动物基因工程课件.ppt

第七章动物基因工程,第一节基因工程概述,基因工程(Geneticengineering)是一种DNA重组技术，它是在分子水平上进行的遗传操作，即把供体细胞中的基因或基因组提取出来，按照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必须与载体DNA重组后才能实现转移，所以基因工程也叫做重组DNA技术。基因工程的基本操作程序包括：(1)目的基因的分离或合成；(2)用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子；(3)把重组DNA分子引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因得以表达；（4）转化体细胞的扩增；（5）重组体细胞的鉴定与筛选。,基因克隆示意图,第二节工具酶,常用的工具酶,限制性核酸内切酶细菌限制修饰体系限制性核酸内切酶甲基化酶识别特异的位点酶切位点回文结构46bp出现两种末端粘性末端粘端平头末端平端配伍末端,二、DNA聚合酶,（一）DNA聚合酶I(全酶)(E.coliDNAPolymease)（二）K1enow片段(E.co1i)（三）T4DNA聚合酶(T4噬茵体感染的Eco1i)（四）TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)（五）逆转录酶（reversetranscriptase）（六）末端转移酶,三、DNA连接酶,在大肠杆菌和动物细胞中都发现了DNA连接酶，这种酶能够催化DNA中相邻的3一OH和5一磷酸基末端之间形成磷酸二酯键。连接反应的最适温度是37，但在此温度下粘性末端之间氢键结合很不稳定。实验表明，15对于连接反应和粘性末端氢键结合的稳定性都是合适的。四、甲基化酶细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase)米完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。真核生物中目前只发现5甲基胞嘧啶(M5C)。,五、核酸酶,（一）核酸酶S1(NucleaseS1)核酸酶S1主要用于：(1)分析DNA：RNA杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位。(2)切除DNA片段上的单链末端，形成平末端。(3)切开cDNA合成过程中形成的发夹环。(4)在限制酶位点上产生小缺失。(二)核酸外切酶III（三）核酸外切酶VII（四）DNA酶I（五）RNA酶A(牛胰)（六）RNA酶TI（七）RNA酶H,第三节基因工程的载体（Vector）,到目前为止，用于基因工程的载体有8类：细菌质粒载体；包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体。噬菌体衍生载体。柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由质粒和A噬菌体cos尾巴构建的复合载体。噬菌体M13衍生载体一类专门用于Sanger法测序的载体。Phag9m5d载体：一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体。酵母质粒载体：由酵母2u质粒构建的酵母基因工程载体。真核病毒载体：包括动物病毒、植物病毒衍生载体。杆状病毒和Bacmid载体；,作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点：,作为基因工程的载体它们都具备以下一些共同的基本特点：在宿主细胞中能独立自主地复制。表达载体含有强启动于，能驱动靶基因在宿主细胞中表达。容易从宿主细胞中分离纯化。载体DNA基因组中有一段不影响它们复制的非必需区域，插在其中的靶片段能被动地跟着载体DNA一起复制，就像载体的正常成分一样。,一、质粒载体(plasmidvector),（1）质粒的一般性质1质粒的概念质粒是细菌细胞染色体外存在于细胞质中能进行自我复制的一类小型DNA分子，大部分质粒为双链环状。2质粒的大小3质粒的拷贝数4质粒的不亲和性5质粒的宿主范围,质粒存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒1.拷贝数多;2.两三个抗药性基因terrampr筛选标志3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）,（二）噬菌体载体(Phagevector),噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较清楚，并能在细菌中大量繁殖，所以成为广泛采用的载体。噬菌体还有一大优点，即使它的DNA丢失25仍不失活，这部分丢失的空档正好可以装载外源DNA。与质粒载体相比，噬菌体作为载体可以克隆更大一些的DNA片段，欲构件一个基因文库，往往可以减少文库中克隆的数量。,（三）柯斯质粒载体（Cosmidvector）,柯斯质粒载体又叫粘粒载体，这是一种由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。柯斯质粒在结构组成上具有噬菌体的特性、也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入3540kb的外源基因，这是构建真核生物基因文库的主要载体。柯斯质粒适用于作基因簇和大基因的克隆。,（四）YAC载体,YAC是酵母人工染色体（Yeastartificialchromosome）的缩写，是目前能容纳最大外源DNA片段的载体。简单地说，酵母人工染色体载体有两个臂，之间有着丝粒，每个臂的末端有一个端粒，另外，染色体上还有供选择的标记基因；当外源DNA片段连接进两个臂中以后，通过选择标记人们可以从酵母宿主细胞中筛选出重组的人工染色体。实验结果证明，每个YAC都可以装进100万碱基以上的DNA片段，这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍，所以可以保证基因结构的完整性。,(五)动物病毒,动物病毒作为载体可用于外源基因向真核细胞的转入。作为基因介导的动物DNA载体，必须具备以下条件：(1)具有动物病毒的复制起始部位及启动子，以便外源基因能有效的转染动物细胞，以及提供必要的转录信号：(2)具有可供选择的标志基因，因为重建的病毒转染力很低，一般仅为105107，只有利用标志基因才能选出转化细胞株；(3)具有适当的多种单一内切酶位点供外源基因插入。目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒(Simianvirus40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳头状病毒(Papillomavirus)；(4)逆转录病毒(Retrovirus);(5)牛痘(Vaccinia)病毒;(6)牛疣病毒(Bovinepapillomavirus)等。,三、获得目的基因的方法,(一)利用理化方法分离基因理化方法分离基因是依据DNA双链结构的特点和四种碱基互补的氢键差异，其方法有以下四种：1密度梯度超速离心法2单链酶法3多聚赖氨酸法4分子杂交法,(二)利用生物学方法分离基因,利用噬菌体转染或质粒转化等微生物学技术分离基因的方法，我们把它叫做生物学方法。这种方法应用于原核基因的分离提取。用适当的限制性内切酶(Restrictionendonuclease)将整个染色体或DNA分子切成许多相当于一个或略大于一个基因的片段，然后把全部DNA片段与质粒组成重组DNA分子，并转化到某特定基因营养缺陷型受体菌内，进行纯系繁殖，再经分离鉴定，选出所需基因。,(三)基因的人工合成,化学合成法逆转录法(Reversetranscription)逆转录法也叫cDNA法，它是一种酶促合成法，即以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料合成DNA(cDNA)，再经复制后即成双链DNA。3.聚合酶链式反应(PCR),2019/12/15,21,可编辑,四、重组DNA分子,1.粘性末端连接连接效率高相同酶切末端配伍末端2.平端连接连接效率低3.同聚物接尾法4.人工接头法,五、基因的转移(Genetransfer),(一)、重组DNA向细菌细胞转入把以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程叫做转化(Transformation)；把以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程叫做转染(Transfetion)。对细菌细胞进行转化或转染的关键是细胞处在感受态，所谓感受态细胞，就是受体细胞处于摄入外源DNA的状态。一般用0.010.05M/L氯化钙处理受体细胞，可以引起细胞膨胀，增大细胞的通透性，使重组DNA进入细胞，提高转化效率。,转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径溶原菌途径,(二)、外源目的基因向真核细胞转入,向真核细胞中转移基因的方法可分为两大类，类需借助于载体，另类不需借助于载体。1借助于载体的基因转移2不需载体的基因转移磷酸钙沉淀法脂质体介导法血影细胞(Bloodshadowcell)介导法,六、转化细胞的筛选与鉴定,转化或转染的效率是很低的(一般为105106)，也就是说，只有极少数细胞接受到重组DNA分子，能实现基因的转移。所以必须从大量的培养细胞中筛选出已被外源DNA转化了的细胞，然后建立无性繁殖系，使所需基因大量扩增和表达。,重组体的筛选screening/selection1.直接选择法抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补互补蓝白斑筛选分子杂交探针原位杂交/Southern印迹法限制性酶切图谱/PCR2.非直接选择法免疫学方法,七克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件密码子通用1、原核表达体系原核表达载体的标准合适的筛选标志强启动子翻译控制序列多克隆位点,融合蛋白包涵体大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难表达大量的可容性蛋白,真核表达体系筛选标志NeorG418转染方法磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组稳定转染目的基因整合进宿主基因组,第三节转基因动物技术,一、转基因动物的概念转基因技术是将外源DNA导入细胞的一种技术。它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。1981年Gordon和Ruddle首次用显微注射法(Microinjection)把外源基因导入小鼠受精卵的雄核，并将注射后的受精卵植入假孕母鼠子宫，产生了的78只小鼠，其中有2只的所有细胞中(包括生殖细胞)都含有外源基因，但因缺乏启动子而不能表达，他们把出生后带外源基因的小鼠叫做转基因小鼠(TransgenicMice)，自此以后，凡带有外源基因的动物都叫做转基因动物(Transgenicanimal)。,二、转基因动物技术的一般步骤,(1)选择能有效表达的蛋白质；(2)克隆与分离编码这些蛋白质的基因；(3)选择能与所需组织特异性表达方式相适应的基因调节序列；(4)把调节序列与结构基因重组拼接，并在培养细胞或小鼠中预先检验其表达情况；(5)把拼接的基因注射到受精卵的细胞核中；(6)把注射后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发(7)检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代中的传递情况。,三、导入基因的方法,导入外源基因的方法有多种，一些方法已在上一节作过叙述，如：反转录病毒转染法；磷酸钙沉淀法；脂质体介导法；血影细胞(Bloodshadowcell)介导法。在此再介绍一些方法，1）DNA微注射法；2）精子载体法；3)胚胎干细胞（ES）介导法；4)染色体片段注入法；5)电转移法等。在转基因动物中，DNA微注射法比较常用。,四、基因的选择与转基因动物的研究现状,(一)转入基因的选择(二)转基因动物的研究意义1提高动物生长、生产性能的研究2改变奶蛋白成分和性质的设想3利用家畜产品生产药物蛋白的研究,第四节动物克隆技术,一、动物克隆的概念所谓克隆(Cloning)就是无性繁殖，动物克隆(Animalcloning)就是不经过受精过程而获得动物新个体的方法。克隆动物(cloninganimal)就是指