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生物絮凝剂的合成及处理含油废水性能研究 孔英( 环境工程) 指导教师：赵朝成教授 张云波副教授 摘要 本文主要研究了微生物絮凝剂产生菌的筛选方法及微生物絮凝剂在 含油废水处理中的应用。 对_ _ - - - - 种絮凝剂产生菌的筛选方法进行了对比，分别是传统筛选方法、 d e h p 筛选方法和吡啶筛选方法。结果表明，吡啶筛选方法较其他两种 更为高效，筛出率达到4 4 3 。 利用吡啶筛选方法从含油废水、土壤、活性污泥中筛选出一株高效 的微生物絮凝剂产生菌b 6 1 ，初步鉴定其属于肠杆菌属。b 一6 1 所产生 的微生物絮凝剂对高岭土悬浮液的絮凝率可达到9 2 5 。 为进一步提高絮凝剂的产量和絮凝活性，对菌b 一6 1 进行了原生质 体紫外诱变，得到絮凝效果明显提高的诱变菌株p 3 0 和p 3 3 ，尤其是p 3 3 絮凝活性达到9 8 5 ，比出发菌株提高了6 。 对诱变菌p 3 3 进行了发酵条件优化的研究。结果表明，使该菌产生 高絮凝活性的最佳培养基为：蔗糖2 0 9 ，尿素o 7 5 9 ，k h 2 p 0 42 9 ，k 2 h p 0 4 5 9 ，n a c lo 1 9 ，酵母膏o 7 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 自然状态即可；最佳培 养条件为2 8 。c 、1 6 0 r p m ，培养2 0 小时收获。 使用p 3 3 产生的微生物絮凝剂对含油废水进行处理，结果表明，微 生物絮凝剂对含油废水的处理效果好于聚铝。处理过程中，微生物絮凝 剂所产生的絮体较大，沉降速度快，且污泥量小。 关键词：微生物絮凝剂，筛选，发酵，含油废水 s c r e e n i n go f t h ef l o c c u l a n t - p r o d u c i n gs t r a i na n di t s a p p l i c a t i o n i no i l - p o l l u t e dw a s t e w a t e rt r e a t m e n t k o n g y i n g ( e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g ) d i r e c t e db y ：p r o f e s s o rz h a oc h a o - c h e n g a s s o c i a t ep r o f e s s o rz h a n gy u n - b o a b s t r a c t t h et h e s i sa g ef o c u s e d m a i n l y o nt h e s c r e e n i n g o ft h e f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gs t r a i n a n di t s a p p l i c a t i o ni no i l - p o l l u t e dw a s t e w a t e r t r e a t m e n t t h r e es c r e e n i n gm e t h o d sa r es t u d i e d ，w h i c ha r ec o n v e n t i o n a lm e t h o d ， d e h pm e t h o d ，a n dp y r i d i n em e t h o d t h er e s u l t so fs c r e e n i n gs t u d i e s i n d i c a t e dt h a tt h ep y r i d i n em e t h o di sf a rb e t t e rt h a no t h e rt w o w i t hp y r i d i n em e t h o d ，af l o c c u l a n t - p r o d u c i n gs t r a i nb 一6 - 1w a si s o l a t e d a n di d e n t i f i e db e l o n gt oe n t e r o b a c t e r b 一6 1c o u l dp r o d u c eas t r o n ga c t i v i t y f l o c c u l a n t w i t hf l o c c u l a t i n gr a t eo f 9 2 5 a g a i n s tk a o l i nc l a ys u s p e n s i o n t oo b t a i nh i 曲一y i e l ds t r a i n ，u vm u t a t i o nt e c h n o l o g yw e r ea p p l y e do n b 一6 一lp r o t o p l a s t t h em u t a n t sp 3 3a n dp 3 0w e r eo b t a i n e db yt h ep r i m a r ya n d s e c o n d a r ys c r e e n w h i c hi n c r e a s e dt h e i rf i o c c u l a n t i n gr a t ef r o m9 2 5 t o 9 8 5 a n d9 7 6 r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mf l o c c u l a n t p r o d u c i n gc o n d i t i o n so fp 3 3w e r es t u d i e db y s i n g l e f a c t o r t h eo p t i m a lc o m b i n a t i o n sw e r ea sf o l l o w ：s u c r o s e2 0 9 ， c o ( n h 2 ) zo 7 5 9 ，y e a s t0 7 5 9 ，k h 2 p 0 42 9 ，k 2 h p 0 45 9 ，n a c l0 1g ，w a t e r 1 0 0 0 m l n a t u r a lp h c u l t u r ea t2 8 ( 2o nar o t a r ys h a k e rw i t has p e e do f1 6 0 r p mf o r2 0 h t h ef l o c c u l a t i o ne f f e c to fb i o f l o c c u l a n t la n dp o l y a lo nt h et r e a t m e n to f o i l - p o l l u t e d w a t e ri sc o m p a r e dp i l o tt e s t ss h o wt h ef l o c c u l a t i o ne f f e c to f b i o f l o c c u l a n ti sb e t t e rt h a np o l y a i c o m p a r e dw i t hp o l y a i ，b i o f l o c c u l a n t h a v eb e t t e rf l o c e u l m i n ge f f e c t ，h i g h e rs p e e d ，i m p l y i n gt h eb r o a da p p l i c a t i o n p r o s p e c t so f b i o f l o c c u l a n t si np r a c t i c e k e y w o r d s ： b i o f l o c c u l a n t ， s c r e e n i n g ， f e r m e n t a t i o n ，o i l - p o l l u t e d w a s t e w a t e r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国 石油大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国石油大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件及电子版，允许论文被查阅和借阅：学 校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 学生签名： 导师签名： 加o 年石月5 日 2 u 哆年石月j 一 日 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 第1 章前言 含油废水主要来源于石油、石油化工、钢铁、焦化、煤气发生站、 机械加工等工业企业。油类在水中的存在形式主要分为浮油、分散油、 乳化油和溶解油四类。 目前国内许多炼油厂仍采用“三段式”处理工艺，即先隔油，去除 大部分浮油，再气浮去除乳化油及部分c o d ，最后进行生化处理，迸一 步脱除c o d 和氨氮，如图l 一1 所示。其中，气浮是非常重要的一个环节， 气浮效果不好，轻则影响后继生化处理效果，严重的会破坏生化装置的 正常运行，特别不利于硝化菌的生长。而气浮效果主要取决于气浮工艺 条件及所使用的絮凝剂，因此选用高效的絮凝剂无疑是提高处理效果的 条重要途径。 污水 图1 - 1 污水处理工艺流程 在气浮过程中，用到的絮凝法【i 】是非常普遍的一种水处理方法。絮 凝( f l o c c u l a t i o n ) 指胶体由于高分子聚合物的吸附架桥作用聚结成大颗 粒絮体的过程【2 】。絮凝技术具有工艺简单、操作方便、基建投资少和处 理时间短等优点，适用于多种污水的预处理。 由于含油废水中的乳化油和其他污染物所形成的胶体非常稳定，通 常是投加絮凝荆( 如铁盐、铝盐等) 利用絮凝剂溶于水后，金属离子发 生水解作用，生成多核多羟基络离子。水中乳化油及胶粒能够强烈吸附 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 水解过程产生的各种产物，吸附的带正电荷的多核多羟基络离子通过压 缩双电层、降低( 电位，使胶粒脱稳，产生凝聚。当一个多核多羟基络离 子为两个或两个以上的胶粒所共同吸附时就产生粘附、架桥作用，产生 絮凝。通过絮凝剂的凝聚作用不仅能使乳化油破乳，而且还能使废水中 的有机或无机的杂质共同沉降，从而使废水中的油类和c o d 得到去除。 在絮凝处理过程中，絮凝剂的种类、性质、品种直接影响到絮凝处 理的效果，因此，絮凝剂是絮凝法水处理技术的核心。絮凝剂效果的优 劣决定着后续单元过程的运行工况、处理费用及最终出水的水质，而絮 凝效果好坏的关键取决于絮凝剂。 通常可将絮凝剂分为无机絮凝剂( 如铝盐、铁盐等) 、有机高分子絮 凝剂( 如聚丙烯酰胺等) 、微生物絮凝剂三类。 ( 1 ) 无机絮凝剂 无机絮凝剂主要是依靠中和粒子上的电荷而凝聚，故常常被称为凝 聚耕3 1 。无机絮凝剂可分为无机低分子絮凝剂和无机高分子絮凝剂。主 要是铁盐和铝盐，如亚硫酸铁、硫酸铁、氯化铁、硫酸铝及其聚合物等。 这类药剂在使用过程中耗量较大，并且具有一定的腐蚀性和毒性，对人 类健康和生态环境会产生不利影响。资料表明：水中铝含量高于 0 2 - 4 ) 5 m g l 。即可使鱿鱼致死：土壤中铝含量过高会影响植物生长，甚 至死亡，并随着农作物进入食物链，亦可影响人体健康，导致铝性脑病、 铝性骨病和铝性贫血病等，老年性痴呆病就是铝性脑病的一种。铁系絮 凝剂的铁盐对金属有腐蚀作用，可造成处理水中带有颜色，高浓度的铁 也会对人类健康和生态环境造成不利影响。 ( 2 ) 有机高分子絮凝剂 有机絮凝剂主要依靠架桥作用使粒子沉降。故又把有机絮凝剂叫做 絮凝剂或助凝剂【3 】。有机高分子絮凝剂与无机絮凝剂相比，具有用量少、 2 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 适应口h 广、受盐类及环境因素影响小，应用范围十分广泛。有机高分 子絮凝剂主要分为两大类，即合成有机高分子絮凝剂和天然高分子絮凝 剂。 合成有机高分子絮凝剂分为非离子型、阳离子型、阴离子型和两性 四种，分子量在5 0 - 6 0 0 万之间。聚丙烯酰胺( p a m ) 是应用最多的合成 有机高分子絮凝剂，占合成高分子絮凝剂总量的8 0 左右。具有用量少， 絮凝速度快等优点，但由于合成这些聚合物的单体具有强烈的神经毒性， 残余单体具有“三致效应”1 4 1 ( 致畸、致癌、致突变) ，且成本较高，因 此应用范围受到限制。 国外对天然高分子絮凝剂的研究始于上世纪7 0 年代，我国在这方面 的研究还开展的较少。这类絮凝剂按原料来源的不同，大体分为淀粉类 衍生物、纤维素衍生物、多聚糖类及蛋白质类改性产物、植物胶改性产 物等。这类絮凝剂无毒或低毒、无二次污染，但絮凝活性低，单独用于 絮凝净化效果不理想。 现有絮凝剂存在的问题，使研究开发具有高絮凝活性、安全、无毒 和不造成二次污染的絮凝剂成为迫切而有意义的课题，因此人们开始把 研究目光转向微生物絮凝剂。 ( 3 ) 微生物絮凝剂( m b f ) 微生物絮凝剂是一种利用生物技术，通过微生物体或其分泌物，发 酵、抽提、精制而得到的一种具有生物分解性和安全性的高效、无毒的 新型水处理絮凝剂f5 1 。主要成分有糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和d n a 等。目前对微生物絮凝剂的研究存在很大的局限性1 6 j ( 基本停留在小试 阶段) ，所用培养基比较贵，这使微生物絮凝剂的工业化生产及大量应用 受至0 限铝0 。 3 中国石油大学( 华东) 硕士论文 第1 章前言 1 1 微生物絮凝剂概述 1 1 1 微生物絮凝剂的分类 根据絮凝剂物质组成的不同，微生物絮凝剂可分为三类用。 ( 1 ) 直接利用微生物细胞的絮凝剂 如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母，它们大量存在于土壤、活性污 泥和沉积物中。 ( 2 ) 利用微生物细胞提取物的絮凝剂 如酵母细胞壁的葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质和n - z , 酰葡萄糖胺等成 分均可作为絮凝剂。 ( 3 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂 微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物，主要是细菌的荚膜和黏液质， 除水分外，其余主要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合 物。 生物絮凝剂作为一种新型、高效的水处理药齐j ，正在成为环保生物 新材料的一个重要研究方向。能否与化学合成絮凝剂竞争，取决于生物 絮凝剂的生产成本和絮凝效果。 1 1 2 微生物絮凝剂的化学组成 ( 1 ) 蛋白质：菌株a s p ls o j a ea j 7 0 0 2 合成的絮凝剂的主要活性成 分是蛋白质和己糖胺阍；生物絮凝剂n o c i 也是一种蛋白质，并且该蛋 白质分子中含有较多的疏水氨基酸网。 ( 2 ) 多糖：目前已经鉴定的生物絮凝剂有很多种属于多糖类物质。 a i c a l i g e n e sc u p i d u s k t 2 0 1 代谢产生的a i 一2 0 1 即是一种由葡萄糖、乳禧、 葡糖醛酸和乙酸( 摩尔比：6 3 4 ：5 5 5 ：1 0 ) 组成的生物絮凝剂【。0 1 ： 4 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 p a e c i l o m y c e ss p i l 产生的p f - 1 0 1 絮凝剂则是由氨基半乳糖以1 ，4 糖苷 键相连而成的粘多糖1 。 ( 3 ) 脂类：k u r a n e 首次从& e r y t h r o p o l i ss - l 的培养液中分离到了 一种脂类絮凝剂，这是目前发现的唯一的脂类絮凝剂【”。该絮凝剂分子 中含有葡萄糖单霉菌酸酯( g m ) ，海藻糖单霉菌酸酯( 1 m ) ，海藻糖二 霉菌酸酯( t d m ) 3 种组分。 ( 4 ) d n a ：高分子量的天然双链d n a 是p s e u d o i l l o i l a sc 12 0 菌体 细胞凝集的直接原因【1 3 1 。光合细菌t h o d o v i l l u ms p p s 8 8 的絮凝活性 与该菌分泌到胞外的d n a 亦直接相关“4 1 。 1 1 3 影响微生物絮凝剂合成的主要因素 微生物絮凝剂合成的主要影响因素为培养基的碳源、氮源、培养温 度、初始p h 值、通气量等。值得注意的是，对予某一特定菌种，絮凝 剂产生的最佳条件往往不同于细胞生长的最佳条件。 ( 1 ) 碳源 微生物絮凝剂的合成与碳源有较大关系。k u r a n e ( 1 9 9 1 ) d 5 ) 在 i l e r y t h r o p o l i s 的培养中，用o 5 的葡萄糖，o 5 蔗糖为碳源时，絮凝剂 的产量较高；k u r a n e ( 1 9 8 6 ) 9 1 等以果糖为碳源培养协腹产碱杆菌 ( a l c a l i g e n e sc u p i d u s ) ，其絮凝剂的产量超过其他受试碳源；使用葡萄糖、 半乳糖和果糖比用淀粉和麦芽糖对a l c a l i g e n e se u p i d u s 分泌絮凝剂更为 有效【坨】。富含单糖或营养丰富的培养基有利于絮凝剂的产生，而用高氮 低糖的培养基，会使絮凝剂的产量降低。对细胞生长最有利的碳源，不 一定是对絮凝荆分泌最有利的碳源。例如，用橄榄油为碳源时，虽有利 于细胞生长，但却不利于絮凝剂的合成【1 6 1 。 ( 2 ) 氮源 5 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 在氮源中，尿素和硫酸铵对某些微生物絮凝剂的产生和细菌的繁殖 最为有利【9 i 。用硝酸铵和氯化铵也可促进增长，但絮凝活性只相当于用 尿素的6 0 - - - 7 0 。碳氮比对于絮凝剂的合成也有影响旧，碳氮比为 6 0 - + 1 1 4 时，动胶菌属( z o o g o l e a 跟) 的絮凝活性较高，大于或小于此值 活性便迅速下降。在有机氮源中，酵母浸液和酩蛋白质氨基酸最为有效。 ( 3 ) 温度 培养温度对絮凝剂的合成也有一定影响。对i l e r y t b _ r o p o l i s 的研究表 明，在3 0 时，絮凝剂产量要高于2 5 c 和3 7 时的产量【羽。温度升高时， 微生物生长加快，但絮凝活性却降低，可见，温度的升高并不一定有利 于絮凝剂的合成。 对某些细菌来讲，絮凝剂合成的最佳温度与菌体生长的最适温度不 同。例如，a s o j a e ( n a k a m u r a , 1 9 7 6 ) 0 7 1 7 ：2 5 培养时菌体生长最快， 而3 0 - - 3 4 絮凝剂产量最高。 ( 4 ) p h 值 任何絮凝剂产生菌都存在产絮凝剂的最适p h 值范围，过高或过低 均不和于絮凝剂的产生，菌产絮凝剂的最适p h 值与其生长所需的最适 口h 值略有差异。e n d o ( 1 9 7 6 ) i 蚓的研究表明，如一直控制p h 为6 时， a s o j a e 菌丝生长旺盛，但根本不表现出絮凝活性。c x e r o s i s 只有在酸性 条件下才能产生絮凝剂( e s s e ra n dk u e s ，1 9 8 3 ) f 例。 ( 5 ) 其它影响因素 培养液的体积尽管不影响培养液中微生物的总量，但会影响絮凝物 质的产生【g j a 此外，通气量对絮凝剂的合成也有影响，培养初期，为满 足生物生长的需求，促进絮凝剂的产生，需大量通气；培养后期，可适 当减小通气量，以防止菌体絮凝成较大絮凝体而使活性降低f 2 0 1 。 6 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 1 1 4 影响絮凝效果的主要因素 影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素很多，包括絮凝剂的投加量、分 子量和无机金属离子等。 ( 1 ) 絮凝剂的投加剂量 对于某种m b f ，要取得最佳絮凝效果，均有一个最佳投量。在低浓 度范围内，絮凝效率随浓度的增大而提高，但是在达到一定浓度后，再 增大絮凝剂的浓度，絮凝效率反而下降。 ( 2 ) 絮凝剂的分子量、分子结构 m b f 分子量大小对其絮凝效果的影响很大，分子量越大，絮凝效果 就越好。当絮凝剂的蛋白质成分降解后，分子量减小，絮凝活性明显下 降。一般线性结构的大分子絮凝剂的絮凝效果较好，如果分子结构是交 链或支链结构，其絮凝效果就差【2 “。絮凝剂产生菌处于培养后期，细胞 表面疏水性增强，产生的絮凝剂活性也越高 2 2 3 1 。 ( 3 ) 无机金届离子 金属离子的种类和浓度对m b f 活性影响较大。适当浓度的金属离子 可以促进絮凝剂分子与悬浮颗粒以离子键结合，显著提高其絮凝活性【m 】。 容易受金属离子影响的多数是蛋白型的微生物絮凝剂【2 ”。但是，金属离 子的浓度不宜过高，否则，由于大量离子占据了絮凝剂分子的活性位置， 把絮凝剂分子与悬浮颗粒隔开而抑制絮凝。 处理水体中胶体离子的表面结构与电荷对絮凝效果也有影响。一些 报道指出，水体中的阳离子，特别是c a 2 + 、m 9 2 + 的存在能有效降低胶体 表面负电荷，促进“架桥”形成。另外，高浓度c a 2 + 的存在还能保护絮 凝剂不受降解酶的作用【2 5 1 。 ( 4 ) 被絮凝液p h 值 7 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 p h 值对m b f 絮凝活性的影响主要是由于酸碱度的变化，影响m b f 及悬浮颗粒表面的电荷的性质、数量及中和电荷的能力。不同的絮凝剂 对p h 值变化的灵敏程度不一样，同一种絮凝剂对各种的废水有不同的 初始p h 值要求。 ( 5 ) 温度 研究表明，与化学反应类似，适当提高温度可促进絮凝，使絮凝效 率提高捌然而高温会严重影响某些m b f 的效率。 这主要是因为高温可使生物高分子变性，空间结构改变，某些活性 基团不再与悬浮颗粒结合，因而表现出絮凝活性的下降。例如r 。 e r y t h r o p o l i s 产生的絮凝剂在】o o 的水中加热1 5 m i n 后，其絮凝活性下 降5 0 【1 6 1 。 1 1 5 处理对象 有些研究者认为，正是因为一些微生物絮凝剂是通过化学桥联作用 将被絮凝物质集聚在一起，所以其絮凝作用通常是广谱的，不易受微生 物个体和颗粒物表面特性的影响i 卸。能被絮凝的物质包括各种细菌、放 线菌和真菌的纯培养物、活性污泥、微囊藻、泥浆、土壤固体悬液、底 泥、煤灰、血细胞、活性碳耪末、硅胶粉末、氧化铝、高岭土和纤维素 粉等b 8 1 。但也有一些微生物絮凝剂的絮凝作用物质的面较窄，例如 a s p e r g i l l u ss o j a 产生的絮凝剂可以非常有效地絮凝b r e v i b a c t e r i u m l a c t o f e r m e n t u m 等微生物，絮凝率达到1 0 0 ，但对另一些微生物絮凝效 果较差，有的只有3 3 1 1 7 】。更为极端的例子是，h a n s e n u l aa n o m a l 产絮 凝剂甚至不能絮凝其非絮凝性的突变株细胞【2 9 1 。这说明微生物絮凝剂的 絮凝能力受被絮凝物质的极大影响。 s 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 1 1 6 微生物絮凝剂的絮凝机理 关于m b f 的作用机理先后提出过很多学说，如b u t t e r f i e l d 的祜质学 说，g r a b t r e e 的p h b 酯合学说，f i e d m a n 的菌体外纤维素纤丝学说等。 目前较为普遍接受的是“桥联作用”机理。该机理认为，絮凝剂大分子 借助离子键、氢键和范德华力，同时吸引多个胶体颗粒，因而在颗粒中 起了“中间桥梁”的作用，形成一种网状三维结构而沉淀下来。该理论 可以解释大多数m b f 引起的絮凝现象，以及一些因素对絮凝的影响并为 一些实验证实。絮凝体的形成是一个复杂的过程，“桥联”机理并不能解 释所有的现象，絮凝剂的广谱活性说明它是由多种机理共同起作用。为 了更进一步解释絮凝机理，还需作更深入地研究 ( 1 ) 桥联作用 絮凝剂分子借助离子键、氢键，同时结合了多个颗粒分子，因而在 颗粒间起了“中间桥梁”的作用，把这些颗粒联结在一起，从而使之形 成网状结构沉淀下来。k v y l 3 田在研究环圈项圈藻a m b o c i r c u l a r i s p c e 一6 7 2 0 产的絮凝剂絮凝膨润土过程时，通过测等温线和z e t a 电位发现絮凝剂确 是以“桥联方式”絮凝的。 ( 2 ) 电性中和 水中胶粒一般带负电荷，当带有一定正电荷的链状生物大分子絮凝 剂或其水解产物靠近这种胶粒时，中和其表面上的部分电荷，使胶粒脱 稳，从而胶粒之间、胶粒与絮凝剂分子间易发生碰撞而沉淀。加入金属 离子或调节p h 即可影响其絮凝效果，主要是通过影响其带电性而起作 用。 ( 3 ) 基团反应 絮凝剂大分子中某些活性基团与被絮凝物质相应的基团发生化学反 9 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 应，聚集成大分子而沉淀下来。通过对天然大分子改性，添加或去掉某 些活性基团，其絮凝活性就大受影响，说明这些絮凝剂絮凝活性大部分 依赖于活性基团。温度影响絮凝效果，主要通过影响其化学基团活性而 起作用。 ( 4 ) “类外源絮凝聚素”假说 。类外源絮凝聚素”假说很好地解释了酵母菌的絮凝机理；絮凝酵 母细胞壁上的特定表面蛋白与其它酵母细胞( 絮凝和非絮凝细胞) 表面 的甘露糖残基之间的专一性结合引起絮凝。 ( 5 ) “菌体外纤维素纤丝”学说1 3 1 】 “菌体外纤维素纤丝”学说则主要是针对纤维素类絮凝剂的絮凝机 理提出的，由于部分引起絮凝的产生菌体外有纤丝，因而该学说认为是 由于胞外纤丝聚合形成絮凝物。“类外源絮凝聚素”假说和“菌体外纤维 素纤丝”假说对非游离态生物絮凝剂的作用机理作出合理解释。 总之，絮凝过程是一个复杂的过程，为了更好地解释机理，需要对 特定絮凝莉和胶体颗粒的组成、结构、电荷、构象及各种反应条件对它 的影响进行更深入的研究。从生物絮凝剂的多样性以及絮凝范围的广谱 性可以肯定，絮凝机理是多样的【竭。 1 2 主要研究内容 ( 1 ) 对比各种筛选方法，筛选出高效、稳定的絮凝剂产生菌。 ( 2 ) 对筛选出的絮凝剂产生菌进行初步鉴定。 ( 3 ) 微生物絮凝剂高产菌株的诱变选育。以筛选出的高效絮凝剂产 生菌为出发菌，经过原生质体诱变，得到絮凝活性有较大提高的的诱变 菌。 ( 4 ) 突变株摇瓶培养及分批发酵条件的研究。在摇瓶水平重点考察 1 0 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 培养基成分、初始p h 、转速等环境条件对该菌株产生物絮凝剂的影响。 ( 5 ) 对比微生物絮凝剂与聚铝对含油废水的处理效果及其处理成 本。 ( 6 ) 研究复合型微生物絮凝剂产生菌的筛选方法。并对高效的复合 型微生物絮凝剂产生菌进行发酵条件的优化。 1 3 技术路线 本论文的主要技术路线如图1 2 和图1 3 所示。 与掣。 l 传统筛箍方法吡啶筛选方法d e h p 筛选方法 j l 一， 高效絮凝剂产生菌 l 原生质体诱变 j r l 诱变菌株i 工 发酵条件优化 上 絮凝条件优化 上 处理实际废水并与聚铝比较 图l 2 主要技术路线 中国石油大学( 华东) 硕士论文第1 章前言 申 发酵条件的优化 上 处理实际废水 图1 3 复合型微生物絮凝剂产生菌的研究方法 1 2 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生苗的分离与筛选 第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 在微生物絮凝剂的研究过程中菌种的筛选是非常重要的一个环节。 虽然自然界有十分丰富的菌种资源，但是要想从中筛选出理想的菌种却 不是一件很容易的事。本章实验的目的是对比三种筛选方法的优劣并分 离筛选出能够产生微生物絮凝剂的微生物。 2 1 材料 2 1 1 实验仪器与设备 实验中所使用的仪器与设备见表2 1 。 表2 - l 实验所需仪器 1 3 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 2 1 2 药品与试剂 实验中所用到的药品与试剂见表2 2 。 表2 - 2 实验所需药剂 2 1 3 菌种来源 主要来源于含油废水处理单元曝气池中的水样、活性污泥，还有一 部分是从土壤中分离的，因为土壤中含有微生物所需的一切营养和微生 物生长繁殖和生命活动的各种条件【3 3 j ，各种微生物都能在土壤中生活。 水样采集：用已灭菌的广! e l 瓶采集水样，水样体积以不超过瓶容积 的2 3 为宜。 土样采集：首先在选好的地点除去土表杂物，所采集的土样为 o - d o c m 的土壤，采集后土样混合均匀，取2 0 0 - - 2 5 0 9 装入无菌的信封中， 带回试验室立即进行分离。 2 1 4 培养基 a 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 9 、蛋白陈1 0 9 ，n a c i5 9 、琼脂 15 - 2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h = 7 6 a b 放线菌培养基：可溶性淀粉2 0 9 ，k n 0 3lg ，n a c l0 5 9 ，k 2 h p 0 4 1 4 ! 璺至翌奎兰! 兰查! 堡主丝奎 苎! 皇丝生望鍪壁型兰竺堕塑坌查皇堡垒 0 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 9 ，f e s 0 40 0 1 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 7 4 。 c 真菌培养基：马铃薯2 0 0 9 ，蔗糖2 0 9 ，琼脂1 5 - 2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ， 自然p h 。 d 查氏培养基：蔗糖3 0 9 ，n a n 0 33 9 ，k 2 h p 0 4l g ，f e s 0 4o o l g ， k c l 0 5 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，水1 0 0 0 m l ，自然p h 。 e d e i - 1 p 培养基：苯二甲酸二异辛酯( d e h p ) 4 m l ，k i - 1 2 p 0 40 6 9 ， m g s 0 4 7 1 4 2 00 0 6 9 ，( n h 4 ) 2 s 0 41 2 9 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 06 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 7 2 。 f 增殖用培养基：牛肉膏l g ，酵母膏2 9 ，蛋白胨5 9 ，n a c i5 9 ，水 1 0 0 0 m l , p h 7 0 。 g 通用发酵培养基：葡萄糖2 0 9 ，f n h g ) 2 s 0 40 2 9 ，尿素0 5 9 ， k h 2 p 0 42 9 - k 2 n a o a5 9 ，n a c lo 1 9 酵母膏o 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 自 然状态即可。 h 吡啶培养基：葡萄糖2 魄，k 2 h p 0 41 2 9 ，k h 2 p 0 4l l g ，n a 2 s 0 42 9 ， k c i 2 9 ，m g s 0 4 7 h 2 04 9 ，n f h c ll g ，酵母膏0 0 5 9 ，水1 0 0 0 m l ，自然 p h ( 葡萄糖单独灭菌，n f l 4 c i 和酵母膏的量逐步递减，吡啶初次投加量 为5 0 m g l 1 ) ( 注意：所配制的培养基灭菌后使用。葡萄糖单独灭菌，1 1 5 c 7 f 灭 菌2 0 r a i n ，其余成分，1 2 1 下灭菌2 0 r a i n 。) 2 2 试验方法 2 2 1 菌种保藏方法 低温斜面保藏法。 1 5 中国石油大学( 华东 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 2 2 2 絮凝试验方法 ( 1 ) 絮凝率的测定方法 向2 5 0 m l 烧杯中加入1 5 0 m l4 9 - l 1 高岭土悬浮液。再加入适量的微 生物絮凝剂产生菌的培养液。放置在电子变速搅拌机( 如图2 - 1 ) 下，插 入搅拌叶轮。将速度、时间分别设置为先快速( 2 0 0 r p m ) 搅拌i r a i n ，再 慢速( 6 0 r p m ) 搅拌3 m i n 。搅拌完成后，拔出叶轮，静置3 m i n 。从烧杯 的中间高度用注射器取2 0 m l 水样，用7 2 1 分光光度计测定其o d 5 5 0 ( 光 密度值，可以近似表示微生物的量) 。同时以蒸馏水代替培养液作对照试 验。絮凝效果以絮凝率作为标准，公式如下伽j ： 絮凝率：a - b 1 0 0 ( 2 1 ) a 式中，a ：对照上清液吸光度值。 b ：样品上清液吸光度值。 初筛时我们可以目测观察矾花大小和沉降速度，不用测絮凝率。复 筛时测絮凝率。 图2 - 1 电子变速搅拌机 1 6 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 ( 2 ) 絮凝剂投加量的确定 经过反复试验发现，絮凝剂的投加量对絮凝率有很大的影响，为了 测得准确的絮凝率，一定要找到最佳投加量。我们将初次投加量定为 o 1 m l 。然后根据絮凝现象来确定投加量是否过量。 若矾花小，说明絮凝剂投加量小于最佳值，也就是絮凝活性不高， 这种菌株就可以丢掉了。 若砜花大，且静置后的上清液也比较清，说明此时投加量接近最 佳值，此菌絮凝活性较高，可以测其絮凝率。 若矾花大，且静置之后上清液比较浑浊，说明絮凝剂投加量超过 最佳值，应酌情减少用量，直到符合条件再测其絮凝率。 2 2 3 微生物絮凝剂产生菌的筛选及各种筛选方法的比较 ( 1 ) 传统筛选方法 传统筛选方法是一种普遍应用于微生物絮凝荆产生菌筛选的方法。 它的原理是，将水样或土样接入各种富集培养基，使其中的各种微生物 充分繁殖，然后将其稀释涂布于相应的圆体培养基，得到单菌落。将单 菌落保存，并接种子发酵培养基，培养定时间后，测定培养液对高蛉 土悬浮液的絮凝率，筛选出具有较高絮凝活性的菌株。 7 中国石油大学( 华东) 硕士论文 第2 章微生物絮凝刺产生菌的分离与筛选 样品及其预处理 上 富集( 培养基a 、b 、c 或d ) j 释涂布( 培养基a 、1 3 、c 或d ) 工 挑取菌落( 培养基a 、b 、c 或d ) 由 章 高效微生物絮凝剂产生菌 图2 - 2 传统筛选方法 富集培养 取2 9 活性污泥或土壤接种于上述几种液体培养基中( a 、b 、c 、d ) 富集培养。根据文献【 。3 r l ，确定培养条件为：3 0 1 2 、1 4 0 r p m 转速下摇床 培养2 天。 稀释涂布 用移液枪吸取富集培养后的富集培养液o 5 m l ，移入装有4 5 m l 无 菌水的试管中，制成1 0 。稀释液，再吸取i o 。稀释液0 5 m l ，移入另一 装有4 5 m l 无菌水的试管中，制成】o 。2 稀释液，依此类推分别制成1 0 一， 1 0 4 ，l o ，1 0 缶，1 0 一，l o 8 的稀释液。然后用移液枪吸取o 1 m l l 0 5 ，1 0 - 6 ， 1 0 ，1 0 4 四个稀释度的菌液，接种到相应的固体培养基上，用无苗三角 玻璃棒涂匀，每个稀释度三个重复，最后放到2 8 c 恒温生化培养箱中培 1 8 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 养1 2 天，观察分离培养基上微生物的生长情况。 挑取菌落 选择在培养基上生长良好、表面光滑带粘性的细菌单菌落，用接种 环挑取少量菌体，转接到相应斜面培养基上，放入2 8 。c 的恒温生化培养 箱中培养2 4 h 后，放于4 冰箱中保存，以用于进一步筛选。 微生物絮凝剂产生菌的初筛 将上述斜面上的菌种接入装入试管的5 m l 通用发酵培养基，在 3 0 c 、1 4 0 r p m 条件下培养4 8 小时。通过絮凝实验，目测观察絮凝现象， 选出絮体较大沉降速度较快的菌，进行下一步复筛。 微生物絮凝剂产生菌的复筛 将初筛所得到的具有絮凝性的菌株接种到内装3 0 m l 通用发酵培养 基的2 5 0 m l 三角瓶中，于3 0 c 、1 4 0 r p m 振荡培养4 8 h 。测定其絮凝活 性，筛选出絮凝活性较高的菌株。 ( 2 ) d e h p 筛选方法 日本学者仓根隆一郎( r y u i c h i r ok l l l a i l e ) 等0 8 】通过研究最终分离筛 选出一株能够分解利用苯二甲酸二异辛酯( d e h p ) 和邻苯二甲酸二丁酯 ( d b p ) 的菌种红平红球菌( r h o d o c o c c u se n y t h r o p o l i s ) ，并进一步 研制由红平球菌产生的能够沉降活性污泥的微生物絮凝剂，取名为 n o c 1 。有人认为降解d e h p 和d b p 可能与微生物絮凝剂的产生有一定 的内在联系3 9 1 。因此本研究采用d e h p 作为唯一碳源的筛选方法进行絮 凝剂产生菌的筛选与其他筛选方法进行比较。 1 9 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 样品及其预处理 上 富集( 培养基f ) 0 选择性培养( 培养基e ) 上 ld e h p 选择性平板( 培养基e ) 囱 圈2 - 3d e h p 筛选方法 富集培养 取2 9 活性污泥或土壤直接加入富集培养基f 中，3 00 c 、1 4 0 r p m 摇 床培养4 8 小时后，以2 0 的接种量转接入新鲜的富集培养基f ，仍是 3 0 6 c 、1 4 0 r p m 摇床培养4 8 小时。之后再以2 0 的接种量接入新鲜的富 集培养基f ，3 0 。c 、1 4 0 r p m 摇床培养4 8 小时。 选择性培养 将第三次富集培养后的菌液以2 0 的接种量接种于液体选择性培养 基e ，在3 0 c 1 4 0 r p m 下培养4 8 h 。 涂选择性平板 将选择性培养的培养液涂布于同样的选择性培养基平板。 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝刺产生菌的分离与筛选 挑取菌落。方法同传统筛选方法中的第3 步。 初筛。方法同传统筛选方法中的第4 步。 复筛。方法同传统筛选方法中的第5 步。 ( 3 ) 吡啶筛选方法 毗啶筛选方法是一种全新的筛选方法。它是将土样或活性污泥接入 吡啶培养基，毗啶作为氮源，使可以耐受吡啶的微生物存活下来，然后 将培养液稀释涂布，得到单菌，通过测定单菌发酵液的絮凝活性，筛选 出絮凝剂产生菌。 样品及其预处理 上 三次富集( 培养基h ) 上 初筛混合菌群 上 稀释涂布( 培养基a ) 囱 微生物絮凝剂产生菌 图2 - 4 吡啶筛选方法 富集培养 筛选过程中共进行3 次富集培养，这3 次富集培养采用培养基h 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 但其氮源含量不同。具体如表2 3 所示。 表2 - 3 富集培养基中氮源的含量 取2 9 活性污泥或土壤直接加入富集培养基h l 中，3 0 1 2 、1 4 0 r p m 摇床 培养4 8 d 时后，以2 0 的接种量转接入富集培养基h 2 ，仍是3 0 1 2 、1 4 0 r p m 摇床培养4 8 , i 时。之后再以2 0 的接种量接入富集培养基h 3 ，3 0 c 、 1 4 0 r p m 摇床培养4 8 4 , 时 混合菌群的初筛 将富集培养三次后得到的混合菌群以1 0 的接种量接入装有3 0 m l 通用发酵培养基中的三角瓶中，3 0 c 1 4 0 r p m 培养2 4 h ，对培养液进行高 岭土絮凝实验，将絮凝性好的混合菌群筛选出来进行逐级稀释，涂布于 培养基a 。方法同传统筛选方法中的第2 步。 挑取菌落。方法同传统筛选方法中的第3 步。 初筛。方法同传统筛选方法中的第4 步。 复筛。方法同传统筛选方法中的第5 步。 2 3 实验结果 2 3 1 传统筛选方法 利用传统筛选方法，从l o 多个样品中分离出2 0 0 多株菌。其中由培 养基a 得到8 l 株菌，2 l 株具有絮凝性，筛出率为2 5 6 。由培养基b 得到6 4 株菌，有1 8 株具有絮凝性，筛出率为2 8 。由培养基c 得到7 8 2 2 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 株菌，有2 5 株具有絮凝性，筛出率为3 2 。培养基d 得到6 3 株菌，有 1 3 株具有絮凝效果，筛出率为2 1 。 表2 4 传统筛选方法筛出率 对目测效果较好的菌进行复筛。复筛得到絮凝率在8 0 以上的菌有7 株。其絮凝活性如下表所示： 表2 - 5 传统筛选方法复筛结果 2 3 2d e i - i p 筛选方法 按d e h p 筛选方法分离筛选，共获得菌株5 0 株，进行初筛，所有菌 株分批经过摇瓶培养，观察培养液对高岭土悬液的絮凝效果，在5 0 株中 共筛选到有絮凝活性的菌株3 株，缔出率为6 o ，与文献相近【3 9 l 。 表2 - 6d e h p 筛选筛选方法筛选结果 由以上数据可以看出，这种筛选方法的筛出率较低，甚至低于传统 的筛选方法，因此不提倡这种筛选方法。 2 3 3 吡啶筛选方法 通过吡啶筛选方法筛选六个土样得到的复合菌群。将混合菌群涂布 后得到单菌，再进行筛选。每个混合菌群中含有乱1 2 种不同菌种。筛选 2 3 中国石油大学( 华东) 硕士论文第2 章微生物絮凝剂产生菌的分离与筛选 结果如表2 - 7 所示。共筛得各类菌株6 1 株，其中有絮凝性的有2 7 株。 筛出率为4 4 3 。絮凝率在8 5 以上的有7 株，如表2 8 所示。其中一 株编号为b 6 1 的菌，其发酵液特别粘稠，絮凝性达到9 2 5 。以高岭土 悬浮液为絮凝对象，加入其发酵液后，水质很清，其中的高岭土聚集成 了球形，而不是像其他微生物絮凝剂一样形成高岭土颗粒。如图2 5 所 示。 表2 - 7 混合菌群筛选结果 图2 - 5 菌b - 6 1 与其他菌株及空白的对比 综上，絮凝剂产生菌广泛存在于自然界中。实验中发现，能产生絮 凝剂的微生物培养液在发酵后期粘度较大，而且