（纺织化学与染整工程专业论文）对苯二甲酸（ta）及涤纶（pet）膜的生物降解研究.pdf

摘要 摘要 对苯二甲酸( t e r e p h t h a l i ca c i d ，即t a 或t p a ) 是主要的化工原料，随着聚 酯工业的迅速发展，工业对对苯二甲酸需求急崩增加，随之t a 废弃物也大量产 生，环境受到了严重污染。为了减少污染，各种处理t a 的方法也随之产生，其 中生物处理是既方便又经济的种方法。 本实验用t a 作为微生物代谢的唯一碳源，对所选的五种菌株：z y 、f l o w e r 、h 、 f 4 l i pc 崩挂行培养驯化。测试4 2 0 h m 处培养瓶中光密度( o d 。) ，观察菌株的生 长情况，确定菌株最佳生长条件为3 0 。c ，振荡速率为1 4 0 转m i n ，菌株转接量 为l m l 。并存此条件下，研究五种菌株降解t a 的情况，同时利用双曲线模型分析 了f 4 和p 幽菌株降解t a 的动力学。 提取菌株胞内酶和胞外酶，在3 0 。c ，1 4 0 转m i n 的振荡器中，埘1 i 同浓度的 t a 降解，比较胞内酶和胞外酶的降解效果。结果表明，从z y 、f l o w e r 、h 、f 4 和 口d 疗菌株提取的胞内酶和胞外酶对t a 均有降解效果，并发现胞外酶对t a 降解起主 要作用。存用胞外酶降解t a 的动力学研究中，得出f 4 和口c 情株胞外酶的k 。较小， 而z y 、f l o w e r $ 1 ：l 1 菌株的胞外酶的k ，较大，表明f 4 和且c 疗菌株提取酶对t a 有强的 亲和力。 利用有机溶剂将涤纶长丝溶解，制成p e t 膜，这除去了涤纶长丝原有的结晶 和取向。在菌株最佳生长条件下，分别以t a 和d t p 作为共同代谢基质，研究f 4 和p c h 菌株降解p e t 膜。通过电子显微镜观察降解后膜的表丽，结果表明：通 过长期驯化的f 4 和p c h 菌株，都能使p e t 膜表面产生明显刻蚀孔洞：日存富氧 的条件下，以t a 为共代谢基质降解p e t 膜，在个月内能将p e t 膜表面刻蚀出 较大空洞。这说明了，通过长期培养驯化，我们发现了能作用p e t 的微生物。但 p e t 的微生物降解原理仍不明确，有待于进一步研究。 关键字对苯二甲酸，p e t 膜，微生物，培养，酶，生物降解 a b s t r a c t a b s t r a c t t e r e p h t h a l i ca c i d ( t a ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc h e m i c a lm a t e r i a l s a si ti s p r o d u c e di nl a r g eq u a n t i t i e sa so n eo fm o n o c a s e sf o rs y n t h e s i z i n gp e tf i b e ra n d p l a s t i ca l lo v e rt h ew o r l d ，t h ew a s t e so ft e r e p h t h a l i ea c i dh a v e b e e ns t e a d i l y i n c r e a s i n ga n dl e a d i n gt oan e wt y p eo f e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n c o n s i d e r i n gt h ef a c t ， b i o d e g r a d a t i o n o ft e r e p h t h a l i ca c i di st h eo n eo fb e s te c o n o m i c a la n du s a b l e t e c h n o l o g i e so f p u r g i n gw a s t eo f t e r e p h t h a l i ca c i d i nt h i se x p e r i m e n t ，z y 、f l o w e r 、h 、f 4a n d pc hw e r ed o m e s t i c a t e da n dc u l t i v a t e d w i t ht aa s o n l yc a r b o ns o u r c e s t h eo p t i m u md e g r a d e dc o n d i t i o n s ，i n c l u d e d t e m p e r a t u r e3 0 c ，s h a k i n gf r e q u e n c y1 4 0r m i ni nh z q - ca i rb a t ho s c i l l a t o ra n dt h e l m lo fm i c r o o r g a n i s mw a st r a n s f e r r e di n t oc u l t u r em e d i u m ，w e r ed e f i n e dt h r o u g h o b s e r v i n gg r o w t ho fs t r a i n s w i t ht h e 7 2 3 - s p e c t r o p h o t o m e t e r a t4 2 0 n m t h e d e g r a d a t i o nk i n e t i c so ft ab yf 4a n dp c hw e r er e s e a r c h e da c c o r d sw i t hm o n o d e q u a t i o n t h ev a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so ft aw a sd e g r a d e db yc r u d ee n z y m e se x t r a c t e d f r o mi n t e r i o ro re x t e r i o ro fc e l l so ff i v e s t r a i n sa tt e m p e r a t u r eo f3 0 。c ，s h a k i n g f r e q u e n c y1 4 0r m i ni nh z q ca i rb a t ho s c i l l a t o r t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt ac o u l d b ed e g r a d e db ya l lk i n d so fe n z y m e sf r o md i f f e r e n tp a r t so fc e l l s ，e s p e c i a l l ye n z y m e f r o mo fe x t e r i o ro fc e l l s b ys t u d y i n gt h ek i n e t i c so fc r u d ee n z y m e se x t r a c t e df r o m e x t e r i o ro fc e l l sd e g r a d a t i o no ft a ，t h el i t t l ek mo fc r u d ee n z y m ee x t r a c t e df r o mf 4 a n dp 曲w e r es h o w e db ym i c h a e l i s - m e n t o ne q u a t i o n t h el i t t l ek 。a n de x c e l l e n t e f f e c to fd e g l 。a d a t i o nr e f l e c t e de n z y m e sf r o mf 4a n dpc h a v eg r e a ta b i l i t yo f d e g r a d i n gt a w h e nt ao rd i e t h y l e n eg l y c o lt e r e p h t h a l a t e ( d t p ) w e r ea p p l i e dt oc o l n l n o n m e t a b o l i s m ，f 4 a n dp c hw e r eu s e dt o d e g r a d eu n c r y s t a l l i n ep o l y e t h y l e n e t e r e p h t h a i a t e 【p e t ) f i l m ，w h i c hw a sp r e p a r e db yr e s o l v i n gp e tf i b e rw i t ho r g a n i c s o l v e n t ，a tt e m p e r a t u r eo f3 0 c ，s h a k i n gf r e q u e n c y1 4 0r r a i ni nh z q ca i rb a t h o s c i l l a t o rf r o mo n em o n t ht ot h r e em o n t h s ，a n dt h e nt h es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) w a sa p p l i e dt oo b s e r v ef a c e so fp e tf i l m a sar e s u l t ，t h e r ew e r em a n y c i c a t r i c es c u l p t u r e di nf a c e so fp e tf i l m ，w h i c hw e r ed e g r a d e dw i t ht aa st h e c o m m o nm e t a b o l i s m a f t e ro n em o n t h t h e s ei n d i c a t e dt h em i c r o o r g a n i s m st h a tc o u l d a b s t r a c t d e g r a d ep e ti ns h o r t e rt i m eh a v eb e e nf o u n d d e t a i lp a t h w a yo fd e g r a d a t i o no fp e t r e m a i n st ob ec l a r i f i e db u ti n t a c tt h e o r yo fd e g r a d a t i o no fp e ts t i l ln e e dt ob e e x p l o r e d k e y w o r d st e r e p h t h a l i ca c i d ，p e tf i l m ，m i c r o o r g a n i s m ，c u l t i v a t i o n ，e n z y m e b i o d e g r a d a t i o n i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得 的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼至些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同二| 二作的同志对本研究所做的任何员献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：妫中署 签字日期：卯r 年，：月? i 口 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼王些盔堂有关保留、使h j 学位论文的规 定。特授权云湟王些盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据厍 进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。 同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：劫审霍 签字日期：1 ，。r 年i 、月一日 导师签名 獭鏖砂 签字e 期：。，年，月巩日 学位论文的主要创新点 、研究了小同菌株对t a 降解情况，结果表明实验所用的菌株经过长期培养驯 化，能在短时间内将高浓度的t a 完全降解。 、利用动力学方程分析了微生物降觯1 a 情况及微生物酶的特性，并通过降解 速率常数k ，降解半寿期及酶特征常数k 。选出了高效降解t a 的菌株。 、利用有机溶剂，在常温下溶解涤纶长丝制成p e t 膜，去除了涤纶的结晶和 取向，但没有影响聚酯分子结构，这使微生物更容易将其降解。同时利用在 膜中添加共同代谢基质的方法，诱导生物降解p e t 膜，结果表明所选菌株 能降解p e t 膜。 第章绪论 第一章绪论 1 1 t a 废弃物的产生及处理 1 1 1t a 废弃物的产生 对苯二甲酸( 简称t a 或p t a ) 是制造聚酯纤维、薄膜及瓶用聚酯的主要原料， 也用于涂料、胶粘剂、塑料薄膜、增塑剂和染料等生产行业，是一种重要的工业 化学品，这使对苯二甲酸的需求大幅度提高。在t a 生产过程中，会产生大量废水 。据报道：全球对苯二甲酸的产量将达到1 2 5 万吨，年，而每生产1 吨t a 就会产 生3 4 m 3 的t a 废水，其中t a 的含量可达1 5 0 0 m g l 2 。在国内随着化纤生产规模 1 i 断提高，废水排放量也随之增大。如：仪征化纤联合总公司，其废水排放量达 2 6 0 0 千吨年；洛阳化纤工程的废水排放量也将达到4 3 0 0 千吨年，这些废水 中污染物t a 的浓度比较高”。t a 具有毒性，对一些动物具有三致作用，被美国环 保局( e p a ) 列为需优先治理的污染物之一。许多研究都表明对笨二甲酸及其衍生 物能抑制微生物的繁殖”1 ，对鱼类有很强的刺激毒害性，剥水中微生物的再生有 强抑制作用，对一些动物有致畸和致突变作用。有效地处理废水中的t a ，一直是 令人关注的问题“，。 在t a 废水排放中主要有三类高含量t a 废水如表1 一l 表卜1t a 废水主要水质指标 参数c o d 。( m g l )b o d s ( m g i )p ht ( m g l )v f a ( m g l )月水最变 化幅度 t 生产废范附 2 5 9 1 - 1 6 0 0 01 7 6 9 - 11 3 1 03 9 l 一86 68 1 6 7 l7 8 9 8 10 35 0 3 水均值 6 3 4 34 6 2 361 61 3 4 53 3 0 聚酯生产范围 j o 3 废水均值1 6 9 0 01 1 5 0 0 45 8 9 05 7 0 碱减量( j范陇l7 8 0 2 9 2 23 0 0 1 4 7 09l o 一1 2 22 4 0 一1 2 3 08 9 一1 6 91 0 0 3 染废水均值 1 7 0 07 8 01 0 96 1 0j 4 0 注：v f 为活性污扰的稳定性 第一章绪论 1 1 2t a 废弃物的处理 由于对苯二甲酸和聚酯废水中的污染物多为芳香族化合物，而h 污染物浓度 高，废水生物需氧量( b o d ) 与化学需氧量( c o d ) 的比值只有0 1 0 2 ，因此属 于难生物降解的废水，处理难度较大。目前国内外对该废水的处理主要有：物理 化学处理法和生物化学处理法。”。 一、物理化学处珐! 在废水的预处理中由于t a 在酸性条件下溶解度降低，可先将t 废水酸化沉 降后再进行生物处理。另外由于废水中的c o d 降低到一定程度后，即使进步延 长处理时间，要再降低c o d 很难。为保证出水稳定达标，水中剩余的微量有机物 也能被去除面实现水资源回用，可在生物处理工艺之后进一步深度处理，通过活 性碳吸附、臭氧或二氧化氯氧化等物化方法进一步提高净化效率。若单独使用物 化方法处理对苯二甲酸和聚酯废水，则投资及运行费用远远高于生物处理方法， 且易造成二次污染”1 “。 二、生物化学处理 目前，生物处理法中厌氧降解是t a 废水处理中最常用的方法，但是厌氧降 解条件要求严格；好氧降解法又会产生大量剩余污泥，人们还在寻找更好的处理 力法。 ( 1 ) 生物好氧处理工艺：它的设计原理是微生物在好氧条件下代谢作用旺 盛，能利用废水中的有机物为原料进行新陈代谢，合成生命物质，同时将污染物 降解。它具有如下优点：净化效率高，b o d 去除率常为9 0 9 5 ，处理过程中 小产生臭气；技术成熟，国外从上世纪三十年代初就开始广泛研究废水的生物好 氧处理技术，国内从建国后也开始起步研究，至今已积累了丰富的设计与运行管 理经验，在几乎所有种类的废水处理工程都有应用，其管理方便，操作简单，抗 冲击能力强，在运行中如受冲击负荷影响时，在供氧基本满足的条件一f ，其结果 通常仅降低净化效率，不易使整个生物系统被破坏，而且好氧微生物驯化适应时 间短，一般仅需几周就可以完成，对环境条件要求较粗放，当水温低至1 5 。c 时。 生化反应仍能正常进行”。近年来，存普通生物好氧处理工艺基础上，又发展出 了生物纯氧处理工艺，由于纯氧处理中氧分压和氧传递速率均高出空气中氧分压 和氧传递速率4 倍多，因此氧的渗透性好，反应池中厌氧状态很少，使废水处理 效果更好、吏稳定，同时还降低了能耗，减小了占地面积和剩余污泥产量。改善 环境卫生：状况。 生物好氧处理工艺的不足之处是，能耗较高，剩余污泥产量相对较多，增加 了污泥处理设备投资及运行费用，另外对某些工业废水营养要求较高”。 ( 2 ) 生物厌氧处理工艺：这种处理技术的作用原理主要是生物在缺少氧的 第一章绪绝 条件下生长，结合酶物，对废水中r j l a 分解。其优点主要是：不需充氧，能耗低， 副产物沼气可作为燃料回用，而且剩余污溅产量低，占地面积小，对营养要求较 低，但由于厌氧条件p 微生物代谢活动较低，对废水的净化效率小如好氧处理好， 通常b o d 去除率在6 0 9 0 ，而且由于厌氧菌在有氧气存在条件下将火甚活1 哞。 另外生物厌氧处 工艺易受环境条件以段干扰物质影响，抗冲击负荷能力较著， 目微牛物驯化适廊时间要求较睫通常需要3 6 个月，并日净化l l 水水质不能达 到很高的水下，一般此丁艺用在好氧处理前的预处理“。 ( ： ) 厌氧好氧生物处理工艺：它的处理工艺是将预处理的废水经厌氧生 物处理后，其中的难降解大分子污染物分解为易降解的小分子有机物，然后再绎 好氧生物处理净化废水。它兼有厌氧和好氧两者之长，净化效率高且稳定，几f 不产生剩余污泥，抗冲击能力较强，不象好氧活性污泥法形成污泥嘭胀，导致系 统运行失败，但其基建及投资费用较多占地面积较大。 ( 4 ) 生物反应器自固定化生物反应器处理：它是在两刹t 反应器内分别有 人工控制的高效复台功能微生物，刘废水中有机物能有针对性地进行降解，微生 物在专门的填料表面形成生物膜，编成微牛态系统，从废水中吸取有机污染物作 营养源，在代谢过程中获得能量，并形成新的微生物机体。当生物膜达到一定厚 度时，氧就无法透入生物膜内层，造成内层的厌氧状态，使生物膜的附着力减弱， 在水的神刷下，生物膜脱蒋，随后填料上义会生长新的生物曦，如此循环往复， 废水经生物膜后得以净化。它除具有厌氧好氧生物处理工艺的优点外，它还特 别适合于处理含某种特殊污染物的废水，如对苯二甲酸和聚酯废水：其不足之处 是增加了深度处理，投资增加“”“1 。 1 2p e t 废弃物的产生及处理 1 2 1p e t 废弃物的产生 当前世界塑料工j m 发展迅速，其年产量已超过l 亿吨，其用途已渗透到国民 经济及人民生活的各个方面。特别是嘲料，划其价格低廉受到衙家的欢迎+ 在m 僻商品过程中大量应用。但塑料不会自行腐烂，特别是塑料地膜、垃圾袋及各种 包装材料等一次性塑料废弃物给农田、水利、城市等环境带来了白色污染，诬 破坏土壤自身的水肥及微生物平衡，对农作物生长造成不利影响。这使它成为环 保的头号大敌。特别刘草原动物和海洋生物的危害扳大，在草原f m 圈食用塑 料袋小能反刍和消化不良而死亡，许多生活存海域刑近的海豚圳为漤译塑料袋1 1 i ! _ 二能生存。 目前每天只自不到4 0 0 吨的塑剁垃圾流入回收稿利用市场，而近9 0 0 吨的塑 第一章绪论 料垃圾都被填埋处理。这些垃圾大部分是很难在自然条件下降解，填埋不仅占用 土地资源，而目一般需1 0 0 多年才能降解。导致了垃圾填埋场封场速度加快，同 时电给封场后的绿化和开发利用带来困难。面对在自然界中不能快速降解的大量 塑料垃圾，寻找快速降解又保护环境的环保型处理方式，处理聚酯废料已迫在眉 睫，为此生物降解法己成为首选”“。 随着聚酯：1 二业的迅猛发展，聚酯p e t 废料l | 益增加，国内每年已达几十万吨。 虽然这些聚酯废料本身毒性不大，不会对环境造成直接危害，但如此巨大的数量， 很难在自然条件下降勰，故对环境的污染越来越严重，因此聚酯废料的处理已成 为当前聚酯3 2 、j k 发展的重大课题“。“1 。 1 2 2p e t 废弃物的处理 p e t 废料传统的处理方法主要有三种：填埋、焚烧和回收利用”13 “。填埋的 方法操作简单，成本较低，但它占地量大，污染土壤和地下水，释放毒物，滋生 病菌等缺点。焚烧会产生许多有毒气体且费用较高。回收刹用方法主要是甩化学 方法将其降解为新的合成原料，较填埋与焚烧更科学，它不仅解决了二次污染问 题，还使资源得到了充分利用，是种理想的方法。 用化学方法将其降解为新的合成原料的处理方法已有许多科研和生产实例， 据报道：朱晶心，马彦龙等人把涤纶废料醇鳃矮合成了z 二饱和树脂；潘鑫等利用 聚酯切片生产中的酯化物废料、模头料、不合格产品，在催化剂醋酸锌存在的条 件下与多元醇及多元酸反应，重新进行酯交换及缩聚反应，加入适当的溶剂和助 剂，然后得到一定黏度的饱和聚酯漆”。再如，作为复合材料的三大基本树脂之 一的不饱和聚酯树脂( u p ) ，目前应用十分普遍，但其原料较短缺部分原料依赖 进口，为此科学家利用p e t 废料降解代替部分苯酐和二元醇，制备不饱和聚酶， 既可降低成本又可使废料得到利用，同时电减少了白色污染”：“。 对于利用微生物对p e t 废弃物进行处理的方法，目前还没有生产示例方面的 报道还处在实验阶段，这也是我们选择此课题的原因所在。 1 3 本课题研究的主要内容及意义 1 3 1 主要内容 从化纤f - 和f p 染厂的活性淤泥中提取可降解t 和p e t 废弃物的活性菌株， 并对菌株进行分离，筛选和培养，选出优势降解菌株。利用优势降解菌株对t a 生化处理，研究影响生物降解的因素，通过动力学公式分析生物降解t a 的过程， 第一章绪论 寻求最佳降解条件，探索微生物降解t a 的规律；在此基础上提取生物酶，研究 微生物酶对t a 降解动力学；利用选取的优势菌株降解p e t 膜，通过观察生物处 理前后p e t 膜表面变化情况，探索生物对p e t 膜的降解。 具体内容： ( 1 ) 降解菌的收集及培养 ( 2 ) 降解菌对t a 降解研究 ( 3 ) 生物酶的提取及应用 ( 4 ) 降解菌对p e t 膜降解 1 3 2 课题意义 随着能源的枯竭和全球环境的恶化，节约能源和环境保护成为本世纪的主 题，为此生物技术成为本世纪热门研究方向。 研究t a 的生物降解，不仅可以解决t a 废水对环境的严重污染问题，还可以 利用该方法培养驯化生物提取有用的生物酶用于其它工业生产，变废为宝。同时 还可以利用t a 驯化微生物用于p e t 的降解。 研究p e t 膜的生物降解有相当重要的意义。首先p e t 作为难生物降解的化合 物长期存在，对环境产生了极大的危害；其次p e t 纤维表面改性，通常是化学方 法，但其废液对环境污染严重。利用生物方法，寻找能水解p e t 的微生物，既解 决了环境污染，又可使废弃的p e r 充分利用，同时还可以利用生物酶改善p e t 纤 维的吸湿性、抗静电性、悬垂性、舒适性和染色性等，开发新型纺织材料，因此 微生物处理p e t 的研究很有发展前途。 第二章理论部分 2 i 生物降解的意义 第二章理论部分 微生物作为一个整体，分解有机物的能力是惊人的。大量研究表明，能够 使环境污染物降解的生物主要是微生物。微生物体秋微小，数量多，种类多， 代谢活动旺盛，代谢类型多样，具有催化污染物转化的各种酶系统。微生物无 处不在，它们栖息于土壤、沉积物、废水、圆体废弃物、地表水以及动植物体 内。它们在环境物质转化中发挥着重要作用。每一种天然产物，不管它的构象 如何复杂，都会存特定的环境中被这种或那种微生物降解。如果这些物质不被 降解，终将会在地球上大量积累，然而在现在的好氧生态系统中还没有看到天 然产物有明显的积累，这就表明微生物系统对各种天然产物具有惊人的转化作 用。一种微生物代谢有机物的能力是有限的。但在同一环境中有多种微生物同 时存在，共同代谢有机物的能力就会十分强大。可以说，凡自然界存在的有机 物，几乎都能被微生物所分解。有些种类，如葱头假单胞菌( p s e u d o m o n a s c e p a c j a ) 甚至能降解9 0 种以上的有机物，它能利用其中任何一种有机物作为 碳源和能源进行代谢。有毒的氰化物、酚类化合物等，也能被卅i 少微生物作为 营养物质利用和分解“”1 。 一个世纪以来，人工合成的有机物大量问世，如杀虫剂、除草剂、增塑剂 等，它们般在短时间内难以被微生物降解，尤其是部分合成的有机物，在研 发时的目的之一，就是要求它们具有化学稳定性，因此微生物一接触这些陌生 物质，开始时难以降解也是不足为奇。但由于微生物具有极其多样的代谢类型 和很强的变异性，近年来的研究已经发现，很多微生物能够降解人工合成的有 机物，甚至原认为不可生物降解的合成有机物，也找到了能降解它们的微生物。 所以通过研究，可以使不可降解的或难降解的污染物转变为能降解的，甚至能 使它们迅速、高效地降解除去。 2 2 生物降解与生物转化的特点 ( 1 ) 生物降解和生物转化反应迅速。环境污染物形态和结构的改变，可以 通过化学反应或生物作用来实现。通常生物作用迅速，无机物和有机物的转化 都是如此。生物在环境有机物的降解过程中起着重要作用。尽管化学反应也会 第二章理论部分 使有机污染物的结构发生变化，但这种变化通常是细微的，产物与母体化合物 存结构上和毒性上经常相似。但是生物作用则大不相同生物作用的实质是在 生物酶的催化作用下进行一系列生化反应。因为酶的催化作用反应迅速，因此 生物的作用电非常迅速，而且通常很彻底，可使许多有机物降解为剥人体无害 的c o 。和也0 等小分子。 ( 2 ) 生物降解经常与微生物生长联系在一起。生物降解过程是有机物发生 转化的过程，同时也是微生物呼吸与同化的过程。在呼吸过程中，微生物利用 有机物作为能源；在同化过程中，微生物利用有机物中的碳和呼吸产生的能量 构建细胞自身。同化作用的结果表现为微生物的生长，这样微生物叼以有更多 的酶来催化生物化学反应，从而加速污染物转化，如在活性污泥反应器中，有 机物有一部分转化为c o 。和h ：0 ，一部分转化为细胞体，表现为活性污泥数量和浓 度的增长“。 ( 3 ) 生物降解过程受各方面因素的影响很大，形成的产物变化也很大。环 境条件是指水、温度、p h 值和氧的浓度。水是微生物生长的基本条件，因此聚 合物能保持一定的湿度是其可生物降解的首要条件。每一种微生物都有其适合 生长的最佳温度，通常真菌的适宜温度为2 0 2 8 ，细菌则为2 8 3 7 。一般 来说，真菌适宜长在酸性环境中，而细菌适宜长在微碱性条件下。真菌为好氧 型的，细菌则可在有氧或无氧条件下生长。同时环境中不同的碳源、营养成分、 氧化还原电位以及不同的微生物种群也都会对生物降解过程产生影响。材料的 结构更是决定其是否可生物降解的根本因素之一，一般情况一f y t 有极性高分子 捌料才能与酶相粘附并很好地亲和，因此高分子材料具有极性是生物降解的必 要条件之一。高分子的形态、形状、分子量、氢键、取代基、分子链刚性、对 称性等均会影响其生物降解性。另外材料表面的特性对微生物降解也有影响， 粗糙表面材料比光滑表面材料更易降解。 2 3 微生物降解机理 2 3 1 有机物的微生物降解 微生物降解有机物有不同的方式。一般有两种方式，一种方式是微生物以 某一类有机化合物作为其生长的唯一碳源，有时还作为唯一的氮源。另一种方 式是通过共代谢进行降解，即微生物从某些其它化合物获得碳源和能源，转化 原来不能被利用的一些有机物，直至完全降解。诲多化合物都需要多种微生物 的一系列共代谢反应才能完全降解。”1 。 微生物对有机物的代谢是通过自身产生的酶的催化作用来完成，由于各种 第二章理论部分 微生物产生的酶不同，因此不同微生物对各种有机物的降解能力存在着很大的 差别。微生物对有机物的降解具有特异性和选择性，决定了自然环境中有机物 的生物降解大多是通过混合微生物群落来完成，即某些微生物可以利用某一种 或某一类有机物并将其转化为另一种化合物，而另一些微生物则可以利用转化 产生的中间产物作为营养，并使其进一步分解代谢，直至降解为c o ：、h ! o 及其它 的无机物为止”2 “。 2 3 2 高分子材料的微生物降解 高分子材料的生物降解通常是以化学方式进行的，即在微生物( 有酶参与) 的作用下，酶进入聚合物的活性位置并渗透至聚合物的作用点后，使聚合物发 生水解反应，从而使聚合物的大分子骨架结构发生断裂成为小的链段，并最终 断裂成稳定的小分子产物，完成降解过程。 一般高分子材料的生物降解可分为完全生物降解机理和光一生物降解机理。 完全生物降解机理大致有三种途径： 生物物理作用：由于生物细胞增长而使聚合物组分水解，电离质子化而 发生机械性的毁坏，分裂成低聚物碎片。 生物化学作用：微生物对聚合物作用而产生新物质( c 乩，c o 。和h 。0 ) 。 酶直接作用：被微生物侵蚀部分导致材料分裂或氧化崩裂。光一生物降 解机理是材料中的淀粉等生物降解剂首先被生物降解，增大表面体积比，同时， 日光、热、氧引发光敏剂等使高聚物生成氧化物，并氧化断裂，分子量下降到能 被微生物消化的水平“。 2 3 3 微生物酶的特性及作用原理 2 3 3 1 微生物酶的特性 酶是一种在生物体内具有新陈代谢催化剂作用的蛋白质。它们可以特定地 促成某个反应而它们本身却不参与反应，虽具有反应效率高、反应条件温和、 反应产物污染小、能耗低和反应易控制等特点。 酶具有高效、专一和反应条件温和的特点。它的这些特性有助于提高生产 效率，降低成本，避免不必要的副反应，简化分离提纯步骤，为有目的地开发 特定产品提供良好的途径；减少设备投资，提高安全系数；减少环境污染。 酶可以改变被作用对象的物理化学性质或赋予作用对象新的功能，如对象 的溶解性、乳化性、持水性、粘度等等。解决产品沉淀，提高原材料利用率或 提高产品的可溶性，调整产品生产过程中粘度或生产出粘度适当的产品，去除 第二章理论部分 杂质。结合适当的调控手段，酶可以改变原副材料选定部位的性质、溶解原副 材料中特定部位，也可开发特定物化特性的产品；这些作用有助予改善最终产 品的加工过程、提高产品性能和开发新的功能性产品。 酶可以有选择、有控制地通过特定方式改变对象的化学结构，这些方式包 括水解、氧化还原、裂解，合成，异构、转移基团等，使被作用对象按预定设 想发生化学反应，生产出特定产品。 2 3 3 2 微生物酶的作用原理 酶蛋白与其它蛋白质的不同之处存于酶都具有活性中心。酶可分为四级结 构：一级结构是氨基酸的排列顺序；二级结构是肽链的平面空间构象；三级结构 是肽链的立体空间构象；四级结构是肽链以非共价键相互结合成为完整的蛋白质 分子。在酶催化过程中，真正起决定作用的是酶一级结构部分，它的改变将改变 酶的性质( 失活或变性) 。酶的作用机理一般被认同的是k o s h l a n d 的“诱导契合” 学说，其主要内容是：当底物结合到酶的活性部位时，酶的构象有一个改变。催 化基团的正确定向对于催化作用是必要的，底物诱导酶蛋白构象的变化，导致催 化基团的正确定位与底物结合到酶的活性部位上去“。 第三章t a 高效降解菌的分离与培养 31 引言 第三章t a 降解菌的分离与培养 代甜是牛物体与外界物质的交换过程是活细胞进行的复杂的系列酶促反应 过程，包括同化作用和异化作刚。司化作川是生物体利用外来营养物质转化为自 身有机物的过程；异化作用则足生物机体中原有的有机物质分解并转化为环境中 的物质。经过长期的牛物代谢，生物的性状通过d n a 分子半1 ；| 留复制，将遗传信 息传递给子代。同样在长期物质交换中，生物本身的基因会产生变异，这些变异 信息血将被保留并传给子代。 在生物界中微生物是一个巨大的生物群体，本身是一个复杂的多组分系统， 每时每刻都在发生着相互独立和相互联系的变化，存在着内部控制机制。这种内 部控制机制使得微生物细胞能快速适应环境变化。在长期的运行巾，微生物能够 快速地改变自身的生物结构以适应生长环境，并晟终将这种改变特性保留下来。 本章主要是从化纤厂和印染厂等不同地方搜集活性污泥，提取微生物，并 通过分离、驯化和培养，从众多微生物中筛选出能够对t a 快速降解的微生物， 并研究牛物生长规律。找出以t 为唯一培养碳源时，微生物最佳生长条件l ”。 3 2 实验材料与仪器 3 21 菌株来源 z y 菌株 f l o w e r 菌株 h 菌株 n 菌株 口c h 菌株 3 2 2 实验仪器 3 2 2 实验仪器 印染厂碱减量泼水巾分离出的菌株 苗圃内土壤中分离的菌株 天津化纤总公司活性污泥中分离出的菌株 天津化纤总公司活性污泥中分离出的菌株以前曾用于降 解对苯二甲酸厶二酯( 简称d t p ) 实验” 白腐菌( p h a n e r o c h a e f ec h f v s o s p o r i u m ) 电光分析天下t g 3 2 8 b 生化培养箱i 。r h ln o b e 海天下仪器厂 广东医疗器械厂 第三章t a 高效降解葡的分离与培养 空气浴振荡器h z q - c 分光光度计7 2 3 3 2 3 实验药品 剥苯二| 千| 酸( 简称t a ) ( 分析纯) m g s 0 47 h 2 0 、m n s 0 4 5 h 2 0 ( 分析纯) k h 2 p 0 4 、n a 2 h p 0 4( 分析纯) n a c l ( 分析纯) h 3 8 0 3 、c u s 0 4 - 5 h 2 0( 分析纯) f e c l 3 6 h 2 0 、n h 4 c i 、z n c l 2 ( 分析纯) ( n h 4 ) 6m 0 7 0 2 4 7 h 2 0 ( 分析纯) 3 3 实验方法 3 3 1 培养基配方 微生物培养基配方见表2 1 哈尔滨东明医疗仪器厂 上海第三分析仪器厂 天津市化学试剂一厂 天津化学试剂三厂 天津市化学试剂六厂 天津市医药公司 天津化学试剂三厂 天津化学试剂六厂 天津化学试剂六厂 表2 - 1 生物培养基配方 3 3 2 培养基的配制 3 3 2 1 液体培养基的配制 1 母液的配制：按配方中的浓度的1 0 0 倍配制母液，装入广e l 瓶中备用。 2 培养基的配制：移取母液至烧杯中，所移取的母液的量为配制培养基的o0 l 倍，加入蒸馏水至所需体积。 3 分装：将培养基分装到生物培养瓶中，瓶口包上纱布( 5 层) ，再包上牛皮 纸，用皮筋扎住，以备灭菌。 第三章t a 高效降解芮的分离与培养 3 3 2 2 固体培养基的配制 在2 5 0 m l 锥形瓶中加入1 5 0 m l 培养基。然后加入3 9 琼脂。包上纱布和牛 皮纸，进行灭菌，瓶中琼脂同时被融化；灭菌完后将培养液盛入培养皿中( 保 持厚度约1 - 3 m m ) 待温度降到室温液体变冷凝固后再转入微生物。 3 3 3 灭菌与消毒 3 3 3 ，1 干热灭菌 1 包扎：将洗净的玻璃器皿( 移液管、表面皿等) 烘干，用纸包好。 2 加热：将包好的器皿置于烘箱中，1 6 0 加热2 h ，关闭烘箱等降温至 6 0 。c 以下时方可开门。灭菌后的器皿，使用时才能将纸打开。 3 3 3 2 湿热灭菌 高压蒸汽灭菌锅内压力为o 1 m p a 时，温度可达1 2 1 。我们用高压锅代替 高压蒸汽灭菌锅，从水沸腾算起，保持2 0 r a i n “。 3 。3 4 菌株的分离与培养 3 3 。4 1 菌株的采集 分别取不同来源的活性污泥或污水，悬浮于5 m l 生理盐水中( o ，9 n a c l 溶 液) ，振荡混匀。将悬浊液静置至上层液澄清，再取1 m l 澄清液至相应培养慕中 h 1 】 3 ，3 4 2 菌株的分离 菌株的分离有稀释平板分离法、涂布法、划线分离法和单细胞分离法等多 种。我们采用划线分离法中连续划线操作，此法是借助将蘸含菌悬液的接种环 存平板表面分散，经培养后得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从 而达到纯化目的。划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待甲板稍干 后方可使用，为便于划线，一般培养基刁i 宜太薄( 1 3 n 1 h 1 ) ，同时尽可能保持 培养基厚薄均匀，平板表面光滑。连续法是从平板边缘一点开始，连续作波浪 式划线直到平板的另一端为止，当中不需要灼烧接种环上的菌株”“1 。 具体操作：以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落，将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体，将接种环再次通过稍打开 皿盖的缝隙伸八平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷凉，然后从接种 有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成3 0 4 0 。， 第三章t a 高效降解菌的分离与培养 以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不能嵌入培养基内滑破培养基， 线条应平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。划线完毕 后关上皿盖，灼烧接种环，待冷凉后放置接种架上。培养皿倒置于恒温箱内培 养。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检后为纯种后 再接种“。 3 3 5 菌种的培养和驯化 将分离纯化的菌株，以对苯二甲酸( t a ) 作为唯一碳源，转移在生物培养瓶 中进行培养。驯化方式：每2 4 小时转接一次，每次对苯二甲酸( t a ) 的量逐渐 增加，使菌株进一步驯化。同时我们每2 小时测试培养瓶中o d 。胸变化，以观 察生物生长变化情况。 具体驯化步骤：准确称取一定量的t a 放入已灭菌的生物培养瓶中，然后置 空气浴振荡器中，调节温度和振荡速度。此驯化的样品记为c 1 。 c l 培养2 4 小时后，从培养瓶中转出一定量的菌株放入准备好的培养瓶中 进行二次驯化，此样品记为c 2 。依此方法连续驯化3 次后利用其降解t a 。 3 3 6 菌种的保存 我们用甘油管保存菌种。即将0 3 m l 甘油置1 5 m l 离心管中，湿热灭菌。吸 取0 6 m l 拟保存的菌液于灭菌后的甘油管中，置- 2 0 c 冷冻保存1 。 3 3 7o d 测试方法 降解液经适当稀释后在7 2 3 分光光度计上测试降解液在4 2 0 n m 处的吸光度 0 d 4 2 0 ( o p t i c a ld e n s i t y ) 又称浊度。o d 4 2 0 反映微生物的生长状况，o d 4 2 0 越高 表明降解液中微生物的数量越多。 3 4 结果与讨论 3 4 1 三次驯化后培养瓶中菌株o d 变化情况 为了观察驯化效果，我们比较了菌株在温度为3 0 c ，振荡速率为1 4 0 转 m in ，测试时间为每次培养l o 小时的条件下，培养瓶中t a 的浓度为2 0 0 m g l 。 缚次驯化后0 d 。胸变化情况如图3 一l 。 由图3 1 我们可以看出，各种菌株在一次驯化后，其0 值大都在0 1 之 第三章t a 高效降解菌的分离与培养 下，经过二次驯化后除f l o w e r 菌株，其它菌株都有较好的生长态势。这主要与 菌株本身的特性相关。三次驯化后，各菌株的o ，值都达到了0 6 以上，这表 明微生物基本上适应了以t a 为唯一碳源的环境，并能快速生长。从各菌株三次 培养后的o d 4 。值变化我们也可以看出口咖菌株适应的较快，f 4 菌株、h 菌株 和z y 菌株对t a 一直有较好的适应力。 “f rhf 4oc h 菌株冀别 图3 - 1 培养三次后各菌株生长情况 3 4 2 温度对菌株生长的影响 生物生长和进化过程中，环境的温度起着至关重要的作用，只有在适合的 温度下，生物才能生长并发挥出它拥有的特性。尤其是微生物。在其适合的温 度下能迅速生长，这对驯化高效降解t a 的菌株非常有利，为此我们在不同的温 度下对生物进行了驯化培养。同时保持振荡器转速为1 4 0 转m i n ，菌株的接种 量为l m l ，实验结果如图3 2 图3 - 6 。 由图3 2 图3 - 6 可以看出在4 0 的条件下所有菌株生长都不好，f 4 菌株 生长最差，o d 。，值几乎没有增加。这表明了所有菌株都不适合在较高温度下生 氏或较难适应高温环境。口曲菌株在经过1 5 小时培养之后，菌株数量有增多 的趋势，但与在其它温度下生长的微生物相比，菌株数量仍较少。在温度为3 0 的条件下，所有菌株的生长情况都较其它条件下好，培养瓶中的。，值基本 都能在1 5 小时时达到最大值。这表明菌株的最佳生长温度是3 0 。c 。z y 、f l o w e r 和h 菌株，在3 6 条件下较2 0 下长势好。而f 4 菌株在2 0 。c 的长势较3 6 4 c 好， n 幽菌株在2 0 、3 6 条件下长势相差不大，这可能是菌株本身性质所决定。 观察图3 - - 2 图3 - 6 的曲线整体情况，可以看到经过段