通过加强或减小这些内部作用可能产生的味觉效果。再比如， 知道了甜味产生的活性位点，就可以设计出与其相似的蛋白质或者肽链，生产出 更好口感的甜味剂。另一方面在味觉研究中，因其于甜味受体的强结合作用，用 作探针来研究甜味产生机理，以便更好地了解其与受体相互作用以及甜味产生机 理。 1 3 3 3 转基因研究 在工业生产中，人们将基因工程等应用于其生产研究中，以生成出低成本高 产量的转基因产物，或者研究开发出更好的新型品种。 由于t h a u m a t i n 来源植物对生活环境有严格要求，在很多地方引种都不能成 功，不能满足人们对这种甜味蛋白的大量需求。为了得到大量的t h a u m a t i n ，科 学家们曾先后将其克隆到大肠杆菌、酵母中，但因缺乏相应的蛋白质加工系统， 其在基因转录后难以形成正确的高级结构，所以得不到所需的蛋白质产物。于是 发展了其植物基因工程。1 9 9 0 年，w i t t y 等总结前人经验，利用毛根转化技术成 功地将t h a u m a t i n 基因在马铃薯中进行了表达，使得t h a u m a t i n 成为第一个在转基 因植物中被表达的甜味蛋白【硎。 1 4 选题意义及课题进展 1 4 1 选题意义 尽管有着种种的优点，x 射线衍射技术最大的缺点就是不容易获得蛋白质单 晶或者得到的单晶质量太差。由于蛋白质以及其晶体的种种特性，使得其不像小 分子那样容易结晶，要获得好的衍射数据的高质量、大体积蛋白质晶体更加不容 易；很多时候即使能长出微晶体，也不一定能长出足够尺寸的晶体。蛋白质晶体 的获得可以说是x 射线衍射法获得蛋白质结构的“瓶颈”。 8 中山大学硕士学位论文 所以从出现x 射线单晶衍射技术开始，蛋白质晶体生长就被广泛并且深入 地研究。从蛋白质晶体的生长过程到其生长机理研究中，我们已经发现了很多有 利于或者不利于蛋白质晶体生长的因素，也对蛋白质晶体的生长方式、缺陷种类 等进行了定义和总结。尽管对于蛋白质晶体生长有着很长的研究历史，但是目前 为止，多数实验室进行蛋白质晶体生长时，仍然需要采用尝试的方法。因为晶体 生长的影响因素太多了，而且很难得到某一个一定的有指导意义的晶体生长条件 或方法，尤其是对于一个新的蛋白质。但是尽管如此，对生物体细胞内大分子( 包 括蛋白质、核酸、脂质和多聚糖) 结构及其相互作用等信息的迫切需要让科学家 们不辞艰辛要去获得完美的大分子晶体。对于很多化学家和生物学家，尤其是结 构生物学家，x 射线衍射法得到晶体结构作为唯一可以得到原子水平上结构信息 的一种方法做出了很多的贡献。 正是在这样的蛋白质晶体研究背景下，为了给新建结构生物学平台的发展和 后续研究打下基础，我们以甜味蛋白为例，在获得高衍射质量蛋白质晶体和好的 结构数据的基础上，对蛋白质晶体生长的主要影响因素和晶体结构的解析方法进 行了研究。此外我们还尝试了获得甜味蛋白晶体的金属共结晶物或衍生物，以及 用一种新的1 2 扩散法得到甜味蛋白晶体的重原子衍生物。 在本课题中我们以甜味蛋白为主要研究对象，沿着其前2 个研究方向：一方 面从蛋白质晶体生长因素和重原子衍生物来对其进行晶体学基础研究，另一方面 在前人研究的基础上通过金属盐共结合物的制备对其甜味机理进行探索。 1 4 2 课题进展 我们的研究集中在蛋白质晶体生长影响因素和晶体重原子衍生物的制备上。 在对晶体生长影响因素的研究中，我们使用悬滴法对甜味蛋白t h a u m a t i n 进行结 晶。通过观察、对比不同条件下液滴及晶体的生长情况，得到主要的影响因素以 1 一 及每种因素对晶体生长的影响规律。我们考察的因素一共有4 种，分别为温度 ( 2 7 7 k 和2 9 3 k ) 、蛋白质溶液浓度( 4 0 m g , m l 和2 0 m g m l ) 、沉淀剂浓度( 包 括酒石酸钠钾盐和乙二醇) 、悬滴中蛋白质溶液和池液比例( 3 _ t l ：2 9 l 和 2 吐：2 此) 。研究手段为显微镜法观察悬滴中溶液状态及晶体生长情况，用x 射 9 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制各方法研究 线衍射实验的方法来对晶体进行表征。 在重原子衍生物制备研究中，我们采用浸泡法来制备衍生物。同时由于s a d 结构解析法的种种优点，我们也尝试用新报道过的碘扩散法来制备可以用于s a d 法的碘原子衍生物，并尝试了用于s a d 法数据收集方法。 最终我们在所研究的4 种影响因素中找到了主要影响因素及其影响规律。得 到了高质量，高衍射分辨率的t h a u m a t i n 单晶，并且在可重复制备蛋白质晶体的 基础上用碘扩散法得到了晶体的碘原子衍生物。但是由于时间关系，我们没有用 s a d 法解出晶体结构，碘扩散制备碘原子衍生物法的优化也还有待继续研究。 i o 中山大学硕士学位论文 第2 章蛋白质晶体的培养 2 1 蛋白质晶体的生长阶段、主要培养方法及影响因素 2 1 1 蛋白质晶体的三个生长阶段 所有晶体的结晶过程都可以被分为三个阶段：超饱和度的达到、成核阶段和 生长阶段。 超饱和状态是指在一定条件下，大分子浓度高于溶解度的一个非平衡态。高 浓度溶液中，大分子首先形成大小不等的非晶态沉淀，当达到超饱和状态并且能 量足够低时溶剂分子就可以有足够的时间和机会将自己排列到晶格中，有序地凝 聚，从而形成一定大小的晶核，继而长成完整的晶体。也就是一个晶核不断形成， 同时不断长大的过程。因此超饱和度的适当达到是很重要的，如果超饱和度太高， 晶核数量大，会导致晶体过快析出，容易形成微晶甚至是不定形物；如果超饱和 度太低，成晶速度会很慢，可能长不出晶体或者晶体还没有长成就被破坏了。 超饱和度是结晶的必需条件之一。由于蛋白质形状、性质上的复杂性，并且 蛋白质受电解质性质、浓度、p h 、温度以及各种其他因素的影响，在不同条件 下其有不同的溶解度最小值，甚至是由于母液性质的稍稍改变就可能结出不同晶 型的晶体，比如溶菌酶、核糖核酸酣2 8 】等等。因此想要找到适合用于x - r a y 衍射 实验的晶体就要组合各种不同的实验条件，从中筛选出可以产生晶体的最小溶解 度的条件组合。有的文献中建议在一系列不同的p h 下，就一个给定的沉淀剂来 测定蛋白质的沉淀点，并且在不同温度下重复。一般而言，我们可以通过一下几 种途径来达到适合的超饱和状态【7 】：( a ) 改变蛋白质本身来降低它的溶解度或者 是增加各个蛋白质分子彼此间的吸引力，比如改变p h 使得表面氨基酸残基的离 子化状态发生改变；也可以应用重组基因工程，通过改变活性位点的残基或者加 入小分子结合物对蛋白质从结构上进行修饰；( b ) 改变溶液性质来降低它对蛋白 质的溶解能力，比如减小其化学活性或者加入盐：( c ) 改变蛋白质分子和溶剂之 间的作用力，比如加入高聚物或者离子。具体各种不同的方法在很多文献中已有 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制各方法研究 描述 2 9 - 3 2 1 。 第二个阶段就是成核，成核是这3 个阶段中最难解决的。对于成核机理的研 究在这里就不详细论述了。我们关心的是如何让蛋白质进入这个阶段。影响成核 的因素包括超饱和度、分子尺寸和添加物的表面自由能。高的蛋白质浓度可以加 快成核的速率，不过如果这个高浓度形成的太快就有可能长出非晶态沉淀。最好 是使体系非常缓慢的趋向于溶解度最小，从而达到有限的过饱和度。 第三个阶段晶体的生长相对于成核就容易很多了，并且其机理已经被完全研 究清楚了。 在这3 个阶段中，超饱和状态是最重要的阶段，因为它驱动其他2 个阶段的 形成并且决定它们的发生和进行程度。在下面提到的一些影响因素和技术中很多 都是通过作用于超饱和度来影响结晶过程的。 2 1 2 晶体生长的影响因素 蛋白质结晶受很多因素影响( 见表2 - 1 ) 7 1 ，其中的很多因素都是相互影响 的，这使得整个影响关系变得很复杂。在所有这些因素中，最重要的因素有四个， 分别为温度、p h 值、沉淀剂( 或盐) 和蛋白质纯度。 温度变化是常用的诱导结晶的因素之一，一般蛋白质的结晶温度都在4 3 5 ：大多数情况下都是在一个固定温度下改变其他条件进行筛选的。 在其他条件不变的情况下，p h 通常会影响蛋白质的溶解度。因为p h 可以 反映蛋白质的氨基酸组成和其三维结构。有研究表f 1 ) j 3 3 , 3 4 1 ，蛋白质可以在等电点 达到其最小溶解度，等电点为不使蛋白质在电场中发生迁移的p h 值。 要选择一个合适的沉淀剂很关键，也相当麻烦。沉淀剂可以分为两类：盐和 有机溶剂。已经发现的常用沉淀剂有硫酸盐、乙酸盐、乙醇、聚乙二醇、m p d 等等。需要强调的是，透析法中是不能使用p e g 作为沉淀剂的，这是由于p e g 分子不能穿过透析膜；所以p e g 一般用于批量结晶、汽相平衡等方法。此外也 可以使用二组分沉淀剂体系，就是说体系中可以同时含有盐和有机溶剂或者同时 含有两种不同的盐。其相关研究早在二十世纪六十、七十年代就有报道。各种沉 淀剂和它们的性质也都被详细地研究总结过 7 , 2 8 , 3 0 1 。 1 2 中山大学硕士学位论文 虽然在结晶之前所有的因素都要被考虑到，并且对于不同的蛋白质样品需要 考虑的侧重点不同，但是样品的纯度是被最频繁提到的；一般而言，越纯的蛋白 质越容易结晶，也越容易结出好的晶体。通常要求蛋白质纯度在9 0 以上就可 以用于结晶实验了。 表2 1 各种影响蛋白质结晶的因素 2 1 3 蛋白质晶体的主要培养方法 蛋白质在不同条件下溶解度的不同导致了同一种蛋白质的不同形态晶体的 形成，例如核糖核酸酶( r i b o n u c l e a s e ) 、酵母苯丙氨酸转移核糖核酸( y e a s t p h e n y l a l a n i n e - t r n a ) 2 8 1 。这种现象的成因之一就是蛋白质的结晶受p h 、温度、 沉淀剂、重力、蛋白质纯度以及其他因素影响，所有这些因素都给合适的结晶条 件的获得增加了难度。为了得到高质量可用于x 射线衍射并且可产生完美衍射 数据的晶体，我们首先要找到可以产生晶体物质的各种化学、物理和生化条件。 然后改善优化这些条件从而得到想要的晶体。这两个阶段分别被称为筛选和优 化，它们在所有的蛋白质结晶中都是必需的过程。 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶体生长及重原子衍生物制各方法研究 三弛圭要缝菱直洼 应用于筛选和优化的方法有很多，像批量结晶、分批结晶、批量透析、微量 透析、液桥，自由扩散等等，其细节在很多文献中都有详细描迸7 邡1 ，这里我们 只想重点提到三种最常用的方法：微批量结晶法( m i c r o b a t c h ) 、坐滴气相扩散法 f s i t t i n gd r o p ) 和悬滴气相扩散法( h a n g i n gd r o p ) ，后两种均属于汽相扩散。在这三 种方法中都先将蛋白质溶液和结晶溶液( 也就是母液) 混合( 见图2 1 ) 。m i c r o b a t c h 中混合后的液滴直接放置在结晶专用的多孔平板的凹槽中，并将凹槽用涂有真空 油的透明塑料片封住以防止溶剂挥发；可以通过改变混合液滴达到优化的目的。 图2 - 1 从左到右分别s i t t i n g d r o p ，h a n g i n g d r o p ，m i c r o b a t c h 的结晶原理示意图， 图中的 p p t 代表试剂浓度 s i t t i n gd r o p 是在平板上进行的汽相扩散，混合液滴放置在多孔平板的凹槽 中，再将平板置于装有结晶溶液的透明容器中( 母液不能没过平板) ，最后将整 个装置密封。这样容器中的母液与凹槽中的混合液滴内包含的盐或者有机溶剂的 浓度通过其间的汽相扩散达到平衡。和m i c r o b a t c h 相比，在混合液滴已经配好的 情况下由于容器中母液浓度可以改变，因而改变条件的自由度较大。现在也有很 多改进的s i t t i n gd r o p 法，如直接在载玻片上滴混合液滴和母液，使其不相互接 触来进行扩散，或者在两种液体间加入液桥介质。 h a n g i n gd r o p 是在悬滴中进行的汽相扩散，混合液滴悬在一块盖玻片下，然 后将其密封放在装有母液的凹槽上方。这种方法最大的好处就是所需的液滴体积 小，适用于只有少量蛋白质样品又要进行大量筛选的情况；但是由于液滴体积有 限并不适合大晶体的生长。 在m i c r o b a t c h 中，密封油的气透性可以被调节，使得液滴缓慢挥发，类似于 通过调节浓度来影响结晶：在汽相扩散法中液滴和母液间的浓度平衡则是通过汽 相扩散来达到的。m i c r o b a t c h 适合在不同温度，甚至是在梯度温度下进行筛选： 1 4 中山大学硕士学位论文 同时，不同于汽相扩散法，m i c r o b a t c h 中不会出现液滴体积增大或是样品稀释p ，j 。 在特定蛋白的初始条件筛选中m i c r o b a t e h 和汽相扩散法的比较在一些文献 f l s - j r l 中有过报道。关于上述三种方法的更多信息可以在文献 3 5 1 中找到。当母液 是非挥发性时，最好使用微量透析的方法。 除了上述三种方法外，还有很多改进的方法，包括近年研究出的自动操作系 统，它可以加快整个实验过程并且节省样品【3 5 1 ；对于膜蛋白结晶可以使用脂质立 方相( 1 i p i d i cc u b i cp h a s e s ) 的方法【3 8 1 ；此外还可以使用相图来预测结晶的合适条 件【3 9 】。 2 2 甜味蛋白晶体的培养及其生长研究 2 2 1 实验材