（轻工技术与工程专业论文）麦芽提前絮凝因子pyf与啤酒酵母絮凝性能关系的研究.pdf

摘要 摘要 啤酒酵母的絮凝性是下面发酵啤酒酵母的重要特征，对啤酒生产起着至关重要的作 用，凝聚性过强或过弱都会对啤酒的生产和最终成品啤酒质量产生不利影响。有研究表 明酵母过早絮凝与麦芽有一定关联，认为麦芽中存在酵母提前絮凝因子( p e r m a t u r ey e a s t f l o c c u l a t i o n ，p y f ) 。根据对酵母凝聚特性的理解和生产中出现的实际情况，本文主要是 建立一种科学灵敏、准确快速地用于分析麦芽中p y f 因子对酵母絮凝性能影响的方法， 在此基础上系统考察了不同厂家及同一厂家不同季节供应原料麦芽的差异性，最后将试 验测定结果同大生产跟踪的酵母沉降等具体指标结合在一起，统计分析麦芽与生产酵母 絮凝性能之间的关系，对生产进行指导。 通过系统考查酵母悬浮液初始浓度、缓冲液的最适p h 值范围、水质差异、p y f 因 子提取方式、反应体系各组分比例等多种因素对测定结果的影响，优化总结得出了测定 我司麦芽p y f 因子活力的具体参数如下：选用p h3 9 0 的o 1 氯化钙5 0m m 醋酸钠 醋酸缓冲液，控制酵母悬浮液浓度为o 3g m l ，反应体系合适比例为缓冲液2 3m l 、样 品0 4m l 、酵母悬浮液0 8m l ，使用缓冲液进行调零，用水样代替样品作为对照样。制 备的酵母悬浮液置于0 条件下贮存，最多可保存两个星期；所有溶液均采用经离子交 换处理后的纯净水配制；p y f 因子样品采用冻藏方式保存，测定前先解冻。 在良好的麦芽监控体系下，通过固定制麦工艺可有效防止成品麦芽p y f 因子含量 出现异常波动，能将麦芽p y f 因子含量控制在稳定的水平；大麦原料相对其它因素来 说，其对成品麦芽p y f 因子指标的影响较为显著；相同原料下，制麦工艺的改变对成 品麦芽p y f 因子指标的影响研究证明，工艺的适当调节对p y f 因子指标的影响很小。 由于p y f 因子活力存在显著差异的麦芽与酵母絮凝沉降速率变化之间的结果表明，p y f 因子活力过高会导致酵母絮凝速率较快，过低会延缓酵母的沉降速率，为了保持生产的 稳定性和啤酒质量的一致性，需要通过事先测定p y f 因子的含量，进行合理的麦芽勾 兑。 关键词：酵母提前絮凝因子，酵母絮凝，p y f 因子 a b s t r a c t a b s t r a c t b r e w i n gy e a s tf l o c c u l a t i o ni sa ni m p o r t a n tf e a t u r eo fb e e rb o t t o mf e r m e n t a t i o n b r e w i n g y e a s tf l o c c u l a t i o np l a y sav i t a lr o l ei nt h eb e e rp r o d u c t i o n b r e w i n gy e a s tf l o c c u l a t i o nw h i c h i st o os t r o n go rt o ow e a kw i l lh a v ean e g a t i v ei m p a c to nt h eb e e rp r o d u c t i o np r o c e s sa n dt h e q u a l i t yo ff i n a lb e e rp r o d u c t i fb r e w i n gy e a s tf l o c c u l a t i o n i st o os t r o n g ，y e a s tw o u l d f o c c u l a t ei na d v a n c ed u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，w h i c hw o u l dl e a dt os o m ef e r m e n t a b l e s u g a r ss t i l lp r e s e n t ，t h er e d u c t i o nd e l a y p r o l o n g a t i o no ff e r m e n t a t i o np e r i o d o fd i a c e t y la n da c e t a l d e h y d e ，a sw e l la st h e s o m el i t e r a t u r e sr e s u l t ss h o wt h a ty e a s tp r e m a t u r ef l o c c u l a t i o ni sr e l a t e dt om a l tq u a l i t y ， a n dt h e r ei sap r e m a t u r ey e a s tf l o c c u l a t i o nf a c t o r ( i ns h o r tp y fa sf o l l o w s 、i nm a l t t h i s a r t i c l ei sa i m e dt oe s t a b l i s has c i e n t i f i ca n ds e n s i t i v e ，r a p i da n da c c u r a t em e t h o dt oe v a l u a t e a n dd e t e c tt h ep y ff a c t o r ，a n dt h e ns y s t e m a t i c a l l yd e t e r m i n ea n da n a l y z et h ed i f f e r e n c eo f p y ff a c t o r sa m o n gt h ed i f f e r e n tm a l t ss u p p l i e db yt h ed i f f e r e n tm a n u f a c t u r e r s ，d i f f e r e n t s e a s o n so ft h es a m em a n u f a c t u r e r s a sw e l la ss t a t i s t i c a la n a l y s i so ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n m a l ta n dy e a s tf l o c c u l a t i o nb a s e do nb e e rp r o d u c t i o n s c a l e t h ef o l l o w i n gf a c t o r sh a db e e nt a k e ni n t oc o n s i d e r a t i o nt os e tu pam e t h o dt oa n a l y z et h e p y ff a c t o r ：t h ei n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fy e a s t ss u s p e n s i o n t h eo p t i m u mr a n g eo fp hv a l u eo f b u f f e r ，t h ed i f f e r e n c eo fw a t e rq u a l i t y 。p y ff a c t o re x t r a c t i o nm e t h o d s ，a sw e l la st h e p r o p o r t i o no ft h er e a c t i o ns y s t e mc o m p o n e n t s t h eo p t i m i z e ds p e c i f i cp a r a m e t e r so ft h e a c t i v i t yo ft h ep y ff a c t o rw e r ea sf o l l o w s ：s e l e c t i o no fp h3 9 0 5 0m m o l ls o d i u ma c e t a t e - a c e t i ca c i db u f f e rw i t h0 1 c a l c i u mc h l o r i d e t h ea n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo fp y ff a c t o r sw h i c hw a st o oh i g hw o u l d l e a dt oaf a s t e rr a t eo fy e a s tf l o c c u l a t i o n ，a n dt o ol o ww o u l dd e l a yt h er a t eo fy e a s t s s e d i m e n t a t i o na f t e rs y s t e m a t i c a l l yc o m p a r e dt h ey e a s tf l o c c u l a t i o nr a t ec h a n g i n gw i t ht h e m a l tc o n s i s t e do fs i g n i f i c a n td i f f e r e n c e so ft h ec o n t e n to fp y ff a c t o r i na d d i t i o n ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tr a wm a t e r i a l so fb a r l e yp l a y e dam o r en o t a b l er o l ei nt h ec o n t e n to fp y ff a c t o ri n t h ef i n i s h e dm a l tp r o d u c tb a s e do nm o n i t o r i n gt h ep r o c e s so fm a l t i n ga n dt h ec o n t e n to fp y f f a c t o ra n a l y s i s i nc o n s i d e r a t i o no ft h ei m p o r t a n te f f e c to ft h ec o n t e n to fp y ff a c t o ro nc o n s i s t e n tb e e r f e r m e n t a t i o n ，b r e w e rm a s t e rs h o u l da n a l y z et h ec o n t e n to fp y ff a c t o ro fd i f f e r e n tb a t c ho f m a l t s ，a n da d j u s tt h er a t i oo fd i f f e r e n tm a l t sw i t ht h ec o n t e n to fp y ff a c t o ri no r d e rt ok e e p g o o df e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c eo fb r e w i n gy e a s t o n l yi n t h i sw a y ，b e e rw i t hs t a b l eq u a l i t y c a nb ep r o d u c e d k e y w o r d s ：b e e rf e r m e n t a t i o n b e e rq u a l i t y ，p r e m a t u r ey e a s tf l o c c u l a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：主垒蛙 日 期： 童哩：! ：! 篁 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留，使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 啤酒酵母的絮凝性是下面啤酒酵母发酵的一个重要特征。啤酒酵母的絮凝对啤酒的 生产起着至关重要的作用，啤酒酵母的凝聚性过强或者过弱都会对啤酒的生产过程和最 终成品啤酒的质量产生不利的影响。啤酒酵母絮凝过强，酵母在发酵过程中提前絮凝， 会导致酵母降糖不完全、双乙酰和乙醛还原速度变慢，延长发酵周期，影响发酵性能的 发挥，最终导致发酵度偏低，口感偏甜等发酵不完全现象。啤酒酵母絮凝过弱，在啤酒 降糖完成后酵母迟迟不能沉降，会引起酵母在高压环境下的酵母自溶，导致啤酒风味变 差、同时由于过滤时发酵液中大量酵母的存在，会对过滤造成很大的压力，导致一系列 问题。并且也影响酵母的回收利用，造成传代酵母的接种量不足等问题，因此在啤酒酿 造过程中需要从多环节、多角度进行调控使得酵母絮凝正常。影响酵母絮凝的因素很多， 比如酵母自身的生理状况，环境因素比如发酵温度、压力、p h 、水中离子等等。近几年 出现的研究热点就是原料麦芽对酵母絮凝的影响，因为在连续的生产中发现，在其它工 艺参数不变的情况下，原料麦芽的更换会导致酵母表现出不同的絮凝特性，因此推断在 原料麦芽中一定存在一种能使酵母絮凝产生变化的物质。 1 1 1 酵母絮凝的机理 关于酵母的絮凝机理有很多的说法，但是主要集中在以下几个方面： 以酵母所带电荷及发酵液p h 值的变化和等电点的关系来解释凝聚性的发生【l 2 j ：啤 酒酵母的膜电位，会产生局部的电位差，而使酵母生长繁殖、发酵过程中具有电性，而 其电量值很低，因此酵母的外部生存环境的带电性，直接影响到酵母的生长以及发酵的 全过程。由于酵母电性环境的改变【3 4 】，可使酵母生理性能发生改变，如凝集性等。麦芽 汁发酵初期，存在充足的糖，发酵旺盛，发酵液强烈运动，酵母带有相同的电荷互相排 斥，故不易凝聚沉淀。但到发酵后期，糖将耗尽，发酵液运动减弱，p h 值下降( 嫩啤酒 为4 3 4 7 ) ，与酵母蛋白质的等电点接近，酵母细胞电荷减小或趋于零，细胞不易排斥 分开，使细胞发生凝聚。 酵母的凝聚现象是酵母细胞表面的甘露糖链和类凝集蛋白相互作用的结果：酵母的 凝聚性表现出蛋白酶敏感性。用蛋白酶处理过后的酵母细胞的凝聚性丧失，说明蛋白对 凝聚性产生关键作用。酵母的凝聚性在糖的存在下被抑制，表明有糖识别蛋白的存在， 糖识别蛋白与糖结合抑s i t 糖识别蛋白和酵母细胞表面糖链的结合【5 - 9 , 1 5 】。 基因水平的解释：酵母产生凝聚性是由其内部的凝聚基因决定的，已知的凝聚基因 有f l 0 1 ，f l 0 4 ，f l 0 5 ，f l 0 8 。其中的f l 0 1 基因编码的细胞壁蛋白，对酵母的凝聚 性起到了很重要的作用，它能被甘露糖抑制，但葡萄糖对它不起作用。 1 1 2 影响酵母絮凝的因素 基因因素：酵母絮凝受基因的控制。许多染色体基因参与絮凝的表达，而且线粒体 江南大学工程硕士学位论文 d n a 也参与絮凝的表达。目前，已知有5 种基因( f l 0 1 ，f l 0 2 ，f l 0 4 和f l 0 8 为显性， f l 0 3 为半显性) 控制酿造酵母的絮凝，其中f l 0 1 ，f l 0 2 ，f l 0 4 和f l 0 8 为等位基因。 有研究根据酵母的基因型，将酵母分为n e w f l o l 表型和非n e w f l 0 1 表型，n e w f l o l 表 型的染色体比非n e w f l o l 表型的染色体多一条，因此，表现出来就是n e w f l o l 表型的 酵母凝聚性很强，所以，酵母本身的凝聚性会有很大差异【l 卜1 4 j 。 生理因素：酵母絮凝在很大程度上依赖于细胞的生理年龄。细胞在指数生长期( 大 量底物用于细胞的繁殖) ，细胞呈分散状态；在指数生长末期和稳定生长期( 少量底物用 于细胞的繁殖) ，细胞才开始絮凝【l 孓1 8 j 。 环境因素： ( 1 ) 原料的因素：生产中发现，不同的原料会对酵母絮凝产生不同的影响。环境温度 的变化对某些酵母菌株的絮凝有一定的影响，一般情况下，低温下生长的酵母较高温下 生长的细胞絮凝性强，高温下生长的细胞有可能完全失去絮凝能力，而且对一具体菌种 而言，也存在最佳絮凝温度。 ( 2 ) 发酵液搅拌或对流的影响，絮凝是细胞之间形成絮状物的过程，搅拌增大了细胞 之间的碰撞频率，从而促进了细胞的絮凝。但是搅拌不能过于激烈，强烈的搅拌导致湍 流，增大了剪切力，不但会导致絮团的尺寸变小，而且也会使已经絮凝的细胞再度分散， 从而使絮凝效果变差。 ( 3 ) 麦汁和发酵液中金属离子的影响，酵母细胞絮凝受培养基中无机盐离子的影响， c a 2 + 对大多数絮凝酵母而言是有效且必不可少的促进剂，但可能受其同系物的竞争性抑 制。一般情况下，单价金属离子对絮凝无影响，主要是二价金属离子起作用。当麦汁中 c a 2 含量大于3 0m g l 时促进酵母的絮凝。f l o 型和n e w f l o 型菌株絮凝都依赖于c a 2 + 。 最适c a 2 + 浓度为1 0m m o l l 1 0 m o l l ，n e w f l o 型菌株对c a 2 + 浓度变化较f l o 型菌敏感， 当c a 2 + 浓度低于1 0m m o l l 或高于2 0m o l l 时即表现出较明显的絮凝抑制。 ( 4 ) 麦汁和发酵液中糖组分的影响，早期的研究指出，酵母絮凝受麦汁或发酵液中单 糖和二糖( 如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖等) 抑制。根据糖对絮凝抑制的情况分为f l 0 1 型( 甘露糖专一抑制) 和n e w f l o 型( 葡萄糖及甘露糖专一抑n ) n 种表型2 3 1 。两种表型所 产生的絮凝表现是不一样的。f l o 型絮凝为组成型表达，在发酵各个时期均可表达。而 n e w f l o 型为诱导型表达，只有在发酵液中糖浓度小于0 1 3 时才絮凝。在工业发酵中， 通常希望在发酵结束时，分散于发酵液中的酵母细胞相互凝聚形成絮凝颗粒沉积，从而 有利于细胞同发酵液的有效分离，大大简化后处理工艺，降低成本。f l o 型絮凝过早会 造成发酵迟缓，延长发酵时间，同时会影响产品质量。能在发酵后期表现出强大絮凝能 力的酵母菌株是实际生产应用中迫切需要的。n e w f l o 型酵母细胞在发酵糖类消耗完全 之前产生絮凝正是发酵工业所需要的，对细胞与发酵液的分离及产品的质量有重要的意 义【13 1 。 ( 5 ) p h 值的影响，p h 值过低不容易导致酵母沉降，最好控制在4 5 左右。新絮凝一 般出现在p h1 1 5 9 的范围内，但是在p h3 5 5 8 时，絮凝效果最好1 1 0 , 1 1j 。n e w f l o 型酵 母菌株对低p h 的敏感程度要大大高于f l o 型，当p h 6 0 ) 抑制n e w f l o 型絮凝的程度要比f l o 型大的多。 ( 7 ) n e w f l o 型菌株对蛋白酶k 、蛋白酶e 、胰蛋白酶相当敏感，作用仅1 0m i n 就几 乎丧失絮凝。 ( 8 ) 营养成分的影响，培养基中营养成分的匮乏是诱发絮凝的重要因素。由于营养成 分的限制使细胞停止分裂，进而形成絮凝。提高或降低培养基中氮源的起始浓度，会导 致细胞停止分裂时间发生变化，同时也影响到细胞絮凝的起始。向培养基中补加可发酵 性糖，可促进细胞的繁殖，从而抑制絮凝【1 9 - 2 5 , 2 9 】。f l o 型菌株在y n b 、y e p d 培养基中 较在麦芽汁中絮凝水平高，而n e w f l o 型在y n b 、麦芽汁中较在y e p d 中絮凝水平高。 1 1 3 原料麦芽中酵母提前絮凝因子对酵母絮凝的影响作用 目前越来越引起厂家和科研工作人员普遍关注的是麦芽中存在的一种酵母提前絮 凝因子( p r e m a t u r ey e a s tf l o c c u l a t i o n ，简称p y f ) 2 6 。2 引。国外一些研究结果表明酵母过早 絮凝与麦芽有一定关联，并提出了可能由于麦芽收获季节潮湿，或特定的制麦状态等因 素的影响，大麦自身保护机制产生了一种生物大分子( 国外研究结果主要认为其可能是 高分子量的多糖、蛋白质或糖蛋白复合体，这符合酵母絮凝机理中关于酵母细胞表面存 在糖识别蛋白和类凝集蛋白的观点) ，以用来抵抗微生物侵袭。这些组分通常位于谷物 的外部，对热或冷的外界条件都比较稳定，因此在整个酿造过程中( 粉碎、糖化直至最 终发酵) 仍保持活性。它们具有较强的阳离子性，可和酵母上带负电荷的组分结合，甚 至破坏膜的完整性，从而诱导酵母出现过早絮凝现象。 1 2 国内外研究进展 目前国内外对原料中p y f 因子含量的研究进行的比较多，主要集中在p y f 因子检 测方法的建立与优化，原料中p y f 因子的来源等等。对制麦过程中p y f 因子含量变化 的研究比较少。 1 2 1 国内研究进展 吴英敏，胡维胜【3 0 1 等采用分光光度计进行比色的方法，通过测定酵母在比色皿中的 沉降快慢，对缓冲液的p h 值、酵母的培养方式等方面调整优化了p y f 因子的比色测定 法。杨春霞【3 l 】等采用发酵法测定了原料麦芽中的p y f 因子含量，并通过外接种微生物 的方法，研究了微生物对p y f 产生的影响，探讨了p y f 因子的来源，大麦在制麦过程 主要污染菌为镰刀霉、烟曲霉和根霉。小试制麦植菌试验表明，霉菌污染量在1 0 2 个僮 麦芽和1 0 3 个儋麦芽，p y f 平均值分别为8 4 3 和7 0 7 ，都会引发p y f ；霉菌污染量 1 0 3 个儋麦芽，p y f 因子平均值为1 0 7 8 ，不会引发p y f ；镶刀霉和根霉影响大于烟曲 霉的影响。陈明1 3 2 1 等通过不同酵母对比，研究了酵母保藏方式对p y f 因子测定的影响。 江南大学工程硕士学位论文 1 2 2 国外研究进展 日本麒麟公司【3 3 】采用分光光度计进行比色的方法，通过测定酵母在比色皿中的沉降 快慢，研究了本公司不同麦芽的p y f 因子含量。日本朝日公司【3 4 】研究了微型快速发酵 方法，具体方法是按照修订的e b c 方法制备麦汁。制备p y f 对照麦芽和实验麦芽的协 定法麦汁。协定法麦汁制备后，在麦汁中添加4 的葡萄糖增加营养，最终麦汁浓度与 正常比重的麦汁基本相符。将一定比例的酵母悬浮液添加到装有5 0m l 无菌麦汁的5 0 m l 量筒中，接种量为1 0 1 2 x1 0 6 个m l 。接种后量筒用p a r a 膜密封，然后颠倒l o 次。 在一个2 1 水浴或2 0 的培养箱中发酵4 8h 。对照麦汁也一样发酵。测酵母数的样品 在发酵液面下的一个标准深度( 5m l ) 吸取，然后测定酵母数或者吸光度。发酵结束后剩 余的麦汁过滤，并测定外观浸出物。但是，这种方法的测定时间比较长。此外，还有很 多关于原料影响酵母絮凝的研究1 3 孓4 2 1 。 1 3 立题背景 由于原料成本的上升以及国外大麦供应不稳定的情况，我公司采购原料大麦或者麦 芽会经常进行调整，有时采用法麦代替加麦澳麦，有时采购国产麦芽代替进口麦芽，导 致生产所用的原料会经常发生变动，因此会对酵母絮凝产生比较大的影响。例如我公司 原料使用方案已经由全部进口麦芽逐步调整为6 0 7 5 国麦和小麦芽，在生产过程中 不规律出现发酵后期酵母絮凝慢的现象，导致过滤困难和口味异常等问题，为此提出酵 母絮凝性能研究的课题。研究原料特性中p y f 因子含量水平与酵母絮凝性能的关系非 常必要，研究结果可以用于指导生产，达到合理搭配使用不同p y f 因子的原料，从原 料使用环节调控酵母絮凝能力处于正常状态，从保证酵母絮凝能力环节保证发酵过程的 正常进行和啤酒口味稳定性和均一性。 针对酵母的凝聚特性的理解和生产中出现的实际情况，需要建立一种科学灵敏、准 确快速地用于分析麦芽中p y f 因子对酵母絮凝性能影响的方法，然后在此基础上系统 考察不同厂家及同一厂家不同季节供应我司原料麦芽的差异性，最后将试验测定结果同 大生产跟踪的酵母沉降等具体指标结合在一起，统计分析麦芽与生产酵母絮凝性能之间 的关系，确定我公司采购麦芽的p y f 因子活力的分布区域，以便同麦芽生产厂家共同 商讨其潜在原因、产生机理及具体调控措施，这样能更好地保证我公司麦芽原料采购的 稳定性，同时为实际生产提供相关理论依据。 1 4 研究内容 1 通过优化现有比色法测定p y f 因子活力的检测方法，建立一个准确性高、重复性好 的p y f 因子活力检测方法； 2 对原料库中现有各单批次及模拟大生产中麦芽比例1 ：1 比例混合不同批次麦芽中 p y f 因子活力测定，同时测定发酵液升压前后酵母数，寻找麦芽p y f 因子含量水平 与酵母絮凝之间关系，判断p y f 因子含量高低是否能够真实反映酵母絮凝特性。 3 通过对原料库中现有各单批次及模拟大生产中比例混合不同批次麦芽中p y f 因子 4 第一章绪论 活力进行测定，确定我公司麦芽p y f 因子的活力分布区域，用于指导原料采购和后 续生产。 江南大学工程硕十学位论文 第二章比色法测定原料麦芽的p y f 因子 2 1 前言 原料麦芽中p y f 因子的测定目前主要有两种方法，一种是发酵法，一种是比色法。 发酵法由于所需要的时间比较长，一般需要发酵4 8 h 。而比色法测定一个样只需要3 0 分钟，因此本章主要是对日本麒麟公司开发的比色法进行优化和改进，通过系统考查酵 母悬浮液初始浓度、缓冲液的最适p h 值范围、水质差异、p y f 因子提取方式、反应体 系各组分比例等多种因素对测定结果的影响等，建立一种快速，准确，科学的测定方法。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 不同批次成品麦芽样品，啤酒酵母菌株均由燕京啤酒集团公司提供。 2 2 2 主要试剂 e d t a - n a北京化学试剂公司 氯化钙北京化学试剂公司 醋酸北京化学试剂公司 酵母浸膏北京双旋微生物培养基制品厂 细菌蛋白胨北京双旋微生物培养基制品厂 麦芽糖中科院上海生化研究所 葡萄糖中科院上海生化研究所 2 2 3 主要仪器 q x t 1 糖化仪 中国原子能科学研究院 l r h 2 5 0 生化培养箱上海一恒科技有限公司 j 2 2 1 m 离心机美国贝克曼公司 2 4 0 1p c 紫外分光光度计日本岛津公司 2 2 4 主要分析方法 2 2 4 1 试验酵母的制备 取原始生产菌株1 环，接种于1 0m l 装有液体标准培养基的试管中于2 5 下活化 2 4h 。摇匀活化后的酵母，取lm l 酵母溶液接种于1 0 m l 标准培养基在1 2 培养7 2h 。 最后转入三角瓶中于1 2 放大培养1 2 5h ，于5 0 0 0r m i n 转速、1 0m i n 离心收集对数生 长晚期酵母细胞( 对数生长晚期酵母确立的试验数据略) 。称取沉淀酵母6g ，依次用4 0 m l 的去离子水、0 0 1m m o l le d t a n a 溶液( p h8 0 ) 、去离子水依次洗涤2 、3 、3 次。 称取一定重量洗净后的酵母泥溶于一定体积的去离子水中配制成酵母悬浮液，并置于0 下储存备用。 2 2 4 2p y f 因子溶液的制备 6 第二章原料麦芽中p y f 因子测定方法的建立 a 协定麦汁乙醇沉淀法1 3 3 】： 称取细粉麦芽样品5 0 0g ( 准确至0 1g ) 于已知重量的糖化杯中，加入4 5 的去离 子水2 0 0m l ，在不断搅拌下于4 5 水浴中保温3 0m i n ，使醪液以1 m i n 的速度，升 温加热水浴，在2 5m i n 内升至7 0 ，此时再于杯中加入7 0 的水1 0 0m l ，使醪液于 7 0 保温1h 后，在1 0 1 5m i n 内迅速冷却至室温。用水清洗搅拌器，擦干糖化杯外 壁，加水使其内容物准确称量为4 5 0 0g 。用玻璃棒搅动糖化醪，并用中速滤纸过滤，将 最初收集的约1 0 0m l 滤液返回重滤，收集滤液于干燥烧杯中置于电炉上加热，从麦汁 沸腾时刻开始计时，煮沸3 0 r a i n 后过滤取滤液。 测定经煮沸、过滤后的麦汁体积，向滤液中加入等体积的乙醇( 9 9 5 ) ，于冰水浴 上混合反应1h 。1 2 0 0 0r m i n 转速下离心1 0m i n 收集沉淀物后，用2 5m l1 0 0 去离 子水溶解，再在相同条件下离心去除不溶碎片，收集上清液，放置于冰箱中冻藏，测定 之前经解冻处理。 b 直接浸提乙醇沉淀法1 3 3 j ： 称取3 0g 麦芽粉碎，加入l8 0m l 的水在室温下搅拌3 0m i n ( 转速为1 5 0r m i n ) 。然 后进行过滤收集清液，后续操作方式同上。 c 直接浸提麦汁煮沸乙醇沉淀法： 提取过程和上者相似，但增加麦汁煮沸处理工序以去除蛋白质等热敏性成分；提高 p y f 因子溶液的相对纯度。 2 2 4 3p y f 因子活力测定具体方法及活力水平的定义( 参照日本麒麟公司的方法) 吸取0 4m l 待测样品，加入5 0 m m o l l 醋酸钠醋酸，o 1 氯化钙，p h4 5 0 的缓冲 液2 3m l 和0 8m l 的酵母悬浮液( 控制其吸光度值3 0 左右) ，用封口膜将比色皿密封。 上下倒置混合4 0 次，室温放置3 0m i n 。然后再上下倒置混合4 0 次使得沉淀絮状物重新 悬浮，最后轻轻倒置4 次，选择为不含样品的缓冲液作为对照进行调零，测定前7r a i n 内该悬浮液每分钟在波长6 0 0n l n 处对应的吸光度值。 活力水平定义 定义1 ：悬浮液测定3r a i n 时，含样品的比色皿和以去离子水为对照的比色管对应 a 6 0 0 的比值，耳p ( a 6 0 0 水对照一a 6 0 0 样品) a 6 0 0 水对照。 定义2 ：悬浮液测定3 7m i n 内每分钟时刻吸光度值的平均值来代替，其他计算同 定义1 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 酵母悬浮液初始浓度对检测结果的影响 由于酵母悬浮液的初始浓度选择在不合适的范围，会导致结果重复性变差，因此设 计了调节酵母悬浮液初始浓度实验以考查其对试验测定结果平行性和重现性的影响。本 试验中称取1 2g 洗净酵母悬浮于不同体积的经离子交换处理后的纯净水中，用以配制不 同初始浓度的酵母悬浮液。测定条件选择了p h3 9 0 的缓冲液，其他操作与前面方法相 同，测定样品都为水对照样。试验结果见图2 1 和表2 1 ，其中表2 1 中给出了测定结果 7 江南大学工程硕士学位论文 的相对标准偏差即r s d ，a l 和a 2 分别表示为样品在3r a i n 时刻和3 7r a i n 内测定值的 平均值，后面图表中的表示均与此相同，将不作具体说明。 表2 1 不同初始浓度酵母悬浮液下的p y f 值 t a b l e2 - 1t h ep y fv a l u ei nd i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fy e a s t 2 - 5 2 0 1 5 8 f 1 0 0 5 0 0 0 z 40 3【】4u 5 酵母初始浓度( g m l ) 图2 - 1 酵母悬浮液初始浓度的变化对p y f 值的影响 f i g 2 - le f f e c to f d i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f y e a s t o np y fv a l u e 从表2 1 可以看出：试验酵母的初始浓度变化对检测结果有着显著的影响，r s d 随 着酵母浓度的稀释而大幅度降低，当酵母初始浓度为0 6g m l 时，测定数据r s d 高达 1 0 5 0 ，而当浓度降低到o 3g m e 时，r s d 可降低到2 6 2 ，此时试验的重复性得到 较大提高；同时3r a i n 后溶液的吸光度值变化呈现更加稳定的趋势。考虑到实际测定时 吸光度数值的大小以及重复性的需要，确定酵母的稀释浓度为0 3g m e 比较适宜，此时 酵母悬浮液的初始吸光度值控制在3 o 左右。 8 第二章原料麦芽中p y f 因子测定方法的建立 2 3 2 不同p h 值的缓冲体系对测定结果的影响 由于不同的酵母在同一p h 值条件下会有不同的凝聚表现，因此必要调节缓冲液的 p h 值( 在许可的范围内) 来降低酵母絮凝速率，以选择合适p h 值的缓冲体系用于测定和 比较麦芽中p y f 因子活力差异性。 本试验中选用经过离子交换处理后的蒸馏水配制不同p h 值的缓冲液，在3 o 7 0 范围内用冰醋酸调节p h 值，并通过测定水对照样品吸光度值的变化来分析p h 值的变 化对酵母沉降速率的影响，其它操作条件与前面相同，试验结果见表2 2 和图2 2 。 表2 - 2 不同p h 值缓冲体系下水对照样品的p y f 值 t a b l e 2 - 2t h ep y fv a l u eo fw a t e rc o n t r a s ti nd i f f e r e n tp hb u f f e rs o l u t i o n s 从表2 2 可以看出：试验酵母在不同p h 值的缓冲体系中沉降速率有着显著的差异， 总体上酵母沉降速率变化趋势表现为先急剧升高，再略有下降，最后趋向平稳。当缓冲 液p h 处于3 2 4 3 5 0 区间时，7m i n 内溶液吸光度值仅有微小变化，酵母几乎没有沉 降；当再升高缓冲液p h 时，酵母沉降速率大幅度地提高，伴随着溶液吸光度值迅速降 低；当p h 处于4 8 0 5 5 0 区间，酵母沉降速率稍微有所下降，随后保持在稳定的水平。 且缓冲液p h 调节后测定溶液的吸光度值变化仍能保持相同的趋势：先迅速下降，3m i n 后数值基本稳定。综合考虑选择缓冲液的p h 在3 8 0 4 0 区域。 9 江南大学工程硕士学位论文 3 5 3 o 2 5 2 0 1 0 o 5 o o 习 i 囫a ，i 爹 囊 l 囫a ，l 爹 爹圉国豳阂豳豳豳爹 j z 43 53 墨4454 85 5石b 9 4 缓冲液p h 值 图2 - 2 缓冲体系p h 值的变化对测定结果的影响 f i g 2 - 2e f f e c to f w a t e rc o n t r a s ti nd i f f e r e n tp hb u f f e rs o l u t i o n so np y fv a l u e 2 3 3 不同代数酵母对测定结果的影响 本试验选取了五种不同对数生长晚期的酵母作为试验对象，分别为：采用标准培养 基培养的酵母( a ) 、种贮罐中对数生长晚期2 代酵母( b ) 、种贮罐中对数生长晚期3 代酵 母( c ) 、种贮罐中对数生长晚期2 代酵母( d ) 、种贮罐中对数生长晚期3 代酵母( e ) ，系统 考查了它们与测定结果之间的关系。 测定过程中选用p h3 8 0 的缓冲液，其它条件不变，样品均采用经离子交换处理后 的蒸馏水配制。试验结果见表2 3 和图2 3 。 表2 - 3 不同酵母的p y f 测定值 t a b l e2 3t h ep y fv a l u eo fd i f f e r e n ty e a s t 酵 母 墨坚堕望! 竺兰! a 。士s t dr s d 。a 2 士s t dr s d 2 01234567 3 5 8 61 5 2 41 4 3 81 1 3 21 1 40 8 3 10 8 2 50 8 2 a3 5 7 11 4 7 41 4 5 41 1 5 71 0 8 20 8 1 90 7 9 80 7 9 6 3 5 8 61 4 3 31 3 6 11 0 5 81 0 8 20 7 5 80 7 7 80 7 8 9 3 4 7 81 2 1 51 1 5 l0 8 8 70 8 60 5 7 10 5 6 20 5 7 3 b3 5 1 91 2 71 1 8 20 9 0 70 8 9 40 6 2 30 6 0 80 6 3 4 9 7l - 1 9 31 1 5 30 8 60 8 6 40 5 5 70 5 5 70 5 5 5 3 4 8 81 1 6 4 1 0 9 10 7 9 4 0 8 1 4 0 4 7 80 4 8 50 4 8 7 c3 4 9 91 2 0 61 1 7 90 8 6 40 8 4 60 5 7 40 5 5 40 5 6 7 3 5 1 81 1 8 41 1 2 5 0 8 1 l 0 8 1 80 4 9 8 0 4 9 20 4 7 7 3 4 9 20 9 9 60 9 5 20 6 2 80 6 4 50 3 3 70 3 5 80 3 5 d3 4 7 80 9 7l0 9 4 90 6 5 70 6 7 30 3 7 60 3 6 90 3 6 5 3 5 3 81 0 4 31 0 0 6 0 6 9 5 0 6 9 l0 3 6 8 0 3 8 80 4 0 8 3 5 0 31 0 5 41 0 1 50 7 0 30 7 2o 4 1 50 4 1 60 4 2 3 e3 5 2 3 1 0 7 4 1 0 2 80 7 5 60 7 4 80 4 3 80 4 3 30 4 3 4 3 5 2 61 0 81 0 2 8 0 7 2 9 0 7 2 10 4 2 7 0 4 4 4 0 4 2 3 乞等5 舶 0 0 8 0 8 2 5 4 + 3 5 0 0 0 8 0 2 3 3 7 + 5 9 4 0 0 6 0 6 3 0 4 - a ：7 3 9 0 。7 。2 2 9 3 - a ：4 3 5 0 0 9 0 0 3 5 3 士3 7 5 0 0 6 0 8 2 0 2 - a ：3 3 4 0 6 1 4 a ： 5 6 4 0 0 3 4 0 。4 。6 2 4 3 + 5 0 6 0 5 3 1 士 3 3 0 0 0 1 7 从表2 3 可以看出：在该测定体系下，3m i n 时刻的吸光度值和3 7m i n 内的吸光 度值的平均值二者非常接近，都可以很好地区分不同代数酵母的沉降性能；根据测定的 数据可以清晰地比较出5 种试验酵母的絮凝性大小的顺序分别为：a b c e d ； 试验测定结果重现性好，精密度高。3m i n 时刻的吸光度值的相对误差可有效地控制在 1 0 第二章原料麦芽中p y f 因予测定方法的建立 8 以下，如果采用计算3 7m i n 内吸光度值的平均值能更显著降低试验误差。 0 8 0 6 量 0 4 0 2 0 0 abcde 酵母种类 图2 - 3 不同酵母对测定结果的影响 f i g 2 3e f f e c to fd i f f e r e n ty e a s to np y fv a l u e 从图2 3 可以看出t 酵母的选择也会对p y f 因子活力测定的结果有着一定影响，必 须选择合适的酵母用于麦芽中p y f 因子活力的测定。大生产中不同代数酵母的絮凝能 力存在着一定的差异，前三代酵母凝聚性能呈现上升趋势，三代酵母的絮凝性明显好于 前两代酵母。同一代酵母本身絮凝能力也有着一定的区别。但这仅为本次实验结果，具 体结论有待进一步验证，特作此说明。 2 3 4 反应体系比例的调节对检测结果的影响 试验发现采用标准培养基培养生产菌株后收集制备的酵母悬浮液，在该测定体系l f 沉降速率较快，从而导致所有测定结果的吸光度数值较小。显然这种情形下不利于区分 p y f 因子活力相近的不同批次麦芽，因此希望通过调节反应体系组分的比例来达到提高 初始吸光度值的目的。 该试验中采用p h3 8 0 的缓冲液，称取1 2g 洗净酵母悬浮于4 0m l 经离子交换处理 后的纯净水以制备酵母悬浮液，其它操作条件均与前面相同。 2 3 4 1 缓冲液用量对试验结果影响的考查 试验中固定酵母用量及体系总体积分别为o 8m l 、3 5m l ，改变缓冲液用量。不同 缓冲液用量的p y f 测定情况如表2 4 和图2 4 所示。 表2 - 4 不同缓冲液用量的p y f 测定值 t a b l e 2 4t h ep y fv a l h ei nd i f f e r e n tv o l u m eo fb u f i e rs o l u t i o n s 江南大学工程硕士学位论文 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 2 1 缓冲液用量( m l ) 图2 - 4 缓冲液用量变化对测定结