（遗传学专业论文）酿酒酵母耐铝机制中可能包含抗氧化作用.pdf

浙江大学硕士研究生学位论文 摘要 金属污染作为一个严重的环境问题，日益受到关注，其中。铝就是一种影响人体健康以及 在酸性土壤中抑制植物生长的金属。在所有的生物体内都被发现有少量的铝存在。随着对a r + 枣性研究的不断增多，使人们改变了原先认为a p + 无生物活性的观点，转而进一步深入研究 a p + 对人类、动物、植物和微生物的影响。 综合微生物舢3 + 毒害和耐a r + 机制的现有研究结果表明，微生物通过增强分泌有机酸与 a 1 3 + 螯台，超表达m 矿通道蛋白，增强细胞转运吸收m 9 2 + ，通过线粒体a t p a s e 和液泡 a t p a s e 协同作用将a 1 3 十隔离于液泡内，以及通过氧化胁迫改变、调节a 1 3 + 毒害和耐铝性， 减缓时+ 对细胞的毒害。 本文以酿酒酵母野生型菌株c y 4 和g s h z 突变体c y 8 为材料，进行了酿酒酵母a 1 3 + 毒害及 抗性机制的相关研究，得到了以下结果： a p + 间接性致使酵母细胞内r o s 增多，形成氧化肪自的内环境。在高浓度灯+ 胁迫下，野 生型菌株c y 4 和g 曲i 突变体c y 8 胞内的r o s 均明显增多，但在低浓度a 1 3 + 胁迫下，黜i 突 变体c y 8 胞内r o s 增加明显高于野生型菌株c y 4 。 受到a 1 3 + 胁迫后，细胞内s o d 、海藻糖等明显增加，可能具有增强细胞抗a r + 毒害的作用。 用r t - p c r 等方法，测定分析了细胞内g s h 含量。结果表明，a 1 3 + 处理组细胞内g s h 含量 比无a r + 处理组 氐，说职a l = 3 + 能降低g s h 的合成。但是商浓度a 王3 + 处理组比低浓度a r 处理 组细胞内g s h 含量高，说明对g s h 的含量调控中a 1 3 + 并非是唯一的医子，可能还受到r o s 等影响。同时，增加酵母细胞内g s h 含量可以提高细胞的耐a 1 3 + 性。 关键谒：铝毒酿酒嚣争母耐铝性r o s 谷胱甘肽抗氧化作用 浙江大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t m e t a lc o n t a m i n a t i o ni sn o wb e c o m i n go n eo ft h em o s ts e r i o u sw o r l d w i d ee n v i r o n m e n t a l p r o b l e m s a l u m i n u m ( a 1 ) w a sf o u n di ns m a l la l l o u n t si na l lo r g a n i s m s ，a n dw a sc o n f i r m e dt od oh a r m t oh u m a nh e a l t ha n di n h i b i tt h eg r o w t ho f p l a n t si na c i ds o i l d u r i n gt h e p r o c e s si ns t u d y i n ga lt o x i c i t y t ot h eo r g a n i s m s ，p e o p l ec h a n g e dt h eo p i n i o nt h a ta lw a si 曲【i o 吣i nb j o s y s t e i 璐，a n db e g o n em o l e a w a i eo f t h c 如l p 毗锄c co f t h e m 出r f i s m s o f a l - t o x i c i t y a n d a l - t o l e r a n c e i ne n v i r o n m e n t a la n d l i f e s c i e n c e s w er e v i e w e df o u rm e c h a n i s m so fa 1t o x i d t ya n dt o l e r a n e ci nm i c r o o r 静n i s m s ，i n c l u d i n g ( 1 ) e x c r e t i n g o r g a n i c a c i d s t o c h e l a t e a l 3 + ，( 2 ) o v e r e x p r e s s i o n m g u t r a n s p o r t e r p r o t e i n t o t r a n s p o r t m 9 2 + i n t ot h ec e l l , ( 3 ) s e g r e g a t i n ga 1 3 + i nv a c u o l eb yf 1 f 叠p 口曙a s ca n dv - a t p a s ct oe l i m i n a t et h et o x i c i t yo f 心a n d ( 4 ) r e g u l a t i n gt h eo x i d a t i v es t r e t om o d i f yt h ea it o x i c i t ya n dt o l e r a n c em e c h a n i s mi n m i c r o o r g a n i s m s i nt h i s p a p 盯 w es t u d i e dt h ea 1t o x i c i t ya n dt o l e r a n c em e c h a n i s mi ny e a s ts a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ew i t ht h ew i l ds t i a i l nc y 4a n dg s h lm u t a n tc y 8 ，a n dg o tt h e s er e s u l t s ： ( 1 ) a pi n d i r t x i i yi n d u c e dt h ei n c r e a s eo fr e a c t i v eo x y g e ns p e d c si ny e a s tc e l l u n d e rt h eh i g h c o n c e n t r a t i o no fa l “，t h er o sl e v e l si n c r e a s e do b v i o u s l yb o t hi nw i l ds t r a i nc y 4a n d 耐jm u t a n t c y 8 ，b u t t h e i n c r e a s e o f r o s i n g s h ：m u t a n t c y 8 w a s n m t h a n t h a t o f w i l ds t l 菌n c y 4 w h e n t r e a t e d w i t hal o w a l 3 + c o n c e n t r a t i o n ( 2 ) t h es o da c t i v i t ya n dt r e h a l o s ec o n t e n ti nt h ey e a s tc e l l si n c r e a s e do b v i o u s l yu n d e rt h ea 1 3 + s i e s s ， w h i c hp r o b a b l yc o n t r i b u t e dt ot h ee n h a n c e m e n to f a l “t o l e r a n c ei ny e a s t ( 3 ) t h ea n a l y s i sr e s u l to fg s h c o n t e n ti nt h ey e a s tc e l li n d i c a t e dt h a t , t h eg s hc o n t e n ti ny e a s tc e l l t i e a t e dw i t ha l 抖w a sl e s st h a nt h a to ft h ey e a s tc e l lw i t h o u ta 1 3 + 佃幽助lw 蚯c hr e v e a i ：dt l l a t 灯+ d e c r e a s e dt h eg s hr e g e n e r a t i o n h o w e v e r , t h eg s hc o n t e n ti nt h ey e a s tc e l lu e a t e dw i t hah i g h c o n c e n t r a t i o no fa 1 3 + w a sm o i et h a nt h a to ft h ey e a s tc e ul r e a t e x lw i t hal o wc o n c e n t r a t i o no f 越誓 w h i c hr e v e a l e dt h a ta 1 3 w a sn o tt h eo n l yf a c t o ri nr e g u l a t i n gt h eg s h s y n t h e s i s a n di tw a sp r o b a b l y r e g u l a t e db yo t h e rf a c t o r ss u c ha sr o s a d d i f i o n a l l 5t h ei n c r e a s eo fg s hc o n m n ti ny e a s tc e l lc o u l d i m p r o v et h e i r a l 3 t o l e r a n c e k e y w o r d s ：a l t o x i c i t y , s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ，a l t o l e r a n c e ，r o s ，g l u t a t h i o n e ，a n t i o x i d a n t 5 浙江大学硕士研究生学位论文 第一章微生物铝毒及其耐铝机制研究现状( 文献综述) 1 引言 a i 是地壳中含量最高、分布最广的金属元素，主要以眭酸盐和氧化物的形式存在，约占地 壳外部8 的重量( b o j i e a ，2 0 0 2 ) 。当酸雨使a 1 化合物酸水解形成八面体结构的六水化合物 a ( h 2 0 ) 6 3 + ( ”) 时，对农作物的毒害明显加剧，也使得森林的生态环境受到致命的影响 ( h i d e a h im ，2 0 0 0 ；l e o n v k ，1 9 9 5 ) 。随着a l 化物在日常生活中的广泛应用，对生态环境的 影响也日趋加深。因此有关a p + 对生命体系影响及生物体耐a | 3 + 的研究引起了广大科学工作者 的极大关注。目前国内外这方面的研究主要集中于a 1 3 + 对人类神经系统、鱼的生长发育、植物 根系形成与生长的影响和作用上。 对a 1 3 + 毒害机席0 的研究正不断地深入，但对其分子机理的阐释仍莫哀一是。通过应用模式 生物系统来克隆和分析某些耐金属基因，已经大大加快了对金属离子毒害的遗传分析，在动物、 植物中a p + 毒害研究深入的同时，在微生物中关于a 1 3 + 毒害的探讨也正如火如荼地展开。微 生物易生长、繁殖快、易变异等特性为a 1 3 + 毒害的研究提供了许多的便利，特别是一些模式微 生物的研究更是发展迅速。j u d y 等( t r a v i s j ，1 9 9 8 ) 在美国黄石国家公园发现了嗜越细菌。 s h i n i i l 0 等( s h m j i r ok ，1 9 9 6 ) 和f u s a k o 等( f m a k o k t2 0 0 0 ) 也先后从酸陛土壤中分离和鉴 定了一批耐酸铝毒害的细菌和真菌，为广泛开展a r + 毒害机理的研究提供了理想的材料选择。 研究者们发现，在细胞水平的耐a 1 3 机制上，微生物与动物、植物有定的相通性。种 是体外方式，即当生物体受到a 1 3 + 胁迫时，通过合成分泌一些螯合物与剐3 + 结合，阻止a p 被细胞所吸收：第二种是体内方式，将被吸收至细胞内的a 1 3 + 与某些蛋白结合形成复合物，通 过一些酶促反直解除毒害或被隔离于液泡中，使细胞能够正常地生存下去。具体而言，其中有 i 机酸、某些金属离子和离子通道蛋白、加功s c 、氧化胁迫作用等在微生物的耐a l 针过程中起 到了较为关键的作用。 2 有机酸在耐3 + 机制中的作用 正如在小麦( t r t c u m a 蝴) ( p e t e r r r ，1 9 9 5 ) 、大麦优k 堋v u l g a t e ) ( z h u m y ，2 0 0 3 ) 、 玉米( z 缸m a y s ) 、烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) ( m a j f ，2 0 0 1 ) 椭- ( f a g o p y r u m e s c a d e n t u m ) ( m a j f ，1 9 9 7 ) 等高等经济作物中发现的，在a 1 3 m 髓下有机酸所起的耐a 1 3 + 作用，在微生物中也 浙江大学硕士研究生学位论文 有此类的相关报道。r o b e r t 等( r o b e r th ，1 9 9 9 ) 的研究表明在经矿处理后的荧光假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ) 可产生比未经a 1 3 + 处理的细胞多8 倍的草酸，这有助于维持细胞 在时+ 胁迫下的生长。在生物体中草酸的合成主要有3 个途径：( 1 ) 草酰乙酸的水解；( 2 ) o 抗坏血酸的氧化裂解；( 3 ) 乙醛酸的氧化。实验表明假单胞菌的内膜是草酸经乙醛酸氧化的 主要来源地。作为培养基的成分，柠檬酸、异柠檬酸、柠檬酸铝能够使假单胞菌产生草酸，而 羟基乙酸、抗坏血酸盐等却不能，说明揭示相关的生化代谢途径之间差异的研究还需进一步的 深入。有研究表明时+ 可诱使荧光假单胞菌在细胞外产生磷脂酰乙醇胺等物质与甜+ 结合形 成不溶复合物来阿氐a 1 3 + 的毒害，起到类1 以有机酸的作用。酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s 鲫眺) 作为一种真核的模式微生物，能在低p h 值条件下正常生长，在研究a 1 3 + 毒害机制上有着特殊 的地位和作用。c o l i n 等( c o l i n w m ，1 9 9 6 ) 在酵母耐a p + 实验的培莠基中添加了柠檬酸、苹 果酸等有机酸后有效地改善了a 1 3 + 对细胞产生的毒害。d e l a f u e n t e 等( d e l a f u e n t e j m ，1 9 9 7 ) 将铜绿假单胞菌g d s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 中的柠檬酸合成酶基因转到烟草和番木瓜中使之 过量表达，柠檬酸含量的增加提高了转基因植物抗a r + 毒害的能力，同时也增强了植物吸收磷 的能力。然而e m m a n u e l 等( e m m a n u e ld ) 在烟草中得到的结果却与之存在较大的区别。 e i l 矾a n u d 等将铜绿假单胞菌的柠檬酸合成酶基因转到与d el a f u e n t e 等所采用的相同品系烟草 中，结果表明，虽然柠檬酸合成酶的蛋白质水平近增强了1 0 0 倍，但是与对照品系相比较，在 柠檬酸合成酶的活性、胞内柠檬酸含量及柠檬酸外排等方面都没有明显的提高，也就没有增强 植株的抗a p + 能力和吸收磷的能力。两个截然不同的结果表明还需要更多有力的证据来进一步 说现有机酸在抗a p + 毒害机制中所起的作用。 3 某些金属离子和离子通道蛋白与耐a 1 3 + 毒害的关系 有研究认为三价金属干扰c a 2 + 、m 孑+ 和f e 等金属在体内的代谢，并通过结苣臣0 细胞膜e 改变细胞膜的结构和特性，影响细胞正常生长，致使细胞发生病变。m 髯2 + 作为酶的一种重要 辅助因子，能结合到酶蛋白特定活性位点上，参与生化途经中的各种酶促反应。a 】r ( m a g n e s i u m a n d c o b a l t t r a n s p o r t e r p r o t e i n ) 蛋白是与鼠伤寒沙门氏菌( s a m o n e l a f y 却妇l f r 豇f m ) c o r a ( c o b a l t w a n s p o r t c rp r o t e i n ) 蛋白同源的类蛋白。c o r a 蛋白是定位于细菌的周质膜上的m f + 和c 0 2 + 的通道蛋白。c o l i n ( c o l i nw l v i ，1 9 9 8 ) 克隆和分析了酿酒酵母中a l r 和a l r 2 两个基因， 结果表明这两个基因的过量表达可以缓解a 】3 + 对酵母细胞的毒害，进一步证实了前面他们所做 的关于m 矿+ 可以明显减轻a 1 3 + 毒害，同时a 1 3 + 也可以抑制细胞对m g ：+ 、c 0 2 + 等金属离子的吸 浙江大学硕士研究生学位论文 收系统的结果，从而有力地提供了由于a 1 3 + 抑制了细胞经过a 】r 通道蛋白对m f + 的吸收而引 起a 1 3 + 对细胞毒害这一过程的遗传学证据。c a 2 + 作为机体的次级信号分子，在机体的信号传导 途经中发挥重要的作用，并与a p + 毒害也存在相关的联系。有实验证据表明c a 2 + 能改善a 1 3 + 对小麦的毒害作用( h i d e a h im ，2 0 0 0 ；l e o nv k ，1 9 9 5 ；t h o m a sb k ，1 9 9 8 ) ，但是在酿酒酵 母中则没有明显的结果。可能与培养基中的离子强度或植物与酵母细胞表面的离子结合能力、 表面电荷性质和数量不同及细胞膜的组成成分不同有关。生活于酸性温泉中的温泉红藻 ( c y a n i d i u m 地耐蜊) 对金属离子的毒害作用有明显的耐受性( s 嘶in ，2 0 0 2 ) ，特别是a 1 3 + ，在2 0 0 m m o l l 的灯上浓度下依然能够存活，而细胞内a 1 3 + 浓度则维持在较低的水平，这被 认为是由于一个能量依赖的a 1 3 上夕h 排系统起着重要作用。在温泉红藻中，f c 3 + 被认为与a 一 浓度在细胞体内呈相互制约的关系。当培养基中a 1 3 十的浓度增加时就会降低细胞内f p + 的浓 度。s e i j i 发现在温泉红藻中有一新的贮存f e 的颗粒存在，并在抗a 1 3 + 毒害中起着一定的作用。 通过透射电子显微镜和x 光分析表明这些观察到的电子致密体在正常的培养条件下用于贮存 f c ，而在高浓度的a 1 3 + 胁迫下时则起着隔离a 1 3 + 的作用，从而增强机体的耐a 1 3 + 能力。v a s u 等( v a s ud a ，1 9 9 6 ) 在研究胛1 7 对荧光假单胞菌的毒害时，利用多种观察方法发现由f e 和 a 1 3 + 形成的线状结构存在于细菌细胞的瘤椽结构体中，认为荧光假单胞菌解除a 1 3 + 毒害的机制 依赖于f e ，但没能提出f e 在这解除a r + 毒害机制中的具体作用。在大肠杆菌( g u i d al ， 1 9 9 1 ) 中，a 1 3 被认为是通过f e 3 + 的转运途径进 细胞内，从而结合到特定位点上去的。有一 些报道称硅( s i l i c o n ，s i ) 也被认为与缓解a l ”的生物毒害有重要联系( i s a b e lc ，1 9 9 7 ) 。s i 部分缓解了a 1 3 + 引发的细胞毒害，但不能阻止细胞对矿的吸收，具体的机制仍不清楚。作 为重要营养来源的某些酸根阴离子，如p o 。3 - m 时+ 毒害也存在相关的影响。 4 a t p a s o 在耐a 1 3 + 毒害中所起的作用 目前对液泡在解除金属离子对细胞毒害的作用机制研究中提出了一些新的观点和看法。酿 酒酵母的液泡具有一系列的作用如生物大分子的降解，代谢产物的贮存和维持胞质内浓度 的平衡等，除此之外还被认为在调控胞质内机体代谢所必需的金属离子浓度和解除金属离子毒 害保护细胞时起着重要的作用。二价金属m n 2 + 、f f + 、z n ：+ 、c 0 2 + 、c a 2 + 、s , 2 + 、n i 2 + 和单价 金属k + 、l j + 、c s + 等离子主要通过与某些多肽，如植物螯合肽( p h y t o c h e l a t i n s ，p c s ) 、谷胱 甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 、金属硫蛋白( m e t a u o t h i o n e i n s ，m r s ) 等螯合并通过液泡h + - a t p a s e 的作用被隔离贮存在液泡内，解除对细胞的毒害( l y n nm r ，1 9 9 7 ) 。c h r i s t i e 等( c h r i s t i e a h ， 浙江大学硕士研究生学位论文 2 0 0 1 ) 的实验表明是液泡h - - a t p a s e 参与酵母抗a 1 3 + 的机制中，而不是先前认为的和线粒体 f 1 f o - a t p a s e 起主要作用，并提出了一个假设( 图1 1 ) 。 图1 1 耐鼬机制中液泡和线粒体a t p 鹌e 维持能量平衡的假设图 f i 9 1 1 m o d e l r e p r e s e n t i n g t h e e n e r g y b a l a n c e h y p o t h e s i s f o r v - a t p a s e a n d f a f o - a t p a s e - m e d i a t e d a l r e s i s t a n c e 在小麦细胞中，高浓度衍+ 抑制了质膜p - a t p a s e 的活性致使细胞质内h + 积累，细胞质酸 化。与此同时液泡v - a t p a s e 的活性将得到增强，转运过剩的h + 至液泡内腔中，减缓h + 的胁 迫，也为激活假想中的耐a r + 机制提供所需的电势能，液泡h + 栅a s c 的能量消耗则由线粒 体f 1 f c a t p a s e 。然而这个假想没有提出具体的耐a r 机制，还需进步的砚究。同时还 有一些报道支持a 1 3 + 可被酵母细胞吸收至体内和液泡内，但b u n i c h i 等( b u n i c h ie ，1 9 9 9 ) 根 据桑色素的荧光染色观察结果认为细胞内的a 1 3 + 与液泡之间没有直接的联系。可能是由于桑色 素荧光染色的检测方法不够灵敏，或者是朋抖以其它的结合形式贮存在液泡中，造成未自旨险测 到微量a 1 3 + 。a p + 毒害引起的细胞形态的改变被认为可能跟液泡的结构变化有关。l l l m e r 等 ( 1 l l m e rp ，1 9 9 7 ) 通过建立半固体培养基上由h c l 和a 1 3 十引发的p h 值的变化曲线，分析了 在不同v h 值下，h c i 和a f + 对假单胞菌属的某些菌种( p s e u d o m o n a ss p ) 和节杆菌属某些菌 种( a r t h r o b a c t e r s p ) 的游动性影响，结果表明h c i 和a 1 3 + 都抑制了它们的游动性，但是a p 浙江大学硕士研究生学位论文 的抑制作用明显强过h c l 的抑制作用。l l l m e r 认为是由于a j 3 + 和a t p 形成稳定的复合物，抑 制了细胞内的能量流动，特别是膜上a z p a s e 的质子转运，致使用于游动所需的能量无法提供 或不足，刚氐了假单胞菌属和节杆菌属这些菌种的游动性。这从另个角度为a t p a s e 参与耐 ”机制提供了佐证。 5 氧化胁迫在耐a j 3 + 毒害中所起的作用 氧化问题一直是科学家研究的热点问题。过氧化氢( h 2 0 2 ) 、超氧阴离子( 0 2 - ) 、氢氧自 由基( o h ) 等滑l 生氧自由基( r e a c t i v e o x y g e n s p c c i e s ，r o s ) 对细胞内的脂膜、蛋白、d n a 等有很高的反应活性和损伤作用。p 一+ 是氧供体的种强竞争离子( w i u i a m sr j ，1 9 9 9 ) 。a 1 3 + 在人体的脑部引起神经性毒害作用十分明显，被认为与阿尔茨海默氏症( a l z h e i m e t s ) 和帕金 森氏综合症( p a r k i n s o n s ) 等严重的神经性疾病有关。在植物当中由于a r + 诱发的氧化胁迫致 使细胞死亡的报道也比较多( p a t f i c i ar s b ，2 0 0 3 ；l s m a i lc 。1 9 9 1 ；b u n i c h ie ，2 0 0 0 ) ，但是在 微生物中有关舢3 + 直接诱发氧化胁迫而造成纽瞻毒害的研究还少见报道。关于创3 + 之所以能引 起氧化胁迫的机制还不是很明确。b u 1 1 i c h i 等( b t m i c 牺e ，1 9 9 8 ) 分离了两个a j 3 _ 诱导表达的酿 酒酵母砸雕5 0 ( h e a t s h o c k p r o e i n g e n e ) 并0 s e o l ( o e u w a l l p r o t e i n g e n e ) 基因，并分别对这两 个基因的各自缺陷型进行a 1 3 + 处理和氧化处理，结果发5 现s e d l 在舢3 + 胁迫时起保护作用，而 h s p l 5 0 贝0 既起到a 1 3 + 胁迫的保护作用，又起到氧化蝴自的保护作用，表明a 1 3 + 与氧化这两种胁 迫作用在酿酒酵母中可能存在相互联系的保护机制。h s p l 5 0 是一种表达热激蛋白的基因，说 明a r + 胁迫与热休克胁迫也存在关联。p e r e i r a 等( p e m i r am d ，2 0 0 3 ) 在研究氧化b ”自与酵母抗 逆性的关系时也发现，在高温、饥饿、金属离子等逆性环境因子存在时可诱使酵母细胞产生活 性氧。一方面，r o s 可攻击膜脂、蛋白、d n a 等靶物质，使其丧失活性，造成对细胞的损伤； 另一方i 豇r o s 又可作为第二信使，通过调节胞内的一系列氧化还原反应，启动细胞的抗逆机制， 对细胞起到保护作用。至于i s 对细胞损伤和保护作用孰轻孰重，可能取决于逆性因子的作用 程度。a 1 3 + 作为逆性因子的一种，在理论上也应该存在相应机制，进一步研究a l ”毒害与氧化 胁迫之间的相关联系，相信对揭示越3 + 毒害的机制有着促进作用。 6 展望 a 1 3 十毒害和a 1 3 + 耐性机制是个复杂的生物学过程，也是体内外多种因素共同作用的结果。 除以上综述的因素外，以下几个方面将成为今后这方面研究的重点：( 1 ) a l r ( c o l i n w m ， 1 0 浙江大学硕士研究生学位论文 1 9 9 8 ；g u o j l ，2 0 0 2 ) 、a l u - p ( a 1r e s i s t a l l c e p r o t e i n g e n e ) ( j i n l d j ，1 9 9 7 ) 、b c b ( a g e n e f o r b l u e c o p p e r b i n d i n g p r o t e i n ) 、n t g d l l ( a g e n e f o r t h e g d p d i s s o c i a t i o n i n h i b i t o r ) 等；基因的衷哒被认为 与a 1 3 + 挠睦有关，但是其中表达的蛋白质所起的作用及其机理等问题还未被明确揭示，是今后 进一步研究的一个方向；( 2 ) a 1 3 + 毒害引起对细胞信号转导途径的影响，细胞周期调控的影响 ( s c h o t tf a ，1 9 9 7 ) 以及所导致的植物根尖边缘细胞的死亡( z 执m y ，2 0 0 3 ) 和a 1 3 + 诱发的 细胞程序陛死亡( g e o r g e sd ，2 0 0 1 ) 等方面的探讨和研究已取得初步成果，有待进步的深 入；( 3 ) 利用模式生物进行金属离子毒害等相关的基因组学( d 砌dj e ，2 0 0 1 ：g u r ig ，2 0 0 2 ) 和蛋白质组学的研究也将成为今后揭示a 1 3 + 毒害的机理的重要手段。酿酒酵母等微生物具有得 天独厚的优势，必将作为一类重要的模式生物材料在今后矿毒害和耐性机制研究中发挥重要 作用，同时也可为经济作物抗a 1 3 + 毒害的研究提供宝贵的参考价值和应用价值。 1 l 浙江大学硕士研究生学位论文 第二章酿酒酵母耐铝机制中可能包含抗氧化作用 铝( a k m f m u m ，a 1 ) 是一种分布极为广泛的金属元素。它通过电解铝、金属制造业、日 常生活用具的固体废物等多种途径释放到环境中。在自然界中，a l 主要以硅酸盐和氧化物的 形式存在，约占地壳外部8 的重量。当酸雨使a i 化合物水解形成八面体结构的六水化合物 础( 动o ) 时，对农作物的毒害明显加剧，也使得森林的生态环境受到致命的影响，随着 a 1 化物在日常生活中的广泛使用，对生态环境的影响也日趋加深。在酸性土壤中，m 胁迫能 对植物体产生多种毒害效应，其中最显著的效应是对植物生长的抑制，从而严重限制了作物的 产量。全世界酸生壤的比例高达4 0 ，主要分布在热带和亚热带地区，仅在我国酸性土壤 约占全国耕地面积的2 1 ，主要分布在我国南方的广大红壤区域。 我国是个农业国家，如何解决这一具有巨大经济效益和社会效应的科学问题，成为当前 国内外科学家普遍的关注课题。酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 作为一种单细胞真核微 翻 生物，无论在酒精发酵工业产业核生命科学领域模式生物研究中都发挥着重要作用。并且由于 蕊 s 。c e r e v i s i a e 的6 0 0 0 多个基因与人类的相关基因具有较高的相似性，所以利蔓c e r e v i s i a e 这真 n 核模式生物为材料开展金属毒害和抗性机制研究成为众多科学研究的理想选择。在细胞水平的 耐a 1 3 + 机制中，目前认为主要有体外和体内两种方式。体外方式为当生物体受到a 1 3 + 胁迫时， 通过合成分泌些螯合剂与a p 结合，阻止a 1 3 + 被细胞所吸收。体内方式为将被吸收至细胞内 的a 1 3 + 与某些生物分子结合形成复合物，通过一些酶促反应解毒或被隔离于液泡中，使细胞能 正常生长。 目前国内外酿酒酵母a 1 3 + 毒害机制研究的一些报道相继发表，但是对于a 1 3 + 毒害与氧化胁 迫作用的相关性研究较少。在本研究中，魏们通过以酿酒酵母野生型菌株c y 4 和础2 缺陷体 c y 8 为基本研究材料，分析了g s h 在增强酵母细胞抗时+ 毒害所发挥的作用，希望能为酿酒 酵母a 1 3 + 毒害和抗性机制研究提高一些研究参考。 2 材料和方法 浙江大学硕士研究生学位论文 2 1 使用的酿酒酵母菌株( 种) 与菌种培养条件 本实验研究所使用菌种s a o o h a r o m y o e sc e r e v s i a 巧0 于表2 1 。野生型菌种及缺失型 ( g s h ld e l e ：i o n ) c y 8 受赠于d r i a nw d a w e s ( c o o p e r a t i v er e s e a r c hc e n t e rf o rf o o d i n d u s t r yi n n o v a t i o n ，s c h o o lo fb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rg e n e t i c s ，u n i v e r s i t yo fn e w s o u t hw a l e s ，s y d n e y ，n s w2 0 5 2 ，h u s t r a l i a ) 。e g y 4 8 为实验室保存菌株。 sc e r e v i s i a e 一般培养于3 0 c ，培养基为y p d 或y p g ( d a nb ，2 0 0 0 ) 。而论文中出现 的其它培养基见附录一。酿酒酵母菌株的保存于7 0 ，4 与3 0 。c 。 表2 1 实验所使用菌株的名称与遗传背景 t a b l e 2 1t h ed a m ea n dg e n e t i c b a c k g r o u n do fs t r a i n s e g y 4 8 m a t a h i s 3 t r p lu r a 3 l e x a o p ( x 6 ) - l e u 2 t h i sl a b o r a t o r y 2 - 2sc e r e v i s i a e 细胞的染色与显微观察 t i y p a nb l u e 染色方法参考沈萍( 沈萍，2 0 0 0 ) 的方法： 1 将至各种处理培养时间的酵母细胞培养液取适量至无菌塑料小管中，加入相对量的 t r y p a nb l u e 染色剂或离心经收集细胞后再加入n y p 姐b 1 u e 染色剂于趣声波处理几 秒。 2 取少量匀液至干燥洁净的载玻片中央，盖上盖玻片，于普通显微镜( o l y m p u sb h - 2 c 玎口_ 0 1 2 e ) 下观察并拍照记录。 f d a - p i 染色方法参考e s t h e rm ( e s t h e rm ，2 0 0 2 ) 的方法： 1 将至各种处理培养时间的酵母细胞菌液于3 0 0 0 r p l l l 离心3 m i n ，弃去上清，用0 2 m p b s ( p h 7 4 ) 溶液重悬，使之菌液浓度大约为1 0 6 c e l l m l 。 浙江大学硕士研究生学位论文 2 取定量菌液至载玻片上，同时点加f d a 或p i f d a - p i 试剂，使其工作浓度分别为 1 0p1 w m 1 ，5 0pg m 。在室温下染色l m i n 后，于荧光显微镜下观察并拍照记录。 2 3 生长曲线与相对生长率测定 生长曲线测定： 1 先将盅c e r e v i s i a e 从刁0 保存管中复活，吸取融化后的菌液涂布于y p d 固体平板， 3 0 培养。 2 经充分活化后，分别挑取单一菌落并将其接种至含普通玻璃珠的无菌d d h l 3 中，经 剧烈震荡使之打散后，取适量菌液至y p d 液体培养基中，于3 0 。c ，2 0 嘶d m 震荡隔 夜培养1 2 1 5 小时。 3 于超净台收集菌液，3 0 0 0 w m 离心3 m i n ，弃去上清。经无菌去离子h 2 0 ( 将d d h 2 0 经u s f i l t e rp u r e l a bp l u s 超纯水仪去离子处理后得到) 洗涤两次后，用无菌去离 子h 2 0 重悬并震荡混匀，取适量菌悬液至l p p ( s c h o t te l ，1 9 9 7 ) 液体培养基中， 使之初始菌液o d 6 0 0 为0 0 2 或0 0 5 ，于s o t ，2 0 0 1 舯震荡培养，然后于每间隔1 2 小时以培养基为对照测定光吸收值o d 6 0 0 ( 紫外可见分光光度仪g p7 5 2 ( s p 2 0 0 0 型) ) 。a l c l 3 ( a l u m i n u m i o n ) 于开始培养o 小时或5 小时后加入培养基中。 相对生长率测定： 1 首先将sc e r e v i s i a e 复活，吸取融化后的菌液涂布于y p d 固体平板，3 0 培养。 2 经充分活化后，分别挑取单一菌落并将其接种至含普通玻璃珠的无菌液体中，经剧 烈震荡使之打散后，取适量菌液至y p d 液体培养基中，于3 0 0 ，2 0 0 r p m 震荡隔夜 培养1 2 1 5 小时。 3 于超净台收集菌液，3 1 0 0 i p m 离心3 m i n ，弃去上清。经无菌去离子h 2 0 洗涤两次后， 用无菌去离子h 2 0 重悬并震荡混匀，取适量菌悬液至i 肿液体培养基中，使之初始 菌液o d e o o 为0 0 2 或0 0 5 ，于3 0 c ，2 h p m 震荡培养。培养2 4 小时后以培养基为 对照测定光吸收值( 0 d 6 0 0 ) 。舢c 1 3 ( a l u m i m t mi o n ) 于开始培养0 小时或5 小时后 加入培养基中。 4 以无a 1 3 十处理的菌液光吸收值( o d 6 0 0 ) 为对照，分析经不同浓度a p 处理后各菌株 的相对生长情况及状态。 1 4 浙江大学硕士研究生学位论文 2 4 存活率( c e l ls u r v i v a lr a t e ) 的测定 平板涂布法： 1 将至各种处理培养时间的酵母菌株于超净台收集菌液，3 0 0 0 r p m 离心3 m i n ，弃去上 清。 2 经无菌去离子h z o 洗涤两次后，用无菌去离子 - 2 0 重悬并震荡混匀，经适当倍数稀 释后取相同菌量的菌液至平板涂布，每个样至少涂布3 次。 3 平板封口后于3 0 倒置培养2 3 天后计数并观察记录结果。 微量点样法( s c h o t te j ，1 9 9 7 ；s h i n i i mk ，1 9 9 6 ) ： 1 将至各种处理培养时间的酵母菌株于超净台收集菌液，3 0 0 0 r p m 离，t ：, 3 r a i n ，弃去上 清。 2 ，经无菌去离子h 2 0 洗涤两次后，用无菌去离子h 2 0 重悬并震荡混匀，经适当倍数稀 释后取51 tl 相同菌量的菌液点样至平板，每个样至少重复点样3 次。 3 平板封口后于3 0 倒置培养2 3 天后观察并记录结果( d i g i t a lc a m e r ao l y m p u s ( 8 6 0 i ，) 。 2 5 a p + 浓度的测定与吸收情况的分析 粝i 佳曲线的绘制( m e n z i e sn w ，1 9 9 2 ：k e r v e ng l ，1 9 8 9 ) 1 以酸性去离子水配制5 0 0 p m a l c l 3 母液。 2 以酸性去离子水配截0 0 3 7 5 p c v ( p y r o c a t e c h o ! v i o l e t ：邻苯二酚紫) 溶液。 3 以酸性去离子水配制1 mp h 5 6 咪唑溶液。 4 分别取适量的a 1 c 1 3 母液，加入l r d 咪唑、0 , 2 m lp c v 及酸性去离子水，使总体积为 4 7 m l ，且a 1 3 + 浓度分别为0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0hm 。 5 震荡混匀后于室温放置1 小时后在o d 5 7 8 条件下测定光吸收值，使用o r i g i n 6 1 软件 绘制标准曲线及得出回归方程。 6 p c v 法测定浓度的标准曲线及回归方程为： x = ( a 5 7 s - - 0 0 1 5 1 1 ) 0 0 1 5 5 4 ( r = 0 9 8 7 1 4 ) 单位为um a 1 3 + 浓度的测定： 1 将经不同处理培养至一定时间后的培养液收集于5 0 m l 管中，a o o o o w m ，4 离心 浙江大学硕士研究生学位论文 1 0 r a i n 。 2 取2 m l 上清至1 0 m l 管中，后分别加入1 5 1 删i 酸性去离子水，i m l 眯唑及0 2 r i dp c v 试剂，震荡混匀后于室温放置1 小时后在0 1 ) 5 7 8 条件下测定光吸收值。 3 根据回归方程计算上清中3 + 浓度。测定细胞干重，计算细胞内a 1 3 + 浓度。 2 6 蛋白质浓度测定 标准曲线的绘制( 李建武，1 9 9 7 ) ： 1 配制考马氏亮蓝试剂。 2 配制1 m 咖l 0 1 m g m l 蛋白溶液。 3 于1 0 m l 塑料管中加入一定量的蛋白溶液后，分别加入相应量的0 1 5 mn a c i 及5 m l 考马氏亮蓝g - 2 5 0 试剂，使总体积为5 0 1 m l 。振荡混匀反应1 0 m i n 后开始测定各个 浓度于o d s 蛄n r n 条件下的光吸收值，使用o r i g i n 6 1 软件绘制标准曲线及得出回归方 程。 4 考马氏亮蓝法测定蛋白质的标准曲线得到的回归方程为： 氐9 5 大于0 1 时：x = ( a s g s - - 0 0 3 0 1 8 ) 0 8 3 1 7 9 ( r = 0 9 9 4 1 6 ) 单位为m 咖l a 5 9 5 ：j 于0 1 时：x = ( a 5 9 5 + 0 0 0 3 2 1 ) 1 0 8 3 6 1 ( r = 0 9 9 6 3 ) 单位为m g w a 酵母细胞破壁后蛋白质浓度测定： 1 待测定蛋白质浓度的裂锯液e 清5 0 1 1 1 至1 0 m l 塑料管中，另加入5 0 1 0 1 5 m n a c l 及5 m l 考马氏亮蓝g - 2 5 0 试剂。 2 振荡混匀反应1 0 m i n 后开始测定o d 5 9 5 。 2 7 细胞内分子氧化作用( m o l e c u l a ro x i d a t i o