（发酵工程专业论文）d核糖的菌种选育及发酵研究.pdf

分类号 u d c学校代码! q 5 嫂 佩毒亡工誊火港 硕士学位论文 题目旦：拯蕉鲍苴盈选直丛筮醛盟究 英文题目s t u d y o n t h e b r e e d i n g a n d f e r m e n t a t i o n o f d - r 1 b o s i ? 研究生姓名( 签名)茎! 壅壁 指导教师姓名( 签名) 叁墨立 职称熬援 申请学位学科名称鬓醛工程学科代码 论文答辩日期 兰q 鱼! ：墨!学位授予日期 学院负责人( 签名) j 盏挫 评阅人姓名选莲 评阅人姓名 匿握生 2 0 0 7 年5 月2 7 日 湖北工业大学硕士学位论文 摘要 d 核糖是遗传物质核酸的组成成分，也是若干辅酶和维生素的组成部分，具 有重要的生理作用。近年来利用d 核糖生产抗癌和抗病毒药物已显示出了强大的 生命力。目前，最主要的生产方法是微生物发酵法。查考了国内外d 核糖发酵的 研究现状及进展后，本论文以b a c i l l u ss u b t i l i sh g d l 0 7 和b a c i l l u ss u b t i l i s l 0 4 为出 发菌，分别采用理化诱变( u v 、d e s ) 和基因工程的方法育种，最后获得了一株 转酮酶缺陷型基因工程菌b sp t n l 5 1 。用地衣酚显色法确定了测定d 核糖产量的 公式，并对工程菌进行发酵培养基优化和发酵条件优化，摸索出了最佳摇瓶发酵 条件。 1 以b a c i l l u s s u b t i l i s h g d l 0 7 为出发菌，采用u v 和d e s 诱变，确定了紫外线、 硫酸二乙酯的最佳诱变剂量：紫外灯2 0 w 距离3 0 c m 处照射3 0 s 。硫酸二乙酯浓度 为1 ( v v ) ，3 0 r a i n 。选育出d 一核糖产量较高的诱变株u d - 3 0 。，d 一核糖产量从 4 6 7 9 l 提高到为2 4 0 3 9 l 。 2 以b a c i l l u ss u b t i l i s1 0 4 为出发菌，采用同源重组法高效构建枯草芽孢杆菌转 酮酶( t k t ) 缺失突变菌株。以大肠杆菌质粒p b i u s k m 为框架，构建出基于枯草杆 菌( 厦卯舛) t k t 基因位点的整合载体p b t r s n 。将此载体重组到b s 1 0 4 中，从新 霉素抗性平板上挑取转化子。整合载体p b t r s n 的测序结果与k u n s t f 报道的砌 基因高度同源( 9 8 9 ) 。同源重组后，b s 1 0 4 染色体上的出基因( 2 0 0 4 b p ) 部 分与载体p b t r s n 的r i c o 基因( 1 1 9 7 b p ) 发生了同源交换，确定了该转化子为枯草 芽孢杆菌转酮酶缺失突变株( t k t ，n e o ) 。重组菌b sp t n l 5 ，1 d 核糖产量从4 8 1 9 l 提高到3 1 7 5 l 。考察了基因工程菌的传代稳定性，该菌传代5 代后d 核糖的产 量没有明显下降，表明该菌株较为稳定。 3 对基因工程菌b sp t n l 5 1 进行了培养基和发酵条件优化。培养基优化采用 了单因子组合法和正交试验法，得出最适培养基配方为( ，w v ) ：葡萄糖1 5 ( 补 料) ，玉米浆2 5 ，( n i t 4 ) 2 s 0 41 , 1 ，m n s 0 40 0 0 5 ，k h 2 p 0 40 3 ，c a c 0 31 0 ( 分消) 。 通过试验得出最适发酵条件为：仞始p h7 0 ，发酵温度3 7 ；摇床转速1 8 0 r m i n ， 接种量1 0 ，装液量3 0 0 m l 三角瓶装3 0 m l 未接种发酵液，发酵液中添加靴g m l 的新霉素，采用2 4 h 和4 8 h 分批补糖发酵，发酵6 8 h ，摇瓶最高产量为4 5 6 9 l 。 摇瓶发酵条件优化后，产核糖能力稳定在4 0 9 l 以上。 关键词：d 核糖枯草芽孢杆菌诱变育种同源重组发酵 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t d r i b o s e ，w h i c hi sa l li m p o r t a n tc o n s t i t u e n to fd n a , s o m ec o e n z y m e sa n d v i t a m i n sh a se x t e n s i v eu s a g e si nf o o d s t u f fa n dm e d i c i n ef i e l d i nr e c e n ty e a r s ，d r i b o s e ， ak i n do fr a wm a t e r i a lf o rn e wm e d i c i n e so fa n t i c a n c e ra n da n t i v i r u s ，s h o w sg r e a t p r o s p e c to fa p p l i c a t i o n t h em i c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o nw a sr e c o g n i z e dt h em o s t p r e v a l e n tw a y o fd - r i b o s ep r o d u c t i o n a i m i n ga tr e s e a r c ha c t u a l i t ya n dd e v e l o p m e n t t r e n do fd - r i b o s ef e r m e n t a t i o n i nt h i st h e s i s ，t h eb a c i l l u ss u b t i l i sh g d l 0 w a s s c r e e n e db vu va n dd e sa n dt h eb a c i l l u ss u b t i l i s l 0 4w a sc o n s t r u c t e da sa 且s u b t i l i s t k t m u t a n t ( t k t n e 0 7 ) 且印砌j 5 一j i na d d i t i o n ，t h ey i e l df o rd r i b o s ea n a l y z i n gm e t h o d o fo r c i n o lw a se s t a b l i s h e d d r i b o s eo p t i o n a lm e d i aa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si n r o t a b l eb o t t l ew e r es t u d i e d 1as h i k i m i ca c i dn u t r i t i o nm u t a n ts t r a i nw h i c hc a nb eu s e dt op r o d u c ed r i b o s e w a so b t a i n e dt h r o u g hm u t a t i n gt h eb a c i l l u ss u b t i l i sb yu l t r a v i o l e tl i g h ta n dd e si tc a n b eu s e dt op r o d u c ed r i b o s e t h eo p t i m u mm e a s u r ew a sc o n f i r m e d 3 0 si r r a d i a t i o n u n d e r3 0 c mb vu vf o r2 0 wu l t r a v i o l e tb u l ba n dd e s1 ( v v ) d i s p o s e df o r3 0m i n t h e p r o d u c t i o no fu d 一3 0 ”r o s ef r o m4 6 7 9 lt o2 4 0 3 l 2t h eb a c i l l u ss u b t i l i st k t m u t a n tw a sc o n s t r u c t e db yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n i n 且s 1 0 41 1 l ed e l i v e r yv e c t o rp b t r s nw h i c hc a nb ei n t e g r a t e di n t ot k tl o c u sw i t h i nt h e b s u b t i l i sc h r o m o s o m eb yp l a s t i do ft h ee c o l t d h 5 a l h ev e c t o rw a sr e c o m b i n e dt o 且s 1 0 4a n da n dt r a n s f o r m a n t sw a ss e l e c t e db yn e o m y c i nr e s i s t a n c em e d i u m a n dt h e d e l i v e r yv e c t o rp b t 1 s nw a si d e n t i f i e dh i 【g hi d e n t i t y ( 9 8 9 、w i t ht k tg e n eb yr e p o r t e d o fk u n s t ea n dt h ep a r to ft k th o m o l o g o u sg e n ew a se x c h a n g e db yn e og e n e t h e r e c o m b i n a n tg e n ew a sv e r i f i e db yg e n o m ep c ri d e n t i f i c a t i o n a n dv a l i d a t e da sa b s u b t i l i s ( t k t , n e 0 7 、n ep r o d u c t i o no fd f i b o s ef o rb sp t n l 5 1r o s ef r o m 4 8 1 9 l t o 3 1 7 5 9 l s t u d y i n gt h es t a b i l i t yo ft h i ss t r a i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o d u c t i o n o fd r i b o s ed i d n td e c l i n ee v i d e n t l y 3d - r i b o s ef c r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e df o r 最sp t n l 5 1 i nt h ep r o c e s so f m e d i ao p t i m i z a t i o n p r o c e s s ，t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a t o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t a ld e s i g na n ds i n g l cf a c t o rd e s i g nb o t hw e r es u i t e di nt h ee x p e r i m e n t a t i o n 1 1 i eo p t i o n a lm e d i ai so b t a i n e db yu s i n gm n f t i m e t h o d ( ，w v ) ：g l u c o s e1 5 ( b a t c h ) c o r ns t e e pl i q u o r2 5 ，( n h 4 2 s 0 41 1 ，m n s 0 40 0 0 5 ，c a c 0 3 1 0 ，n e o m y c i n ( 耻g m l ) t i l e o p t i o n a ld r i b o s ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ：s h a k i n gt a b l e1 8 0 r m i n ，p h 7 0 ，3 0 m lb r o t h v o l u m ei n3 0 0 m lt r i a n g l eb o t t l e f e r m e n t a t i o n1 0 i n o c u l a t i o nv o l u m e i no r d e rt o a v o i ds u b s t r a t ei n h i b i t i o ng l u c o s ef e e d i n gp r o c e s sw a ss t u d i e d a d d i n gg l u c o s ea f t e r 2 4 ha n d4 8 hf e r m e n t a t i o nw a se s t a b l i s h e da st h ea p p r o p r i a t em e t h o dt oi n c r e a s e d r i b o s ec o n c e n t r a t i o n a f t e rf e r m e n t6 8 h t h ec o r r e s p o n d i n gd r i b o s ey i e l di s 4 5 6 l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so p t i m i z e d ，t h ep r o d u c t i o no fd r i b o s es t a b i l i z e da t 4 0 l i i l 湖北工业大学硕士学位论文 k e y w o r d s ：d r i b o s e ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，b r e e d i n g ，h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ， f e r m e n t a t i o n i l i 佩1 l 亡工甍失洛 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：至；墨压 日期：0 7 年o 月护6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：鹳芸裔 日期：0 7 年0 6 。6 日 指导教师签名：象忍弓 日期：0 7 年o 月o 日 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 课题背景 第1 章引言 d 核糖在食品、医药等领域应用广泛，尤其是近年来随着抗肿瘤、抗病毒等 药物的研究和开发，d 核糖显示出了越来越大的生命力，利用发酵法生产d 核糖 的研究越来越倍受关注。近几十年来，国内外学者“4 ”叫对d 核糖的生产展开了 深入的研究，取得了一定的进展。但是，我国发酵法生产d 核糖研究和工业化生 产的整体水平还不高。因此，选育d 核糖高产菌株并优化发酵条件对提高d 核糖 生产水平，具有重要意义。 1 1 1 d 一核糖的理化- | 生质 d 核糖又称为异性树胶糖、d 呋喃核糖或d ( ) 胞核糖，分子式为c s h ，0 0 5 ，分 子量为1 5 0 1 3 ，属于醛糖的种，英文名称为d r i b o s e 。最早由k o s s e l a 于1 8 9 1 年从酵母r n a 水解液中鉴定出d 核糖，结构式如图1 1 所示。 囝11 1 1 一核培结构式 d 核糖纯品为白色结晶粉末，微有香气，极易吸潮，溶于水和甲醇，微溶于 乙醇，不溶于乙醚、丙酮和氯仿，熔点为8 6 8 76 c ，【a 】d 2 0 - - 2 0 土1 0 ( 1 2 = 1 0 ，于 水中) 。由于核糖分子中具有手性碳原子，因而它具有光学异构现象，即具有d - 型和i ，型两种构型，自然界中以d 一核糖为主要存在形式“”。 1 1 2d 一核糖的应用 1 1 2 1d - 核糖在食品行业的应用 在食品工业中，d 一核糖可用于生产核苷酸类风味物质增强剂，如5 。肌苷酸， 5 鸟苷酸等。这些物质与一般风味增强剂相比，增昧效果明显提高。如：1 的5 肌苷酸和9 9 谷氨酸钠组成的味精，具有鸡汤鲜味：1 的5 。肌苷酸，1 的5 鸟 湖北工业大学硕士学位论文 苷酸和9 8 谷氨酸钠组成的味精，具有香菇鲜味。另外，d 核糖还町作为原料合 成多种食用香精，用于冰淇淋、蛋糕、果酱、巧克力等食品中”“”1 。近年来，核 糖的保健功能受到重视，江西诚志股份有限公司己开发出了力博士( d 一核糖冲剂) 3 等功能饮料。 1 1 2 2d 一核糖在生化行业的应用 d 核糖在生化行业有着广泛的应用，其中应用最广的是半合成法生产核黄素。 核黄素在生物代谢过程中起着传递氢的作用，它能与机体a t p 作用生成黄素单核 苷酸( f m n ) 和黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) ，这两种核苷酸都是多种脱氢酶的辅酶。 核黄素可应用于医药工业，它能够治疗和预防恶性贫血、神经性疾患和皮肤病， 如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎、脂溢性皮炎和阴囊炎等。核黄素还可作为食 品和动物饲料的添加剂，在食品工业和畜牧业中也有着广泛的应用。 d 核糖还可用来合成类固醇、前列腺素、维生素d 结构类似物及修饰性芳香 族氨基酸的原料一双环己烷“”。d 核糖还可用来制备核酸，将硅烷化的d 一核糖与 6 一氮鸟嘌呤在三甲基硅烷存在下进行聚合反应，然后置于8 0 的乙腈中得到硅烷 化的核酸，再经甲醇反硅烷化反应，然后层析即得纯的核酸。 维生素c 类物质可以增强人体免疫系统的活力，d 一核糖可以增强维生素c 类 物质的活力“。由于d 一核糖所具有的分子结构比较特殊，因此可用来合成一些具 有特殊空问结构的药物前体物。一些二帖类物质，如红豆杉醇或p a c l i t a x e l 是卵巢 癌化疗的必需药品，可以利用d 核糖来合成“。 软海绵素是一种强效抗癌药物，l o f l g k g 的剂量可用于治疗大鼠黑素瘤和白血 病。但这种海洋大环内脂聚酯很难从自然资源中获得，利用d 核糖的同源手性五 元环，可以合成软海绵素的骨架。 1 1 2 3d - 核糖在医药行业的应用 d 核糖具有一定的医疗作用，如用于治疗因心脏机能不全而引起的身体虚弱 等病症和因器官移植引起的器官机能衰退等。d 核糖还可用于治疗因运动而引起 的肌肉酸痛，因肌腺苷脱氢酶缺失而引起的僵硬，以及因细胞内缺乏磷酸化酶而 引起的肌肉疼痛等症状。d 核糖与淀粉水解物以一定的比例混合，可制成利于伤 口愈合的药物，此药物还可治疗褥疮溃疡“。目前，以d 核糖为原料可制备成多 种抗病毒、抗肿瘤药物，如三氮哗酸苷，氟铁龙、司他呋定、齐多夫定等。 在临床上，d 核糖经常作为辅助药物使用。d 核糖在治疗心脏局部缺血方面 很有疗效。研究表明“，拌刀豆球蛋白a 、d 核糖及腺苷三者联合使用，可以增 强心脏高磷酸能量储存的机能。研究还表明“”，5 鸟苷酸拌刀豆球蛋白a 、d 核 2 湖北工业大学硕士学位论文 糖及腺苷三者联合使用j 使冰冻保藏的人鼠心脏复苏。以大鼠为实验材料进行的 肌梗塞治疗的实验表明“：在使用乳清酸治疗时，如果附加一定的d - 核糖，心肌好 氧会有明显的改善。 核糖的最大优点是它通过影响代谢而起作用，又是天然物质，当人们关心心 脏和循环系统的功能时可考虑使用核糖。核糖与其他治疗心血管疾病的药物联合 用药，如钙通道阻滞剂维拉帕米( v e r a p a m i l ) 、8 - 受体阻滞剂莫普洛尔( m o t o p r o l 0 1 ) 不会相互干扰“。 1 1 30 - 核糖的生产方法 目前，d 核糖的生产方法主要有三种：1 水解法：从天然物质中分离，即提取 核酸，然后经酸水解后提取核糖。此方法收率低、成本高，不适于大规模工业化 生产。2 化学合成法：从六十年代起，采用l 广阿拉伯糖、葡萄糖酸、葡萄糖、l - 谷氨酸、d 木糖等原料通过异构化、电解等反应，化学合成核糖的方法逐渐盛行， 并实现了工业化。但这些方法存在着工艺复杂、原料价格高、有副产物产生、收 率低、环境污染严重等不足之处。3 微生物发酵法：以转酮酶( 咖缺陷型的枯草 芽孢杆菌作为生产菌种，以葡萄糖等为原料，在合适的工艺条件下，将葡萄糖转 化为核糖。微生物发酵法生产d 一核糖是目前最经济有效，环境污染最小的一种方 法。但如何进一步降低成本，提高收率，是发酵法亟待解决的问题。随着发酵法 生产d 核糖工艺的逐渐成熟，d 核糖的生产成本将会不断的降低，d 核糖的应用 将会有进一步的发展。 1 1 4d - 核糖的生物合成及相关代谢途径 d 一核糖生物合成途径的生化反应及各种酶已由j c o o p e r 等”于1 9 5 8 年鉴定完 成。其生物合成途径：d 葡萄糖分子经过磷酸戊糖途径( h m p ) 的氧化阶段，通 过几步氧化反应生成d 核酮糖一5 磷酸。其中，d 核酮糖5 。磷酸发生结构变化形 成d 核糖5 磷酸和d 木酮糖5 磷酸。正常情况下，它们在转酮酶、转醛酶的作用 下生成色氨酸、苯丙氨酸、辅酶q 等代谢产物，不能累积核糖。当转酮酶失活时， d 一核糖一5 磷酸代谢受阻，在胞外生成核糖( 如图1 2 ) 。通常以枯草芽孢杆菌或短 小枵菌通过诱变育种的方法获得转酮酶缺陷型菌株，从而累积核糖。 湖北工业大学硕士学位论文 9 筒莓糖d 一箍甜醢 f t s甓储陵落舅 p + 稿麓- - t - 辟簟加颤擘醵麓 姒玮粥群蕞 i i r _ 由环 拜收俸搠 0 t 稿氟酸 l ，幕丙氟鼬 芳番废雏氆蠢 啪 砷靛 图1 2 核糖的生物合成途径 从d 一核糖生物合成途径图中可以看出，要使生物体积累d 核糖，必须使d 核糖一5 磷酸以下的代谢发生阻断，使d 核糖5 磷酸积累，进而脱去磷酸形成d 核糖。有两种酶缺失可以达到这一效果，一种是催化5 磷酸核糖与5 磷酸木酮糖 反应生成7 磷酸景天庆酮糖的转酮酶，另一种是催化5 磷酸核酮糖异构化为5 磷 酸木酮糖的5 一磷酸核酮糖3 差相异构酶，或者两种酶都缺失。 1 2 国内外发酵法产d 一核糖的研究进展 1 2 1 菌种选育 d 一核糖高产菌株应具备的特征： 1 转酮酶活性丧失。此为d 核糖产生菌必备的基本特征，该酶活性丧失使5 一磷酸一d 一核糖代谢受阻，大量累积核糖； 2 具有较高的葡萄糖脱氢酶或葡萄糖酸激酶活性。这是由于d 核糖合成过程 中需要两个关键酶，即葡萄糖脱氢酶和葡萄糖酸激酶。葡萄糖酸激酶活力不足， 在菌体内会累积葡萄糖酸，不利于核糖的累积； 4 湖北工业大学硕士学位论文 3 芽孢形成能力丧失。这是由于d 核糖产生菌分泌出大量的核糖，消耗了大 量的碳源和能源，不能形成芽孢： 4 耐高浓度d 一核糖。在发酵后期，核糖产生菌因分泌出大量的核糖，会产生 反馈抑制作用。高产d 核糖的菌株应具备耐受高浓度d 核糖的能力。 野生菌株： 早在1 9 5 1 年，s i m o n a r t 和g o d i n 矧在短密青霉菌的培养液中观察到了d 核糖的 累积。 1 9 6 3 年，s u z u k i 等。”报道，在较高浓度m n 2 + 、f c 2 + 、z n 2 + 等金属离子存在下， 某种细菌可由葡萄糖发酵生成约5 m g m l 的核糖，若不添加这些金属离子时，就不 能累积核糖。该报道表明，d 核糖的合成可能与某些金属离子浓度有关。1 9 8 1 年， 味之素公司利用棒杆菌a j l l 5 5 3 为菌种，在含葡萄糖、( n h 4 ) 2 s 0 4 、维生素及微量 元素的培养基中，3 4 通风培养1 2 0h ，发酵液中可积累8 9 l 的核糖。1 9 6 6 年，s a i t o 和f u k u h a r a 等。4 1 在以葡萄糖为碳源的培养基中，发酵培养食爬虫假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s ，r e p t i l i v o l a ) ，结果生成积累了7 2 m g m l 的核糖。我国从上世纪9 0 年代才开始发酵法生产d 核糖的研究，关于野生菌株产d 核糖的研究，国内还未见 文献报道。 突变菌株： 最早i 扫s a s a j i m a 等人“1 报道以枯草杆菌为出发菌，通过紫外线诱变，筛选出莽 草酸缺陷型菌株，可以积累3 5 m g m l 的核糖。7 0 年代初，为了深入地研究转酮酶缺 失与核糖生产之问的关系，s a s a j i m a 等人用紫外线，化学诱变剂处理t l ( t 缺陷型枯 草芽孢菌，获得d 葡萄糖脱氢酶活力高，无芽孢生成的突变株，其d 核糖产量为 7 2 。3 9 l 。1 9 8 9 年，k i s h i m o t o 。”等以短小芽孢杆菌( b a c t c r i u mp u n i l u s ) 为出发株，诱 变获得转酮酶突变株a t c c 2 1 9 5 1 ，d 核糖产量为9 2 1m g m l 。1 9 9 5 年，s a s a j i m a 报道了从具有转酮酶缺陷和高活性的葡萄糖酸激酶的枯草芽孢杆菌的突变株中筛 选到了耐高浓度d 核糖的突变株，经酶活测定，得知这两株菌的葡萄糖脱氢酶和葡 萄糖酸激酶的活性比亲株分别提高了2 倍和1 0 倍。2 0 0 4 年。y o n gc h e o lp a r k 等人1 以枯草芽孢杆菌为出发菌，通过n t g 诱变所得的一株转酮酶缺陷突变株 j y i ( k c c m l 0 4 0 7 ) ，利用分批补料发酵法，优化发酵条件核糖累积达4 6 6 9 l 。 我国对d 核糖研究起步较晚，在上世纪九十年代初才开始发酵法生产d 核糖的 研究。菌种的筛选一般采用选育转酮酶缺陷菌株，通常选用紫外和化学复合诱变等 方法，近年来已取得了较大的进展。天津科技大学的王树庆等人。7 1 以短小芽孢杆菌 为出发株，经硫酸二乙酯和紫外诱变，获得一株莽草酸营养缺陷型突变株t j r l 0 1 ， 该菌株遗传性状稳定，摇瓶发酵产核糖为3 9 9 ，l 。山西省生物研究所的王慕华等人 5 湖北工业大学硕士学位论文 。“以枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s b 9 4 1 ) 为出发菌株，采用紫外诱变原生质体的方 法，获得了4 株在含有6 o 的d 核糖培养基上生长的d 一核糖高产菌株，其摇瓶发酵 产核糖达5 5 0 9 l 左右，且产糖稳定，有望工业化生产。山东省食品发酵工程重点 实验室的赵祥颖等人从一株枯草芽孢杆菌出发，通过紫外线照射和硫酸二乙酯等 诱变剂处理选育得到一株莽草酸营养缺陷型菌株，产d - 核糖5 6 5 9 l ，经条件优化后 核糖产率最高可达8 0 9 l 以上。江苏省微生物研究所。0 3 选育到一株枯草芽孢杆菌的 莽草酸营养缺陷型突变株j s i m 1 0 1 8 ，以此菌株为出发菌株，通过甲基磺酸乙酯和 紫外线连续、间断诱变处理，获得了一株次黄嘌呤、莽草酸双重营养缺陷型突变株 n o 2 7 1 菌株。菌种筛选所选用培养基为：完全培养基( ) ：葡萄糖0 5 、蛋白胨1 0 、 酵母膏0 2 、n a c l0 2 、琼脂2 0 ，p h 7 2 。基本培养基( ) ：葡萄糖1 0 、( u r n ) 2 s 0 40 4 、 k z h p 0 41 4 、k h 2 p 0 40 6 、m g s 0 40 0 2 、生物素0 o 0 0 4 、琼脂2 0 ，p h 7 2 。补充 培养基：基本培养基中加入次黄噪岭5 0 z g m l 或莽草酸l o o g g m l ，p n 7 2 。该突变 株摇瓶发酵的d 核糖平均产量为1 0 8 1 9 l 。在3 0 0 0 0l 发酵罐中连续5 罐，平均产d 核糖9 6 4 9 l ，最高为9 8 2 9 l 。此产量达到了国际先进水平。 基因工程菌： 诱变育种的方法工作量庞大，具有很大的盲目性，当产量达到一定极限后很 难再提高，而且不能把菌株中的优良性状结合起来。基因克隆技术是2 0 世纪7 0 年 代在遗传学、生物化学和分子生物学等基础学科上发展起来的新型育种技术，通 过体夕 - d n a 重组和转基因技术，定向地改造生物。这将是微生物育种的一个发展 趋势。m i y a g a w a 。”等通过克隆葡萄糖操纵子构建d 一核糖工程菌。首先用限制性内 切酶e c o r l 处理的噬菌体z a p 感染大肠杆菌b i n ，用标记核酸探针进行杂交，获得了 具有商葡萄糖酸激酶活性的核糖生产菌b a c i l l u ss u b t i l i s ( p g l s 4 ) ，该工程菌可积累 核糖6 2 m g m l ，原亲株积累3 9m e d m l 而通过同源重组法，以枯草芽孢杆菌野生 菌构建转酮酶缺失突变株，目前国内外未见文献报道。 1 2 2 发酵进展 在d 核糖的发酵生产中，仅仅选育优良的突变株和工程菌还是不够的，只能说 明它具有了获得d 一核糖高产的潜能。若要实现高产，还需要控制适当的发酵条件， 包括种子培养基、种龄、接种量、发酵培养基、发酵温度、口h 、通风等条件。 早在上世纪5 0 年代，国外就丌始了发酵法生产d 一核糖的研究。目前，同本企业的 d 一核糖的发酵生产水平己超过1 0 0 9 l ，处于世界领先水平。k i s h i m o t o 等利用突变 株a t c c 2 1 9 5 1 ，在含3 t g m l 色氨酸、1 0 , u g m l 酪氨酸的山梨醇培养基上，3 6 通 风培养2 4 h 后，再转到含葡萄糖，玉米浆和适量盐类的培养基中，3 8 。c 连续培养5 5 6 湖北工业大学硕士学位论文 h ，可积累9 2 1m g m l 的核糖。韩国首尔大学的y o n g c h e o lp a r k 等采用的种子培养 基为( ) ：酵母膏1 0 、k h 2 p 0 4 0 5 、k e h p 0 4 0 5 、m g s 0 4 7 4 2 00 1 、葡萄糖1 0 ，5 0 0 m l 三角瓶装液2 0 0 m l ，3 7 ，2 5 0 r m i n 摇床振荡培养。发酵条件：3 7 l 发酵罐装液1 l ， 3 7 ，6 0 0r r a i n ，p h6 8 0 _ + 0 1 9 。发酵培养基初始糖为2 0 9 ，l 木糖和2 0 9 l 葡萄糖。 发酵2 2 h 后，将2 0 0 9 l * 糖和5 0 9 l 葡萄糖混合液以7 。4 m l h 辛 , 料，。最终彳导到m 核糖 浓度为4 6 6 9 l ，产率为0 8 8 酮h ，相当于用简单分批发酵方法的1 2 2 0 倍。 国内发酵法生产d 核糖的研究起步较晚，天津科技大学王树庆等人通过正交 实验确定了最佳发酵条件，发酵培养基配方为：葡萄糖1 4 、玉米浆2 o 2 5 、 ( n m h s 0 4o 5 、c a c 0 32 、p h 7 0 及适量酵母粉，发酵培养基的装液量为4 0 m 1 5 0 0 m l 一= 角瓶，用往复式摇床，3 8 发酵7 2 h 。摇瓶发酵核糖产量为3 9 9 l 。于 志萍等人【3 2 】在d 核糖发酵过程中，固定了不同的溶氧浓度( d o t ) ，通过发酵参 数来探讨氧化代谢途径及溶氧浓度对核糖产量的影响机制，在此基础上提出了分 阶段供氧模式。即发酵0 1 0 h 控制较低d o t ( 6 0 ) ，1 0 h 至发酵结束( 4 4 h ) ，提 高d o t 到8 0 。优化后，核糖的产量和细胞的生成量分别提高了5 0 和1 8 8 ，核 糖产量达6 3 1 9 l 。顾晓波等人m 3 研究了金属离子m n 2 + 、f e “、z n 2 + 对枯草芽孢杆菌 转酮酶缺失突变株d 核糖合成的影响。实验表明，f c 2 + 和z n “对d 核糖的生物合成 无显著影响，只在较高浓度下才对核糖的合成稍有抑制。m n “浓度为0 6 m m o l l ， d 一核糖产量最高，过高和过低的浓度均使d 核糖的合成受到抑制。赵丽丽m j 等人 研究了不同的添加物对核糖产量的影响。由于d 核糖的合成为h m p 途径，以d 葡萄 糖酸为碳源发酵时，可以增加d 核糖的产量，当采用葡萄糖与葡萄糖酸钠比例为1 ：1 时，核糖产量最高达6 4 3 9 l 。由于葡萄糖脱氢酶是d 一核糖生物合成的一种限制酶， 且m n “又是d - 葡萄糖脱氢酶的激活剂，实验证明：m n “为0 0 0 5 ，核糖的产量最高。 此外，芳香族氨基酸中的酪氨酸，有机酸中的山梨酸能明显促进菌体的生长，并促进 d 一核糖的生成。 山西省生物研究所谢红、王慕华等人o ”将发酵培养基进行优化( 葡萄糖1 8 o 、 玉米浆2 7 、( n i - h ) 2 s 0 4 0 7 、c a c 0 3 2 0 、m n s 0 4 4 h 2 0 0 0 0 5 ) ，摇瓶发酵 7 2 d 时，产d 一核糖为4 8 9 9 l 。在3 0 l 的中试发酵罐采用此培养基发酵6 8 d 时，d 核糖产量高达6 0 9 9 l ，为工业化生产核糖奠定了基础。 江苏省微生物研究所在d 核糖生产中其工艺条件为：种子培养基( ) ，葡萄糖 2 o ，玉米浆2 0 ，k 2 i t p 0 40 3 ，k h 2 p 0 40 1 ，p h7 0 ，种子罐为不锈钢标准型罐，转 速3 0 0r m i n ，容积3 0 0 0 l ，装液量2 1 0 0l ，培养温度3 6 。c 。发酵培养基( ) ，葡萄糖 2 0 ，玉米浆2 5 ，m h 4 ) 2 s 0 40 5 ，m n s 0 40 0 0 5 ，c a c 0 32 ，p h 7 0 ，发酵罐为不锈钢 标准型罐，转速1 8 0r r a i n ，容积3 0 0 0 0 l ，装液量2 1 0 0 0l ，发酵温度3 8 ，d 核糖最高 7 湖北工业大学硕士学位论文 产量j , 盘9 8 2 9 l 。 江西诚志生物工程有限公司高润香等人脚1 优化了d 核糖发酵的调控方法，主 要以控制溶氧、p h 值为主线，以控制菌体的生长量、底物消耗速率及产物生成速 率等关键变量为主要内容，采用流加补糖发酵的方法，5 0 0 0 l 发酵罐的发酵结果表 明。d 核糖产糖水平提高2 0 以上，发酵周期缩短至4 2 5 0 h ，并获得专利。该公 司的d 核糖生产能力己达n 5 0 u 屯年，在今后几年内将把d 核糖的规模扩大n 3 5 0 吨y 年。 从上述发酵工艺中可以得出：葡萄糖是d 核糖发酵生产中最适合的碳源，硫 酸铵是最适合的氮源，硫酸锰是最适合的无机盐。此外，选育的营养缺陷型菌株， 其自身不能合成某些氨基酸，培养基中必需适量添加，才能保证菌株的正常生长。 在d 核糖发酵代谢控制过程中，溶氧、p h 和补料均为重要的参数，尤其适时 添加碳源，不仅可缓解葡萄糖代谢阻遏效应，在发酵后期还可以减少残糖的含量， 提高核糖的提取率，降低生产成本。 1 2 3 分析方法 d 核糖定量分析法主要为苔黑酚法”( 又称：地衣酚法) ，即在浓盐酸作用下， 戊糖脱水形成糠醛，糠醛能与地衣酚( 苔黑酚) 反应，生成蓝绿色物质，其颜色深浅 程度与戊糖含量关系服从吸收定律。天津科技大学的魏少军“”等人通过单因素实 验确定了该法测定d 核糖的最佳条件：发酵液高速离心后，取上清液适当稀释后使 d - 核糖含量在3 毗g 9 毗g 3 m l 加入0 1 f e c l 3 浓盐酸溶液和0 3 r o l l 地衣酚溶液， 沸水浴4 0 m i n 显色，室温冷却，每隔1 0 m i n 在6 7 0 r i m 下测吸光值，然后与标准品对照。 此方法快速简便，较为准确。河北工业大学的吴朝亮等人以问苯三酚替代苔黑酚 深入研究发酵液中d 核糖测定的影响因素和规律，也取得了满意的效果，与苔黑 酚法相比，平均误差减小了0 4 3 。”。定性测定方法主要有纸层析法、高效液相色 谱法等，但这些方法，不太精确或步骤烦琐，目前并无广泛应用。 1 3 论文的立题依据 诱变育种是一种常见、有一定效果的育种方法，文献报道的国内外学者基本 上均采用诱变的方法进行d 核糖菌株选育。上世纪7 0 年代以来，随着遗传学和分 子生物学等学科不断发展，各国科学家们开始利用基因工程的原理来构建各种工 程菌。本论文根据磷酸戊糖代谢途径，以微生物代谢调控理论为指导，以不同的 育种手段( 诱变育种和基因工程育种) 在细胞尺度和分子尺度上进行育种试验。 8 湖北工业大学硕士学位论文 摸索提高d 一核糖产量的菌种选育方法，为今后利用代谢- 程方法生产d ，饮糖提供 实验依据。 1 4 课题来源 湖北省工业微生物重点实验室开放基金( n 0 2 0 0 4 0 4 0 5 ) 1 5 本文研究内容及创新点 本论文主要采用基因同源重组法构建d 核糖转酮酶缺失突变株，目前国内外 未见文献报道，此法为本论文的创新点。发酵研究确定最适发酵培养基及发酵条 件，考察了工程菌稳定性能。具体内容如下： 1 5 1 菌种选育 1 考察出发菌的生长性能，确定最适诱变剂量： 2 通过诱变( 物理诱变、化学诱变) ，采用淘汰野生型方法获得转酮酶缺陷突变 菌株； 3 运用基因同源重组法构建d 核糖工程菌。 4 基因工程菌稳定性研究： 对工程菌多次传代后，发酵试验，考察其稳定性。 1 5 2 基因工程菌的发酵研究 1d 核糖发酵培养基优化： 确定d 核糖发酵培养基最适碳源、氮源、无机盐、生长因子以及添加物( 新霉 素) 等影响。 2d 核糖最适发酵条件优化： 发酵温度、摇床转速、p h 、接种量、装液量、发酵时间等。 9 湖北工业大学硕士学位论文 第2 章d 一核糖的诱变育种 2 。1 诱变育种机理 微生物在自然条件下变异的几率较低，工业化生产中所用的菌种绝大多数需 要经过诱变育种，将其改造成“有缺陷”的突变高产菌株。为了提高其变异频率， 可采用物理或化学因素促进诱发突变。基于其代谢途径，通过诱变的方法育种是 目前国内外提高菌种产量和性能的主要手段。 “淘汰野生型”在诱变育种实验中是一种有效的选育方法。出发菌株经过诱 变后，具有合成营养物质能力突变的菌株所占比例很小，需要淘汰野生型细胞以 达到“浓缩”缺陷型的目的。细菌诱变育种实验中，可采用抗生素( 如青霉素) 法。由于野生型在基本培养基中生长，而缺陷型不能。将诱变处理液在基本培养 基培养让野生型生长，处于活化状态，缺陷型不生长，处于休眠状念。由于g + 细 菌对抗生素敏感，相应的加入一定量的抗生素，活化状念的野生型被杀死，保存 了缺陷型“。 诱变育种应注意以下三点： 1 选择简单有效的诱变剂 诱变剂的种类很多。在物理因素中，有非电离辐射类的紫外线、激光以及能 引起电离辐射的x 射线、y 射线和快中子等。化学诱变剂的种类极多，主要有烷 化剂、碱基类似物和丫啶类化合物。在选择诱变剂时，在同样效果下，应选用最 便捷的因素，而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在选择合适诱变 剂的基础上，还要设计一套有效的诱变筛选方案。 2 务必获得单孢子悬浮液 在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬浮液。这是由于分散 的细胞子能够均匀的接触诱变剂，提高诱变效果。另一方面又避免诱变后长出不 纯菌落。 3 中间培养 菌株在发生突变之前有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程 ( 生理延迟) ，需三代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。此方法为以后的筛选 和获得稳定菌株极为重要。具体方法是诱变后在液体培养基上培养2 3 小时后涂 平皿。 l o 湖北工业大学硕士学位论文 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质的能力，必须在其 基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的突变菌。营养缺陷型菌株的筛 选是目前工业微生物育种中的一种重要方法。筛选营养缺陷型一般包括以下四步： 诱变、淘汰野生型、检出缺陷型和确定生长图谱。 2 2 材料 2 2 1 菌种 出发菌株：枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i sh g d l 0 7 ) 湖北工业大学生物工程 学院实验室