（神经生物学专业论文）背根节神经元细胞表面delta阿片受体表达与调控机制的研究.pdf

中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共同完成的工作外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 2 ) 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验数 据真实可靠。 该声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：缛莎锋 日期：2 0 0 6 年6 月5t q 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使用学位论 文的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电子文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；生科院可以公布论文的全部或部分内容，可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名： ! 星! 聋导师签名：4 ) 独! 日期： 2 q 竖：5 y1 0 1 4 0 3 5 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体袁达与调控机制的研究 背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达 与调控机制的研究 徐贞仲( 神经生物学) 指导老师：张旭教授 摘要 背根神经节是痛觉信息传递的第一站，其神经元细胞表面阿片受体的表 达与调控对于阿片类药物的镇痛效果具有重要的意义。本论文主要以小鼠背 根节神经元为研究对象，以细胞表面的d e l t a 阿片受体( d o r ) 的调控为核 心，通过细胞生物学、电生理学和药理学等方法研究了d o r 在细胞表面的 表达与调控机制。受体插入到细胞表面的途径可以分为两类：与刺激耦联的 可调节分泌途径和与刺激无关的持续分泌途径。背根节小神经元中，m u 阿 片受体通过持续分泌途径上膜，而大部分d o r 与神经肽类物质共存于大致 密芯囊泡中。我们发现细胞受到伤害性刺激时胞内钙浓度升高，细胞发生胞 吐，d o r 插入到细胞膜表面，增加了膜表面受体总量，即d o r 的上膜以依 赖于钙浓度升高的方式受伤害性刺激的调控。我们进一步发现d o r 进入可 调节分泌途径依赖于p 物质前体蛋白的表达，前速激肽原a 基因敲除导致 刺激无法诱导d o r 插入到细胞膜表面，而且d o r 激动荆所诱发的大致密 芯囊泡胞吐也大为减弱。此外，我们还发现可穿膜的d o r 拮抗剂作为药理 学伴娘可以增强d o r 上膜，这一方式是通过持续分泌途径和可调节分泌途 径中的d o r 同时增加来实现的，且不依赖于细胞内钙浓度的升高。这些结 果表明背根节神经元细胞表面d o r 表达受多种因素调控，理解这些调控机 理对于合理使用阿片类药物镇痛和发展新的阿片类药物具有重要意义。 关键词：背根神经节d e l t a 阿片受体大致密芯囊泡p 物质持续分泌途径 可调节分泌途径药理学伴娘 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 r e g u l a t i o no f c e l ls u r f a c ee x p r e s s i o no fd e l t ao p i o i d r e c e p t o ri nd o r s a lr o o tg a n g l i o nn e u r o n s z h e n _ z h o n gx u ( n e u r o s c i e n c e ) d i r e c t e db yp r o f x uz h a n g a b s t r a c t t h eo p i o i ds y s t e ms e r v e si n h i b i t o r yf u n c t i o n si np a i nt r a n s m i s s i o n d e l t a a n d m u - o p i o i dr e c e p t o r sa r ee x p r e s s e di ns m a l ld o r s a lr o o tg a n g l i o n ( d r o ) n e u r o n s a n dm e , m et h ee f f e c t so f e n d o g e n o u so p i o i dp e p t i d e s a n d a n a l g e s i c s i n t e r e s t i n g l y ，w h i l em u - o p i o i dr e c e p t o r sa r et r a n s p o r t e da l o n gt h ec o n s t i t u t i v e p a t h w a y ，8 - o p i o i dr e c e p t o r s ( d o r s ) a r es o r t e di n t ot h er e g u l a t e dp a t h w a ya n d a r e o f t e nf o u n dt ob ea s s o c i a t e dw i t hl a r g ed e n s e - c o r ev e s i c l e s ( l d c v s ) i nt h ef i r s t p a r t ，w ef o u n dt h a tm e m b r a n ei n s e r t i o no fd o r sc a nb et r i g g e r e db yn o c i c e p t i v e s t i m u l u s i n d u c e dc a 2 + e l e v a t i o nt h a tc a u s e se x o c y t o s i so fl d c v s d e l e t i o no f t h e p r e p r o t a c h y k i n i nag e n ee l i m i n a t e st h es o r t i n go fd o l l si n t ot h er e g u l a t e d s e c r e t o r yp a t h w a y w ea l s of o u n dt h a td e l e t i o no ft h ep r e p r o m c h ) ，k i n i nag e n e e l i m i n a t e sm e m b r a n ei n s e r t i o no fd o r si n d u c e db ys t i m u l u sa n da t t e n u a t e st h e a g o n i s t - i n d u c e dl o n g l a s t i n ge x o c y t o s i so fl d c v s i nt h e s e c o n dp a r t ，w e d e m o n s t r a t e dt h er e g u l a t i o no fs u r f a c ee x p r e s s i o no fd o r si nd r gn e u r o n s i n d e p e n d e n to fc a ”e l e v a t i o n w ef o u n dt h a tn a l t r i n d o l e ，ap h a r m a c o l o g i c a l c h a p e r o n eo fd o r ，e n h a n c eb o t ht h ec o n s t i t u t i v ea n dr e g u l a t e dp a t h w a yo fd o r e x p r e s s i o nb yf a c i l i t a t e dt h em a t u r a t i o na n di n h i b i t i n gt h ed e g r a d a t i o no fd o r p r e c u r s o ri ne n d o p l a s m i cr e t i n u m t a k e nt o g e t h e r ，t h e s es t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a t s u r f a c ee x p r e s s i o no fd o l l si ns m a l ld r gn e u r o n sc a nb er e g u l a t e db ym u l t i p l e f a c t o r s a n dt h er e g u l a t i o nm a yh a v es i g n i f i c a n ti m p l i c a t i o n sf o rm o d u l a t i o no f o p i o i d sa n a l g e s i ce f f e c ta n dd e v e l o p m e n to f n e wa n a l g e s i cd r u g s k e yw o r d s ：d o r s a lr o o tg a n g l i o n ，d e l t ao p i o i dr e c e p t o r , c o n s t i t u t i v ep a t h w a y ， r e g u l a t e dp a t h w a y ，s u b s t a n c ep ，l a r g ed e n s e c o r ev e s i c l e ，p h a r m a c o l o g i c a l c h a p e r o n e 2 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 d o r m o r l d c v d r g p p t - a c g i 己p s p d e l t c m g s g m c 2 + 】i i u 冲 t g n n 1 1 英文缩略词表 8 - o p i o i dr e c e p t o r 斗- o p i o i dr e c e p t o r l a r g ed e n s e - g o r ev e s i c l e d o r s a lr o o tg a n g l i o n p r e p r o t a c h y k i n i n - a c a l c i t o n i ng e n e - r e l a t e dp e p t i d e s u b s t a n c ep d e l t r o p h i n m e m b r a n ec a p a c i t a n c e s e r i e sc o n d u c t a n c e m e m b r a n ec o n d u c t a n c e i n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n r e a d i l yr e l e a s a b l ep o o l 仃a n s g o l g in e t w o r k n a l 们n d o l e d e l t a 阿片受体 m u 阿片受体 大致密芯囊泡 背根神经节 前速激肽原a 降钙素基因相关肽 p 物质 6 吗啡 膜电容 串联电导 膜电导 胞内游离钙离子浓度 拟释放囊泡池 反式高尔基网状结构 纳曲吲哚 学位论文背根节神经元细胞袭面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 第一部分：伤害性刺激诱发背根节神经元钙依赖性胞吐和 d e l t a 阿片受体通过可调节分泌途径上膜 一、前言 阿片类药物是一类强效镇痛药物，是目前用于治疗各种急慢性疼痛和癌 症痛的常用药物【1 ，2 】。阿片类药物通过激活阿片受体而产生镇痛效果。上世 纪9 0 年代，阿片肽受体各种亚型陆续被克隆。迄今为止，已经发现四种阿 片受体亚型：d e l t a 阿片受体( 6 - o p i o i dr e c e p t o r ，d o r ) 、m u 阿片受体( - o p i o i dr e c e p t o r ，m o r ) 、k a p p a 阿片受体( 1 c - o p i o i dr e c e p t o r ，k o r ) 和n 型 阿片受体( n o c i c e p t i n o r p h a n i nf qr e c e p t o r ) ，它们均为七次跨膜g 蛋白耦 联受体( gp r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o r , g p c r ) 。因为吗啡与m o r 的结合力最 强，所以在吗啡镇痛的相关研究中，针对m o r 的研究较多，而对d o r 的 研究比较少 3 ，4 】。但是，由于选择性针对d o r 的药物具有较小的副作用， 因此也越来越受重视【5 7 】。 d o r 是第一个被克隆的阿片受体。1 9 9 2 年，k i e f f e r 和e v a n s 分别从 n g l 0 8 1 5 细胞株中克隆了小鼠的d o r ，其由3 7 2 个氨基酸组成，相对分子 量约为4 0k d ，在氨基端有两个糖基化位点 8 ，9 】。1 9 9 3 年，y a s u d a 等从大鼠 脑中克隆的d o r 也由3 7 2 个氨基酸组成，与小鼠d o r 有9 7 的同源性 1 0 】。1 9 9 4 年，k n a p p 等克隆出人的d o r ，同样由3 7 2 个氨基酸组成，与小 鼠和大鼠的d o r 有9 3 的同源性【1 1 】。d o r 在外周神经系统和中枢神经系 统都有广泛分布，它主要分布于皮层、嗅球、海马、基底神经节、杏仁核和 下丘脑等区域 1 2 1 ，在痛觉信息传递的第一站背根神经节( d o r s a lr o o t g a n g l i o n ，d r o ) 及其传入神经末梢集中的脊髓背角浅层( i 和i i 层) 均有 许多d o r 表达 1 3 ，1 4 。 在背根神经节中，小神经元被认为与痛觉传导直接相关。外周伤害性刺 激产生的冲动经d r g 小神经元传入，引起脊髓背角d r g 末梢所含神经肽p 物质( s u b s t a n c ep ) 和降钙素基因相关肽( c a l c i t o n i ng e n e - r e l a t e dp e p t i d e ， 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 c g r p ) 释放，这些神经肽通常共存于大致密芯囊泡( 1 a r g ed e n s e c o r e v e s i c l e ，l d c v ) 内f 1 5 1 。d o r 与m o r 的作用都被认为与突触前抑制p 物质 和c g r p 的释放有关 1 6 ，1 7 ，也有报道显示同时激活m o r 和k o r 对于抑 制c g r p 的释放是必须的，而激活d o r 可以促进c g r p 的释放 i s l 。 神经元的分泌途径大体可以分为两类：与刺激耦联的可调节分泌途径和 与刺激无关的持续分泌途径 1 9 ，2 0 1 。几乎所有的真核细胞都具有持续分泌途 径，参与此途径的囊泡从反式高尔基网状结构( t r a m g o l g in e t w o r k ，t o n ) 形成之后，直接运送到细胞膜下并与胞膜融合，将内容物释放到胞外，这个 过程不依赖于特定的胞外刺激。在可调节分泌途径中，神经肽储存在l d c v 中，而神经递质储存在突触囊泡中，当受到分泌信号刺激时进行胞吐，被释 放到胞外。根据传统细胞生物学理论，膜受体在内质网合成后通常持续不断 地转运到细胞膜表面，大多数g 蛋白耦联受体( 立1 2 m o r ) 都是通过这条途径 转运到细胞膜上的 a 1 1 。d o r 是通过哪条途径转运到细胞膜上的呢? 据报道 在d r g 神经元中细胞膜表面的d o r 并不多，大部分的d o r 都存在于胞浆 中，并且通常是存在于l d c v 膜结构上 1 3 ，2 2 1 。d r g 神经元中d o r 存在于 l d c v 上有什么生理意义呢? 我们推测，辣椒素等伤害性刺激通过促发可调 节分泌途径引起神经肽释放的过程中可能同时伴随着d o r 的上膜。 在这部分工作中，我们研究了d r g 小神经元中可调节分泌途径和d o r 上膜之间的耦联关系，以及与之相关的细胞机制。实验发现伤害性刺激诱发 背根节神经元d o r 通过可调节分泌途径插入到细胞表面。然而，促使d o r 进入可调控分泌途径的机制并不清楚。对于膜蛋白分子分拣进入可调控分泌 途径的分拣机制，有这样一个假说：囊泡特有的内含物与囊泡膜上的蛋白结 合从而将膜蛋白拉入到特定的囊泡。然而该假说一直没有直接证据 2 3 1 。 我们实验室管吉松等的研究表明：p 物质前体蛋白直接与d o r 结合， 从而将d o r 分拣入l d c v 。p 物质是最早发现的一种神经肽，共11 个氨基 酸 2 4 ，2 5 。它由前速激肽原- a ( p r e p r o t a c h y k i n i n a ，p p t - a ) 基因编码。经 不同的剪切形成三种m r n a ：、b 和y - p p t ，其中背根节神经元中含有丰 富的i b - p p t 。与大多数神经肽类物质一样，1 3 - p p t 蛋白通过其n 端的信号肽 6 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 进入内质网，在t g n 中被分拣进入l d c v ，并在l d c v 中被剪切形成最终 的成熟肽。p 物质分布在背根神经节小神经元中，被分拣进入l d c v 后，分 别转运到外周组织与脊髓背角i i i 层的神经末梢 2 6 ，2 7 1 。外界痛刺激能够诱 发末梢内的p 物质释放，而基因敲除p p t a 基因或p 物质受体基因 2 8 3 0 ，小鼠对中强度痛刺激的反应减弱，因此p 物质被认为与痛觉传递密切 相关f 3 1 ，3 2 】。那么，如果敲除p p t a 基因，对d o r 的可调节上膜与囊泡释 放有何影响呢? 本研究我们还进一步探讨了敲除p p t a 基因小鼠d o r 的可 调节上膜机制发生了怎样的改变。 二、材料与方法 1 小鼠背根神经节细胞的急性分离 将1 2 1 4g 的c 一5 7 b l 6 n 小鼠击昏断头处死，用咬骨钳暴露脊髓的胸段 和腰段，在4 0 c 的d m e m 培养基中取出1 0 来对背根神经节，再移至1 砌 消化液 1m g m l 胶原酶( e o u a g e n a s et y p e1 a ，s i g m a ) 、0 4m g m l 胰蛋白酶 ( t r y p s i nt y p ei ，s i g m a ) 和0 1m g m ld n a 酶( d n a s ei ，s i g m a ) 中，3 7 。c 水 浴消化3 5 分钟。取出并用细胞外液冲洗3 次，加1 毫升正常外液，用口径 逐渐缩小的玻璃管吹打神经节至无明显的块状物质。取上清滴于盖玻片上， 贴壁3 0 分钟，加入剩余细胞外液，室温放置1 小时后使用。 2 电生理记录 2 1 微电极的拉制 使用外径为1 5m i l l 、长为8c m 的无芯玻璃毛细管( 南京六合县泉水 教学实验器材厂) ，在p p - 8 3 0 ( n a r i s h i g e ，日本) 垂直式拉制仪上用两 步法拉制成记录用的微电极。电极尖端直径一般为2 5i m a 左右，灌注电极 内液后电极阻抗为3 5m q 。检测细胞的膜电容前，电极尖端需上一层蜡方 可进行实验。 2 2 全细胞膜片钳记录 学位论文 背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 准备好的细胞转移到记录糟中，置于i x 5 0 倒置相差显微镜 ( o l y m p u s ，日本) 载物台上，在2 0 倍物镜下，状态好的神经元般胞体 饱满均匀，边界清晰。在电压钳模式下用微操纵器引导充有电极内液的玻 璃微电极靠近细胞，待电极尖端入水前，轻轻推动注射器在电极内给一个 j 下压。待电极靠近细胞后，释放掉正压并顺势用嘴给一个负压，同时将 h o l d i n g 电压调节到一2 0m v 就很容易形成高阻封接( lg q ) 。再慢慢 将钳制电压调到7 0m v ，待封接稳定形成之后，给予大而短促的负压可以 使电极尖端下的小片细胞膜破裂，从而形成全细胞记录模式( w h o l e c e l l r e c o r d i n g ) 。所用放大器为e p c 9 ( h e k ae l e k t r o n i k ，德国) ，数据采集 软件是p u l s e8 3 ( h e k ae l e k t r o n i k ，德国) ，数据分析软件是i g o r4 0 3 ( w a v e m e t r i c s ) 。对于d r g 细胞的电压钳记录，钳制电压为7 0m v ，采样 频率为2 k 赫兹。在单细胞记录模式下，加药系统采取d a d 微量快速给药 灌流系统( d a ds u p e r f u s i o ns y s t e m ，a l a ，美国) ，其换药时间很快( 小于 1 0 0m s ) ，加药管的头距离被检测的细胞1 5 0t u n 左右。所有的实验都在室 温( 2 0 2 5 。c ) 进行。标准的含有钙离子的细胞外液含有( i nm v 1 ) ：1 5 0 n a c l 、5k c l 、2 5c a c l 2 、1 0h e p e s 、1 0g l u c o s e ，p h = 7 4 0 。不含钙离子的 细胞外液是用lm me g t a 取代2 5m v l 的钙离子。电极内液含有( i n m m ) ：1 5 3c s c i 、1m g c l 2 、1 0h e p e s 、4a t p ，p h = 7 2 。以上电生理试 剂均来自s i g m a 公司。 2 3 细胞胞吐的膜电容检测方法 我们实验使用s i n + d c 的方法 3 3 1 来检测细胞的膜电容。该方法就是用 软件锁相放大器来记录膜电容( m e m b r a n ec a p a c i t a n c e ，c m ) 、串联电导 ( a c c e s sc o n d u c t a n c e g s ) 和膜电导( m e m b r a n ec o n d u c t a n c e ，g m ) 的变化， 锁相放大器中内含正弦波振荡器，既为膜片钳放大器的刺激信号，又作为锁 相放大器的参考信号；这种方法将正弦波刺激叠加在一直流电流上，可以同 时测出全细胞等效电路中的三个未知数，即串联电导( g s ) 、膜电导 ( g m ) 和膜电容( c m ) 。给细胞施加一个1k 赫兹、4 0 m v 大小( p e a k t o p e a k ) 的正弦波，将得到的细胞响应通过p u l s e8 _ 3 的l o c k - i n 模块进行分 r 一 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 析，就可以算出细胞的c m 、g s 和g m 。对刺激前后的这些参数的分析就可 以计算细胞的胞吐情况。 3 细胞内游离钙离子浓度测量方法 我们用钙成像系统( t i l - lp h o t o n i c s ，德国) 对d r g 细胞的胞内游离 钙离子浓度( i n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n ， c a 2 + ，) 进行检测。激发 波长分别是3 4 0n m 和3 8 0n m ，这样可以用f 3 4 0 f 3 8 0 的比值作为【c a 2 + i 的 度量。测量前用lr t m 的f u r a - 2a m ( s i g m a r b i ) 在3 7 。c 或常温下孵育 d r g 细胞1 5 - 3 0 分钟，然后用无染料的外液清洗3 遍，静置1 5 2 0 分钟后使 用。 4 免疫组织亿学 4 1 免疫荧光组织化学方法 组织切片：雄性小鼠用固定液( 4 多聚甲醛和0 0 1 苦味酸) 灌注， 脊髓取l 4 和l 5 节段( 腰膨大) ，背根神经节取l 4 和l 5 。后固定1 5 小 时，1 0 蔗糖浸泡2 4 小时以上，组织在l e i c ac m l 9 0 0 冰冻切片机 ( l e i c a ，德国) 切片( 脊髓，1 4 m ；d r g ，6 m ) 。 免疫组织化学染色：将标签( 注有实验名称、免疫组织化学抗体名称、 二抗荧光素名称和日期) 贴上，在切片的四周涂上指甲油，凉干。用光镜抗 体稀释液【1 牛血清白蛋白和0 3 曲拉通( t r i t o nx - l o o ) 稀释第一抗体，用 量视切片的大小而定，每张切片5 0 1 0 0 l ，抗体充分搅匀后，加在切片 ( 放在湿盒内) 上，4 c 孵育1 6 2 4 小时。将湿盒从冰箱中拿出，切片放入 装有o 0 lmp b s 的染缸中，换一次p b s ，换液时注意勿对着切片冲，5 分 钟后再换一次p b s ，1 0 分钟后可上二抗。用o 0 1mp b s 稀释荧光第二抗 体，抗体稀释度均为1 ：1 0 0 。单标时用f i t c 标记的荧光抗体，双标时一般 抗兔的用f i t c 标记的荧光素，另一种用l r s c ( p , r x ) 或其它荧光素。抗体 稀释后需充分混匀，用吸水纸吸干指甲油及其外周的水，将荧光第二抗体加 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 入，放入3 74 c 温箱中孵育3 0 分钟。然后将湿盒从温箱中取出，切片放入装 有0 0 1mp b s 的染缸中，换一次p b s ，此时将免疫荧光用封片剂从2 0 ( 2 冰 箱中拿出，置于染缸中的切片5 分钟后换一次p b s ，1 0 分钟后可封片。封 片时先检查盖玻片是否干净，将盖玻片置于放有一张滤纸的载片板上，加入 一滴封片剂，将切片封上。染色后的切片用l e i e as p 2 激光共聚焦显微镜 ( l e i c a ，德国) 采集图象数据。 免疫细胞化学染色：用固定液( 4 多聚甲醛和0 0 1 苦味酸) 固定细 胞1 0 分钟，p b s 洗三次。再用光镜抗体稀释液稀释第一抗体，与细胞在4 。c 孵育1 6 2 4 小时( 放在湿盒内) ，二抗在3 7 孵育3 0 分钟。其他同上。 4 2a b c 免疫组织化学方法 从一2 0 冰箱中取出切片，回温，并将标签( 注有实验名称、免疫组织 化学抗体名称、抗体源性、稀释度、日期和片号) 贴上，在切片的四周涂上 指甲油，凉干。用光镜抗体稀释液稀释第一抗体，用量视切片的大小而定， 每张切片5 0 1 0 0g l ，抗体充分搅匀后，加在切片上，4 c 孵育4 8 小时。将 湿盒从冰箱中拿出，切片放入装有0 0 1mp b s 的染缸中，换一次p b s ，换 液时注意勿对着切片冲，1 0 分钟后再换一次p b s ，2 0 分钟后可上二抗，总 洗片时间为3 0 分钟。用o o lmp b s 稀释b i o t i n 标记的第二抗体( b i g g ) ，第二抗体是种属特异性抗体，与第一抗体的源性有关( v e c t o r 公 司) ，抗体稀释度均为l ：2 0 0 ，在湿盒中室温下放3 - 4 小时。加第二抗体时 将a v i d i n ( a ) 和b i o t i n ( b ) 以1 ：1 0 0 的稀释度混匀，用0 0 1mp b s 稀释，至 少在室温下放3 4 小时。将湿盒从冰箱中拿出，切片放入装有0 0 1mp b s 的染缸中，换一次p b s ，1 0 分钟后再换一次p b s ，2 0 分钟后可加a + b 混合 液，总洗片时间为3 0 分钟。加a + b 混合液于切片上，在湿盒中室温下放3 4 小时或过夜。切片放入装有o 0 1mp b s 的染缸中，换一次p b s ，1 0 分钟 后再换一次p b s ，总洗片时间为3 0 分钟。 用d a b 硫酸镍胺显色液呈色，注意在进呈色液前要用蒸馏水快速过一 遍。通常在5 分钟后有少许呈色，阳性标记为深蓝色物质，边呈色边观察， 直至呈色良好为至，呈色好的标志为：阳性结果明显，背底不高。注意在出 1 0 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 呈色液时也要用蒸馏水快速过一遍，否则会有结晶出现。用p b s 洗2 遍。 可在这一步将指甲油刮掉。用5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 和1 0 0 ( 两次) 梯度酒精脱水，各2 分钟。二甲苯透明( 三次) ，各2 分钟。封 片：封片时先检查盖玻片是否干净( 可用绸布擦) ，将盖玻片置于放有一张 滤纸的载片板上，加入一滴p e r m o u n t 封片剂，将切片封上。干后在显微镜 下观察采集图象。 5 细胞表面蛋白的生物素化标记与检测 细胞接受刺激之后，用细胞外液清洗2 遍。再加入2m 1 含有0 5m g m l s u l f o - n h s l c b i o t i n ( p i e c e ) 的细胞外液4 。c 标记4 5 分钟。然后加入2 0u 1 甘氨酸( 1m ) 使终浓度为1 0m m ，继续4 孵育2 0 分钟。用2m l 冰的 p b s ( 1 3 8 m m n a c l 、2 7 m m k c i 、t 5 m m k h z p 0 4 、9 6 m m n a 2 h p 0 4 、1 m mm g c l 2 和o 1m mc a c l 2 ) 清洗细胞3 次。加入4 0 0g lr i p a ( 1 0 0m m t r i s h c l 、1 5 0m mn a c l 、1m me d t a 、1 t r i t o n x 1 0 0 、1 脱氧胆酸钠 和0 1 s d s ) 收集细胞，4 c 摇床上裂解1 小时后，1 2 0 0 0r p m 离心2 0 分 钟，取全部上清液。s t r e p t a v i d i n 连接的珠子( p i e c e ) 预先用4 。c 的r i p a 平 衡半小时，并用r i p a 清洗3 遍。在上清液中加入3 0p l 珠子，4 摇床上孵 育过夜。用8 0 0 0r p m 沉淀珠子并收集上清液，再用6 0 0g lr i p a 洗涤珠子三 次。收集珠子加入5 0 l 上样缓冲液( o 1 s d s 、4 - - 巯基乙醇和0 1 溴 酚蓝) ，在6 5 。c 水浴中处理1 5 分钟。样品用s d s p a g e 分离，w e s t e r n 印 迹后用化学发光法检验。统计时用n i hi m a g ep r o g r a m 测量蛋白条带的灰 度。 6 小鼠背根神经节总r n a 的提取与r t p g r 6 1 总r n a 的提取 开启冷冻离心机，将温度调至4 c 预冷。将电动组织匀浆器用7 5 乙醇 浸泡后，用棉花擦洗干净，再用d e p c 水冲洗干净。在5 0i i l l 离心管中预备 若干管d e p c 水，准备在匀浆不同组织的过程中清洗匀浆器。匀浆所用为高 学位论文 背根节神经元细胞表面d e l l a 阿片受体表达与调控机制的研究 压灭菌过的尖底离心管，在匀浆前先将所需的t r i z o l 量好，放于尖底离心管 中。一般每5 0 - - 1 0 0m g 组织用3m lt r i z o l 。在泡沫盒内倒满液氮，将预先 准备好的d r g 组织放于其中。在液氮中打开锡箔纸，将组织迅速移入 t r i z o l 中进行匀浆，直至组织被完全粉碎。室温( 1 5 3 0 ) 放置5 分钟。加 入三氯甲烷0 6m l ，用手剧烈振荡1 5 秒后在室温放置2 3 分钟，将匀浆液 转移至两个2i n le p 管中，转移时注意边振荡边转移。1 2 0 0 0g 离心1 5 分钟 ( 4 ) 。将上层水相转移至新的2m ie p 管中，加1 5m l 异丙醇沉淀 r n a ，摇匀。在室温放置1 0 分钟后，1 2 0 0 0g 离心l o 分钟( 4 ) ，弃去上 清，加入3m l7 5 乙醇v o r t e x 混合样品。1 2 0 0 0g 离心5 分钟( 4 ) ，弃 上清，空气中干燥r n a 沉淀，注意不要完全干。最后用1 0 0g ld e p c 无菌 水溶解r n a ( 用枪吹打) 。 6 2r t - p c r 在2 0 山的反应体系中以o l i g o d t 引物，应用s u p e r s c r i p ti ir n a s e h 逆 转录酶( i n v i t r i g e n ) ，合成e d n a 。应用下述神经激肽1 ( n k l ) 受体的引 物，以逆转录产物为模板进行p c r 分析，引物为：5 c c ca a ca g ga c tt a cg a g a a - 3 和5 一t g a t g ta g g g c a g g a g g a a - 3 。 7 数据统计与分析 所有的电生理数据由p u l s e8 3 记录，再用i g o r4 0 3 软件进行处理。 一般的数据全部在g r a p h p a dp r i s m 软件里面作图处理，用平均值标准差 ( m e a n s e m ) 表示，并根据不同的要求进行成对或组间f 检验。p 0 0 5 被认为有统计学显著差异，p 0 0 1 被认为有统计学极显著差异。 三、结果 1 不同伤害性刺激与d o r 在d r g 小神经元上的相互关系 1 2 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 本实验室以前的实验结果发现小鼠d r g 中大约5 l 的d r g 神经元是 d o r 阳性的，其中7 2 的阳性神经元是小神经元( 1 0 2 5 眦) ，大约占观 察到的小神经元的5 5 。如果用d o r 的选择性激动剂d e l t o r p h i ni ( d e l t ， b a c h e m ) 激活细胞表面的d o r ，在许多d r g 小神经元中d o r 发生重分 布，一部分d o r 往细胞表面转移。使用膜电容( c m ) 测量技术可以监测细 胞膜面积的实时变化【3 3 】，发现激动d o r 后细胞膜电容增加，这表明细胞 进行了胞吐，囊泡膜与质膜融合，在这一过程中d o r 可能插入到质膜上。 与此同时，还发现d e l t 刺激d r g 小神经元所引起的膜电容升高具有缓慢和 长时程的特点。那么，如果用辣椒素等伤害性刺激处理d r g 小神经元，结 果如何呢? 辣椒素受体v r l 是一种非选择性阳离子通道，主要表达在d r g 小神经 元2 ： 3 4 】。免疫组化实验显示v r l 表达在约4 5 的d r g 神经元上，而其中 约9 0 同时表达d o r ，不过v r l 与d o r 并不共存于同一囊泡中( f i g u r e 1 a a ) 。在辣椒素能诱发电流的d r g 小神经元中，d e l t 刺激可诱发膜电容 的升高( f i g u r e1 a b ) 。 免疫组化实验显示p 2 y 1 受体表达在约3 0 的d r g 小神经元上，而其 中约9 2 同时表达d o r ( f i g u r e1 b a ) 。p 2 y 1 受体的激动剂，2 - m e s a d p ( s i g m a ) ，可使约3 5 的d r g 小神经元发生膜电容的升高，它可 以被p 2 y 1 受体的拮抗剂m r s 2 1 7 9 ( m r s ，t o c r i s ) 完全阻断( f i g u r e1 b b b e ) 。2 - m e s a d p 诱发的膜电容升高比d e l t 刺激所诱发膜电容的升高要 弱。刚开始5 秒，两者差不多，然而2 - m e s a d p 诱发的胞吐速率在3 0 秒内 快速下降，然后逐渐从9 0 秒时1 3f f s ( 折算为3 5l d c v s ) 降到5 分钟时的 0 2f f s ( 折算为o 5l d c v s ) ( f i g u r e1b d ) 据报道，激动d r g 神经元的 p 2 y 1 受体可以导致i p 3 敏感的胞内钙库释放 3 5 】，2 - m e s a d p 诱发的膜电 容升高在无钙外液中大为降低，而i p 3 受体拮抗剂x e c 3 6 可部分阻断该膜 电容升高( f i g u r e1 b e ) 。去极化可以引起外钙内流并诱发d r g 神经元神经 肽的释放 3 7 ，3 8 1 。大部分d e l t 刺激诱发膜电容升高的神经元去极化也可以 引起明显的膜电容升高( f i g u r e1 c ) 。 1 3 学位沦文 背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 f i g u r e1 c e l l u l a rb a s i sf o rc o r r e l a t i o nb e t w e e nd o r , v r l ，p 2 y 1 - r ，a n d d e p o l a r i z a t i o ni ns m a l ld r g n e u r o n s ( a 1d o u b l e - i m m u n o f l u o r c s c e n c es h o w st h a td o r ( i nr e d ) c o l o c a l i z e sw i t hv r l ( i ng r e e n ) i nan e u r o n ( a a ) ( a b ) i nt h es a r f l en e u r o n ，d e l ti n c r e a s e sc m ，a n d c a p s a i c i ni n d u c e s a ni n w a r dc u r r e n t b a ri n d i c a t e s5p x ni n ( a a ) ( b ) t w oa d j a c e n ts e c t i o n ss t a i n e dw i t ht h ei m m u n o p e r o x i d a s em e t h o ds h o wd o r a n dp 2 y i ri nt h es a m en e u r o n ( b a ) ( b b ) p 2 y 1 - ra g o n i s t2 - m e s a d pi n d u c e s a ni n c r e a s ei nc m q u a n t i f i c a t i o ns h o w sa v e r a g e da m p l i t u d e so fc m ( b c ) a n d 1 4 学位论文背根节神经元细胞表面d e l t a 阿片受体表达与调控机制的研究 s e c r e t i o nr a t e ( b d ) m e d i a t e db yp 2 y l - r ( n = 10 ) s e c r e t i o nr a t ei sr e l a t i v e l yf a s t d u r i n gt h ef i r s t1 0sa n dr e d u c e dt ov e r yl o wl e v e l sa t5r a i n ( b e ) t h ei n c r e a s ei n c mi sb l o c k e dw i t ha n t a g o m s tm r s2 17 9 ( m r s ) ，a t t e n u a t e db yp u f f i n gc a 2 + f r e e e c s a n do n l yp a r t i a l l yb l o c k e db yx e c 1 1 l en u m b e ro ft e s t e dc e l l si si n d i c a t e d i nt h ec o l u m n “p 0 0 1a sc o m p a r e d 、i t ht h eg r o u p ( 1 ) b a ri n d i c a t e s5 岬i n ( b a ) ( f i g u r ea a ，b aa l ep r o v i d e db yd r b a ol ) ( c ) as i n g l e - p u l s ed e p o l a r i z a t i o nr a p i d l yi n c r e a s e sc m ，a n dd e l ti n c r e a s e sc mi n t h es a m en e u r o n 2 伤害性刺激与d e l t 在d r g 神经元上引起d o r 的重分布和胞内钙离