2017_2018年高中生物第6章蛋白质和DNA技术第2节DNA片段的扩增__PCR技术学案.docx

第二节 DNA片段的扩增PCR技术一、DNA在细胞内的复制1所需的酶：解旋酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶等。2引物：一段RNA。3原料：四种脱氧核苷酸。4原则：碱基互补配对原则。二、PCR技术的过程1把PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合酶、Mg2等成分加入到微量离心管中。2把离心管置于95的高温中，使DNA碱基对之间的氢键断裂，DNA双链拆开成为两条单链。3将离心管置于55的环境中，使一对引物分别结合到两条分开的模板链上。4再将离心管转置于72的环境中，在DNA聚合酶的催化下，游离的脱氧核苷酸从引物的一端进行顺次连接，从而形成两条新的子链。这样高温变性、低温复性和中温延伸三个步骤便构成了PCR过程的一个循环。三、实验操作1准备(1)为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的离心管、吸头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。(2)如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为95、55和72，然后按要求在3个水浴锅中来回转移PCR的微量离心管即可。2扩增3检测利用DNA在260nm的紫外线波段的吸收值曲线来测定相应含量。即：DNA的浓度(g/mL)稀释倍数。预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、DNA复制(体内)与PCR技术(体外)体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至95 左右，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温(可变)相同点需提供DNA复制的模板四种脱氧核苷酸为原料都需要一定的缓冲溶液子链延伸的方向都是从5端到3端解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。二、PCR技术的实验操作程序1PCR扩增前的准备移液准备三个水浴锅2PCR扩增循环预变性时间延长最后一次延伸时间延长3检测PCR扩增效果(1)稀释4绘图(DNA的紫外线吸收曲线图)PCR技术的原理及过程如图为某一次循环的产物，请据图回答问题。(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为_、_、_三个步骤。(2)PCR技术与细胞内DNA复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用_使双链间氢键断裂，而PCR技术利用_原理，使双链氢键断裂。以引物为标识，可判断出此产物最早为第_次循环的产物。(3)PCR反应中，如果以引物为标识，共有几种DNA分子产生？你能把它们画出来吗？【审题导析】【精讲精析】(1)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。(2)DNA分子在细胞内复制时。在解旋酶的作用下使氢键断裂，而在体外，DNA在95 的高温中变性。即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会出现DNA分子两端均含引物的情况，如图所示：因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。(3)产生的DNA分子有3种：只含引物的，只含引物的和既含引物也含引物的。【答案】(1)高温变性低温复性中温延伸(2)解旋酶热变性一(3)共有3种，分别为：当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50 左右时，引物与模板结合，一般不考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因：a.模板DNA比引物长得多而且复杂的多，不易重新结合；b.引物与模板间的碰撞机会远远多于模板互补链间的碰撞；c.加入的引物量足够大而模板链数量少。PCR技术是把DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段，它的基本过程如图所示：注：图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物约含2030个脱氧核苷酸，并分别与两条单链DNA结合，其作用是引导合成DNA子链。(1)PCR技术的原理是模拟生物体内_的过程。(2)PCR扩增过程中需要对DNA片段进行高温处理，其目的是_，此过程在生物体内称为_，需_酶的参与。(3)假如引物都用3H标记，从理论上计算，所得DNA分子中含有3H标记的占_。(4)假定DNA片段含200对脱氧核苷酸，经3次扩增，从理论上计算需要_个游离脱氧核苷酸。【解析】(1)(2)由图可知高温变性的过程就是DNA在高温条件下解旋的过程，在生物体内则需要酶的催化才能进行。低温复性时两条DNA分子都需要引物；(3)每次低温复性时，引物都与两条单链DNA结合，进而形成双链DNA，所以所得DNA中均含3H。扩增3次一共形成了8个子代DNA片段，需游离的脱氧核苷酸数为(81)4002 800个。【答案】(1)DNA复制(2)使DNA两条链彼此分开解旋解旋(3)100%(4)2 8001PCR技术最突出的优点是()A原理简单B原料易找C所用DNA聚合酶具有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作【解析】PCR技术实际上是在体外模拟细胞内的DNA复制过程，形成大量特异性的DNA片段。原理复杂、原料多样，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作正是PCR技术的突出优点。【答案】D2下列哪种温度下DNA会发生复性()A95 B55 C37.5 D72 【解析】DNA解旋在95 环境下，复性温度为55 ，在72 时，DNA链得以延伸。【答案】B3TaqDNA聚合酶由水栖高温菌分离而得。其生长适宜温度为70 75 。回答下列问题：(1)用TaqDNA聚合酶代替一般的DNA聚合酶是使PCR普及应用的关键。因为普通的酶不能耐受94 时使双链DNA变性的温度。因此，每次循环都要_，TaqDNA聚合酶的发现和应用解决了上述问题，提高了PCR的效率，使PCR技术趋向_。(2)PCR反应扩增DNA片段时，_决定了扩增片段的长短。(3)若加入的模板是两个相同的DNA分子，如果只想要“拷贝”这两个长长的DNA分子中“特定区间”，在其他条件均理想时，经过三十次循环，理论上能获得_个“特定区间”片段。【解析】普通DNA聚合酶在DNA变性温度条件下失活，因此，必须循环一次更换一次新酶才能保证DNA复制顺利进行，而TaqDNA聚合酶在94 的DNA变性条件下不会失活，故可以反复利用，解决了PCR聚合酶只能从两引物的3端开始连接脱氧核苷酸，是DNA片段延伸的起始位点，两引物的5端