（遗传学专业论文）桂花花芽分化的研究.pdf

河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 摘要 本文通过野外观察和石蜡切片方法，利用光学显微镜和扫描电子显微镜，对丹桂、金桂、 籽银桂和四季桂四个桂花品种花芽分化的过程进行了研究。结果表明：桂花四胃中旬开始进 入分化初始期，九月下旬结束，历时六个多月。桂花花芽形态分化可分为花芽分化初始期、 总苞分化期、花原基分化期、顶花花被分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期6 个时期。从花芽 分化的进程来看，分化速率具有慢一快一慢的特点。在雄蕊的发育过程中，四种桂花之间基本 没有区别，都能形成完整的花粉囊和成熟的花粉粒。雌蕊的发育存在明显的差异。能育的籽 银桂和金桂心皮原基出现时就是一个突起，而后继续发育成完整的雌蕊。郎正常的柱头、花 柱和子房。而不育的丹桂和四季桂雌蕊心皮原基出现时就是两个突起，是分离的，而后继续 发育也不愈合，形成两片叶状体，没有柱头、花柱和子房的存在。从花芽分化的过程来看， 四季桂和丹桂的不育是由于雌蕊发育不正常引起的。桂花小孢子母细胞减数分裂为同时型， 小孢子在四分体中的排列方式呈四面体型，成熟花粉粒为二核花粉粒，有三个萌发孔。花粉 囊壁发育属双子叶型，由四层细胞构成：表皮、药室内壁、中层和绒毡层。绒毡层为分泌型 绒毡层。胚珠为薄珠心胚珠，单珠被，胞原细胞位于珠心表皮之下，直接起大孢子母细胞的 功能。大胞子四分体线形排列，台点端大孢子为功能大孢子，胚囊发育类型为蓼型，具有特 化的珠被绒毡层和承珠盘。 关键词：桂花；花芽分化；育性； 桂花花芽分化的研究 a b s t r a c t t h i sp a p e rs t u d i e dt h ep r o c e s so ff i o m lb u dd i f f e r e n t i a t i o no fo 声d g r s d a n g u i ，o 旁q 铲n s 。j i n g u i ，o 声d 铲s z i y i n g u i a n d0 旁n g r a m s j i g u i ，t h r o u g ho u t s i d eo b s e r v a t i o n l i g h tm i c r o s c o p ya n ds c a n n m ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p y t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ep r o c e s so fb u d d i f f e r e n t i a t i o nb e g a na tm i d - a p r i la n df i n i s h e da tl a t es e p t e m b e r 1 a s t e dm o r et h e ns i xm o n t h s t h e p r o c e s sc a nb ed i v i d e di n t o6s t a g e s ：t h ee a r l yd i f f e r e n t i a t i o ns t a g e ，t h ei n v o l u m e r u md i f f e r e n t i a t i o n s t a g e t h ei n f l o r e s c e n c ep r i m o r d i u md i f f e r e n t i a t i o ns t a g e ，t h et o pf l o w e rp e r i a n t hd i f f e r e n t i a t i o n s t a g e ，t h ea n d r o e c i u md i f f e r e n t i a t i o ns t a g ea n dt h eg y n o e c i u md i f f e r e n t i a t i o ns t a g e f r o mt h e p r o c e s s o ff l o r a lb u dd i f f e r e n t i a t i o n ，w el o o k e dt h a tt h ed i f f e r e n t i a t i o n s p e e d h a s t h e s l o w q u i c k s l o wc h a r a c t e r i s t i c t h ea n d r o e c i u md i f f e r e n t i a t i o ni se a r l i e rt h a ng y n o e c i u m s t h e r e i sn od i f f e r e n c ef o ra n d r o e e i u md e v e l o p m e n tb e t w e e nf o u ro 争n 铲融se u l t i v a r s ，t h e i rs t a m e n sc a n d e v e l o pi n t on o r m a lp o l l e ns a c sa n dr i p ep o l l e n sb u tt h e r ea r eo b v i o u sd i f f e r e n c e sf o rg y n o e c i u m d e v e l o p m e n tb e t w e e nf e r t i l e0 ，争q 铲s z i y i n g u i , 0f r a g r a n s 3 i n g u i a n ds t e r i l e0y r a g r a n s d a n g u i o f r a g r a n s s i j i g u i w h e nt h ep i s t i lc a p e tp r i m o r d i u mo fof i a g r a n s z i y i n g u i a n d0 帝n g r 1 j i n g u i a p p e a r sf i r s t l y , i tp r e s e n t so n l yo n es p o t t h e ni tc a nd e v e l o pi n t on o r m a lp i s t i a l w h i c hc o n t a i n so v a r 3 ：s t y l ea n ds t i g m a b u tt h ep i s t i lc a r p e lp f i m o r d i u mo fo f r a g r a n s s i j i g u i a n d 0 争昭a n s j d a n g u i ? p r e s e n t s t w os p o t s w h e n i t a p p e a r s f i r s t l y w i t h t h ed e v e l o p m e n to f f l o w e r b u d s ，t w os p o t sc o u l dn o th e a l i n g t h e r ei sn oo v u l e ，s t y l ea n ds t i g m ae x i s t t h r o u g hf l o r a lb u d d i f f e r e n t i a t i o ns t u d y i n g ，t h ea u t h o rs u g g e s t st h a tt h ea b n o r m a lp i s t i ld e v e l o p m e n to fo 帝口g r s s i j i g u i la n do 一d g r 艄1 d a n g u i l e a d st oi t ss t e r i l i t y t h ec y t o k i n e s i so f m i c r o s p o r em o t h e rc e l lo f o 帝昭m sl o u t d u r i n gm e i o s ii so fs i m u l t a n e o u st y p e i t st e t r a s p o r o p h y t ei st e t r a b e d r a l t h e m a t u r ep o l l e ng r a i ni so f 2 c e l lt y p e a n de a c hh a s3g e r m i n a la p e r t u r e t h ed e v e l o p m e n to f a n t h e r w a l lf o l l o w st h ed i c o t y l e d o n o u s t y p e c o m p o s e do ff o u rl a y e r s ，r e s p e c t i v e l ye p i d e r m i s e n d o t h e c i u m m i d d l el a y e ra n dt a p e m m 】协t e n u i n u c e l l a t eo v u l eh a ss i n g l ei n t e g u m e n t t h e a r c h e s p o r i a le e l il i e su n d e rn u c e l l se p i d e r m i s ，w h i c hd e v e l o p e si n t oa r tf u n c t i o n a lm e g a s p r o e y t e i i 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 m e g a s p o r et c 删i sl i n e a r t h ec h a l a z a lm e g a s p o r ed e v e l o p si n t oa l le m b r y os a go f p o l y g o n u mt y p e h y p o s t a s ea n ds p e c i a li n t e g u m e n tt a p e m me x i s ti nt h eo v u l e k e y w o r d s ：o s m a n t h u sf r a g r a ml o u r ；f l o w e rb u dd i f f e r e n t i a t i o n ；r e p r o d u c i b i l i t y 1 1 1 美子学位论文独立完成祀内客创衢的声明 裹 匍河南大学提出硕士学位串请。奉人邦重声明：所呈交的学住论工是 友人岳导师的指导下独立兄成的，对所研究的课题有新奇勺见解；据戡所去。陲、 支中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研元威栗，也不包括其他人为获得任何教育、科研机捆的学位真正韦而 段保存、汇编学位论文( 甄质文轰和宅亍文茸：。 ( 涉及保密晦垂的学，：主论支在解露后适用葺、援板书) 学住裘得考( 学1 立论文作者) 釜名：巷硎 2o 刃皇r 月弘自 学1 三论文靠导数师釜名：南它f 酝 2 0 卯车6 ， 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 l 前言 1 1 桂花简介 桂花( o s m a m h u s f r a g r a n sl o u t ) 又名木犀、九里香、金粟，是术犀科木犀属( o s m a n t h u s ) 的代表种，是我国特有的常绿阔叶灌木或小乔木经济树种。原产我国西南地区，栽培历史已 达2 5 0 0 年多年【1 l 。桂花本身是一种野生植物，直到目前在我国湖南、浙江、湖北、贵州、云 南、广西等还发现有自然分布的原始桂花林f 2 】。桂花由天然生长而至人工栽培，由山野而入 公苑、寺庙、庭院，由南方向北方逐步推进，人们对桂花的认识也随之逐渐深化，由此桂花 的应用范围也日益扩大，与之相适应的中华民族独特的桂花文化亦逐渐孕育、形成和发展【3 。 桂花是我国十大名花之一，其树姿典雅，碧叶如云，四季长青，亭亭玉立，尤以金秋时 节，桂蕊飘香，浓香远溢，香飘十里，沁人肺腑，令人陶醉，具有很高的观赏价值。桂花是 我国人民喜爱的传统园林花木，广泛用于园林、庭院、风景名胜区绿化，特别是在桂秫，苏 州等地已形成了独特的桂花旅游景观。桂花作为一种著名的芳香植物，早已得到应用。1 9 7 2 年在湖南长沙发掘的马王堆一号汉墓中，就发现了含有桂花的香囊 4 1 。在桂花的芳香物质中， 。有多达5 0 种左右的化学成分。这些化学成分可以自桂花花冠上溢出，给环境带来令人愉快的 芳香吲。时至今日，桂花的许多实用价值已得到开发利用。第一，在食品、酿酒和制茶等工 业中，桂花是一种重要的调料，萁产品在国际市场上享有盛誉。人们利用桂花作为糕点、糖 果、蜜饯、酿酒和熏茶的配料，以提高这些食品的质量。第二，随着我国香料工业的迅速发 展，桂花又成为提炼桂花浸膏、桂花香精和制造香皂、香水等化妆品的重要原料。天然桂花 香气异常清新，至今还不能人工合成，号称天香，其产品桂花浸膏在国际市场上几乎与黄金 等价。第三，桂花的药用价值有广阔的开发前景，据记载桂花的花、果、树皮均可入药，有 散寒破结、化痰止咳、生津辟臭之功效，亦可用于配制食疗保健食1 6 1 1 ”。桂花是一种绿化、 美化、香化、三者密切结合，观赏和实用兼备的优良园林树种，伸受人们喜爱，正因为桂花 独特的魅力，目前苏州、杭州、桂林、咸宁、合肥、汉中、南阳、马鞍山等市把桂花定为市 花，广西壮族自治区把桂花定为区( 省) 花。更值得一提的是，2 0 0 4 年1 2 月，南京林业大 学向其柏教授被国际园艺学会授予“桂花品种国际登录权威”。这是我国继1 9 9 8 年北京林业 桂花花芽分化的研究 大学陈俊愉院士获得“梅花品种国际登录权威”后的第二个突破。这将对台理利用我国桂花 品种资源，推动我国花卉业的发展，使桂花走向世界具有十分深远的意义。 1 2 桂花品种的研究进展 木犀属属木犀科( o l e a c e a e ) ，该属的模式种郎木犀( 桂花) ( o s m c m t h u s # a g r a n s l o u ) 。 木犀属是由葡萄牙植物学家j u a nl o u r e i r o 于1 7 9 0 年创立，当时只有一个种，即木犀 ( 蕊m 髓镕f r a g r a n sl o u r ) f 8 1 。其实桂花的最早科学名称系田瑞典植物学家c e t h u r b e r g 1 7 8 4 年创立，因当时还没有木犀属，而将放在了本犀榄属( o l e a ) 中。6 年以后，由j l o u r e i r o 建立木犀属并选该种为模式种。日本学者牧野太郎( m a k i n o ) 于1 9 0 2 年发表了桂花的两个 变种即银桂( o f r a g r a n s v a r 1 a i f o l i u s m a k i n o ) 和丹桂( o f r a g r a n sv a r a u r a n t i a e u s m a k i n o ) 。1 9 2 7 年，他又把开金黄色花的桂花定名为金桂( o f r a g r a n s v a r t h u n b e r g i l m a k i n o ) 。1 9 5 8 年，p s g r e e n 对木犀属植物进行了详细而系统的研究，提出了木犀属系统的分类方法，这对桂花品种分类 研究非常有意义。 由于栽培历史悠久栽培地区广，因自然选择和人工培育，桂花形成了大量的种内变异 品种资源丰富【9 】。但桂花在我国古代研究资料较少，历史上既无图谱，也无专著。虽然我国 早在春秋战国时山海经 及屈原的九歌中就有“桂”的记载，但由于桂花与樟科的肉桂在 植物形态上相似，仅从记载上很难得出当时所称的“桂”就是现在的桂花。直到明清时期才 有桂花品种名称的记载，把桂花根据花色和花期分为金桂、银桂、丹桂和四季桂。但由于历 史的局限性，古人不可能对桂花品种进行详细的调查和记载。更不可能进行品种分类理论上 的讨论和系统研究。基本以花期和花色记载了一些桂花的类别。1 9 4 9 年，黄岳渊、黄德邻根 据桂花花色、叶形、花心和开花时期等简单记载了上海地区1 0 个品种：鲁涤非等人1 9 6 3 1 9 6 4 年曾对武汉桂花进行过品种调查，但未公开发表；1 9 8 0 年陈俊愉、刘师汉等记载杭州 和武汉的桂花品种名称1 2 个；1 9 8 5 年，刘玉莲对南京地区的桂花品种进行了调查，记载当 地桂花品锋b 个，并采用检索表的形式对品种进行了鉴定，提出了第一个桂花品种分类系统， 将桂花品种分为四季桂( s e m p e r f l o r e n sg r o u p ) 、金桂( t h u n b e r g i ig r o u p ) 、银桂( l a t i f o l i u sg r o u p ) 和丹桂( a u r a m i a e u sg r o u p ) 4 个品种群【1 0 】。此系统于1 9 9 3 年进行了修订】，先以开花季节为 第一级标准，分为秋桂和四季桂2 大类，然后以花色为第二级标准分金桂、银桂、丹桂和四 2 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 季桂4 个品种群，然后以花期迟早、子房发育状况、营养器官特征分别为第三、第四和第五 级分类标准。1 9 8 9 年，姚崇怀记载了湖北桂花6 2 个品种旭品种形态描述过于简单，无法进一 步核实。1 9 9 2 年，朱长山记载河南的1 8 个品种提出以花色色质及开花习性，花的特征、叶 的形态特征、花期的不同为依据的四级分类标准，仍将桂花分为4 类”】。2 0 0 0 年。刘互莲和 向其柏发表了“桂花品种分类研究”【1 3 】一文，记载3 5 个品种。并重点讨论了四季桂类和秋桂 类的关系。2 0 0 2 年，全国计有桂花品种：四季桂品种群1 2 个，银桂品种群l1 个，丹桂品种 群1 4 个，金桂品种群2 5 个，共计6 2 个【1 4 】。2 0 0 3 年，尚富德，陈仲芳等提出6 0 条记载项目， 用于桂花品种资源的调查1 1 5 1 。刘龙昌、尚富德采用多层次综合灰色评估法对2 2 个桂花品种 ( 含1 2 个主要形状) 进行分析评价”】。2 0 0 4 年刘龙昌向其柏选取了3 5 个主要性状，对 3 0 个桂花品主要性状进行数量分类，四季桂品种与秋桂类品种最后相聚，反映了四季桂与秋 桂关系较远，金桂和丹桂关系较近i ”。伊艳杰、袁王俊等运用层次分析法对河南省的1 7 个 桂花品种进行了生产加工利用和园林观赏应用方面的综合评价f ”1 。2 0 0 4 年，臧德奎、向其柏 在对桂花的历史研究、木犀属及桂花的地理分布深入分析的基础上，对全国范围内的桂花品 种进行了系统的整理，共统计出我国桂花品种1 5 4 个，其中四季桂品种群1 8 个，银桂品种群 5 7 个，丹桂品种群3 6 个，金桂品种群4 3 个1 1 9 】。 近年来有人试用同工酶和蛋白质电泳等技术，研究桂花品种之问的遗传关系。陈建业等 用过氧化物同工酶法对河南1 5 个桂花品种进行了研究【2 0 1 ，赵小兰用同工酶对武汉地区3 0 个 桂花品种进行研究 2 h 。最近，随着分子遗传学的发展，d n a 分析技术得到不断改进，也有 人利用分子标记技术进行这方面的初步工作 2 2 - 2 7 】。 1 3 挂花的生物学特性 桂花为常绿阔叶灌木或小乔木，高1 5 8 米。桂花实生苗有明显的主根，根系发达深长。 幼根浅黄褐色，老根黄褐色。嫁接苗的根系因砧木而异；插条埋入土中各处易生不定根，但 无明显主根。桂花分枝性强且分枝点低，特别在幼年尤为明显，因此常呈灌木状。密植或修 剪后，则可成明显主干。树冠圆头形，半圆形或椭圆形。树皮粗糙，灰褐色或灰白色，有时 显出皮孔。 桂花的枝芽是一种包含有叶芽和花芽的混台芽。当年早春，主要分布于枝条先端】o 节 桂花花芽分化的研究 的枝芽，先萌发成为新梢，再在新梢上发育和生长出新叶和当年秋天开花的新花芽。封梢后， 叶色逐渐转绿，叶面积趋向定型，叶片不断增厚腋茅开始发生，并逐渐发育膨大。桂花新 梢长度随生长发育条件和植株年龄的不同而有很大的变化。但节数则各品种保持着相对稳定 的状态。桂花的分枝方式为假二又分枝，且分枝低，因此，桂花整体树形常呈现灌木状。桂 花老枝一般呈现灰白色至灰褐色常有纵裂。树皮上有皮孔分布。皮孔的数量、形状和颜色 与品种有关i “。 桂花叶为单叶对生，革质。叶片腹面具光泽，深绿色；叶背面一般为淡绿色。叶边缘常 常为全缘，少为波状缘：有锯齿或仅前端部分有锯齿。叶片椭圆形，长椭圆形、卵形、倒卵 形、披针形、倒披针形、长披针形至卵状披针形。 桂花的花芽在叶腋间叠生，居于上位者先分化，居于下位者后分化或者不分化。桂花栽 培品种一般每节对生有2 - 4 个叠生芽，即能最大限度的先后长出4 - 8 个花序，每个花序又各 由5 - 9 朵小花构成。聚伞花序呈簇状或近帚状开放。桂花的花冠裂片镊合状排列，花径小于 】e m ，属于小花树种，但也有个别大于l e m 。花冠裂片4 枚，但也有多于4 枚，而呈叶状或 台阁现象的，这在四季桂品种群中较为常见。花蔻的颜色因品种而异，有黄自、柠檬黄、金 黄、橙黄、橙红诸色，具有芳香。花梗纤细，花丝极短。雄蕊2 枚，着生在花冠筒的近顶部。 雌蕊柱头2 裂，子房2 室，每房有2 个胚珠。多数栽培品种不结实，少数栽培品种能结实， 并可成为观赏亮点。经花部解剖证明：桂花品种的结实与否，主要与其花部器官结构有关。 花粉量不同品种差异较大。桂花花小，花瓣小，不够鲜艳，使其具有风媒花的特点。同时又 具有花丝极短，花极香等有利于昆虫传粉的特点。 桂花的果实为核果，俗称桂子。幼果绿色。自秋季开花后开始发育，次年4 5 月果实成 熟，紫色，椭圆形，种子椭圆形，顶端渐尖有喙。袁王俊等试验表明：桂花种子成熟后胚有 后熟作用，胚乳中可能含有抑制胚萌发的物质；使用赤霉素和经3 个月的层积处理，也不能 使其萌发。将桂花种子进行3 个月的层积处理后，进行离体培养，培养基中加入0 5m o l l 6 - 苄基腺嘌呤饵a ) 或1 0m o l l 6 - 苄基腺嘌呤- + 0 5m o l l 萘乙酸( n a a ) ，则可以打破种子的休 眠，促其萌发【2 9 】。 桂花适应于亚热带气候广大地区。性喜温暖，湿润，不耐寒。种植地区平均气温1 4 - 2 8 4 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 ，7 月平均气温2 4 2 8 ，1 月平均气温0 以上，能耐最低气温1 3 ，最适生长气温 是1 5 2 8 。湿度对桂花生长发育极为重要，要求年平均湿度7 5 8 5 ，年降水量1 0 0 0 毫米 左右，特别是幼龄期和成年树开花时需要水分较多，若遇到干旱会影响开花，强日照和荫蔽 对其生长不利，一般要求每天6 - 8 小时光照。喜光，但在幼苗期要求有一定的庇荫。喜温暖 和通风良好的环境。适生于土层深厚、排水良好，富含腐殖质的偏酸性砂壤土，忌碱性土和 积水口”。 1 4 植物花芽分化的研究 花芽分化是观赏植物开花的先决条件，在人为栽培过程中，管理者通常要采取多种措施 促使植株在预期的时间内分化花芽，最终达到控制花期的目的。因此，研究花芽分化规律是 正确制定栽培技术的重要理论依据。然而，观赏植物的花芽分化是迄今尚未解决的难题，至 今仍不能很好的解释花芽分化的形成。目前，有关花芽分化的形成理论主要有以下几种学说： k e r bh a n s 提出开花的碳氦比学说，认为植物体内氮化合物与同化糖类含量的比例是决定花 芽分化的关键，当碳占优势时，花芽分化受促进，氦占优势时，营养生长受促进，但高含量 的碳水化合物不是成花的唯一决定因子f 3 0 l ；激素平衡学说认为花芽孕育是各种激素在时间、 空f s qt - f 匀相互作用产生的综合结果| 3 1 1 ： 9 7 7 年s a c h s 提出的养分分配学说，认为生长点内部 不同组织所获得的营养差异决定是否形成花芽，中心分生组织获得较多的养分供应时，就会 转向花芽分化方向p ；1 9 9 3 年b e m i e r 等提出的控制成花的网状系统模型，认为花的形成受 多种相互交叉的途径控制，不同的成花诱导刺激可以启动不同的成花基因，只要一条途径畅 通，花芽分化就能启动；还有激素信号调节学说f “”1 等。影响植物成花的因素很多，现在 普遍认为：植物经过一定时间的营养生长，就能感受外界信号( 低温和光周期) ，并产生成花 刺激物，在茎尖产生一系列反应，在适宜的条件下，开始花芽发育口”。近年来已有许多学者 从分子生物学的角度来研究花芽分化和花的发育。是拟南芥花分生组织决定基因，在新 形成的花原基中表达很早f 3 9 】。口1 7 基因在3 5 s 启动子驱动下转基因拟南芥所有侧芽全部转变 为花，证明其对诱导花形成是必需的。3 5 s l f y 嵌台体导入烟草和杂种杨后可使这些植物 提早开花，其中杨树野生型通常要8 年以上开花，而转基因杨7 个月便能开花 4 1 】。邵寒红等 将拟南芥l f y c d n a 克隆转入菊花，使有些菊花花期提前6 0 多天1 4 2 】。此外，拟南芥的铷r 桂花花芽分化的酽究 基因，7 踞j 基因，p ，基因和金鱼草的c e n 基因，勋基因对顶端分生组织的属性起决定性 作用。e m f 是生殖发育的抑制因子，明j c 基因起到保持花序型分生组织属性的作用，而 a p l s p u o 基因促进花序型分生组织向花芽型分生组织转化。从苹果中鉴别和克隆了跖亚 家族的m a d s b o x m a m a d s 2 ，利用转座插入m a d s 盒基因编码的转录因子产生的突变控靓 苹果的单性结实。从草莓中鉴别了a g a m o u s c d n a ( s r a g l 在苹果申发现了e 4 t 基因。 这些研究结果为植物花芽分化的遗传学研究起了良好的开端作用| 4 3 4 7 j 。 花芽分化的研究最早是从形态分化开始的。人们首先区分了花芽和叶芽以及花芽发育的 各个阶段，尔后围绕花芽分化的原因进行了广泛的研究，从形态、解剖、生态生理和细胞化 学等各个方面探讨了花芽分化的机理。植物成花生理及其相关术语的定义，目前尚无一致的 说法。早期l a n g ( 1 9 5 2 ) 将成花过程分为4 个阶段：f l o w e ri n i t i a t i o n ，指花原基( f l o w e r p r i m o r d i u m ) 分化：f l o w e r o r g a n i z a t i o n ，指花器官( 萼片、花稚、雄蕊、雌蕊) 的分化；f l o w e r m a t u r a t i o n ，指花的成熟，包括花器官生长、性细胞分化，并产生花粉、胚囊及雌雄配子的过 程；a n t h e s i s ，a p 开花_ t 4 ”。前两个阶段，为形态分化( m o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o n ) ，合称为 花芽分化( f l o w e rd i f f e r e n t i a t i o n ) 后两个阶段合称为发育( d e v e l o p m e n t ) 。另外，i n i t i a t i o n 之前还有花诱导( f l o w e r i n d u c t i o n ，花芽引发) 的生理变化，在我国通常称之为生理分化 ( p h y s i o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o n ) 。目前花芽分化解剖学方面在石榴l “5 0 1 、杏- 5 2 】、连翘、 大丽花1 5 4 】、香桂、红球姜“、一串红【5 7 i 、蚕豆、金边瑞香【5 9 】、金缕梅f 6 0 】、咖啡 6 1 】、欧 洲甜樱桃【6 2 、李f 6 3 】、唐昌蒲i 删等植物上曾有报道。 1 5 桂花花芽分化研究进展和花期物候 桂花花芽的生长发育在新梢老结后进行l ”删。有关桂花花芽分化的过程，王彩云，万云 先等曾对金桂和厚瓣金桂进行了研究f 6 7 - 6 8 。研究表明。厚瓣金桂花芽分化的时间及其对应阶 段为：4 月中旬开始苞片分化，5 月初出现苞片原基，6 月下旬形成花序原基，7 月初花蕾原 基出现，7 月中上旬形成顶花花萼原基，7 月中下旬各花瓣原基形成，7 月下旬至8 月下旬分 化雄蕊分雄蕊原基及花药，8 月底心皮原基形成。从厚瓣金桂的花芽分化的进程来看，分化 速率具有慢快慢的特点。苞片分化慢，花序原基至花瓣分化快，雄蕊分化慢，整个分化时 期历时4 个多月。这种差异可能是内外各种因素综合影响的结果。如雄蕊分化期需要时期长 6 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 可能是因为性器官结构复杂，各小花分化需时更长的缘故。其它植物的花芽分化速率也表现 阶段性变化。石榴的花瓣分化期持续时间相对较长，可能与其复瓣特性有关；山茶花雄蕊和 雌蕊的分化需时相对较长，可能与其复瓣化有关：杏在花瓣分化后进程加速；紫藤在雌嚣分 化期，绣线菊和连翘在雌蕊分化时速率减慢。花芽分化速率反映了植物本身的节律特性。桂 花品种很多，品种间的形态和育性存在明显差异，对其它桂花品种的花芽分化，尚待进一步 研究。 物候学是自然界中生物和和环境条件周期变化相互关系的科学。对桂花品种进行物候学 观测，尤其是花期物候调查有利于研究和鉴定桂花品种的正确花色，预测预报桂花的花期， 更好的为采花生产和观光旅游服务。中国科学院地理研究所1 9 7 9 年制定了中国物候观测方 法。把园林树木的开花物候期划分为花蕾或花序出现期、开花始期、开花盛期和开花末期4 个物候期。按杨康民教授在上海市桂林公园3 年系统验证总结，将桂花开花分为以下几个时 期：花芽萌发期、圆珠期、顶壳期、梗铃期、香眼期、初花期、盛花初期、盛花期、盛花末期 和花谢期共1 1 个物候期阱】。 花芽萌动期：桂花的叠生芽着生在当年生新梢的叶腋里，通常在4 - 5 月生长期物候进封 梢期时就逐渐形成，整个夏季持续膨大。在8 - 9 月份花前1 个月左右，花芽外侧2 片鳞芽开 始绽裂，中缝出现绿色或偏红色花芽的芽体。其数量占整个花芽总量的3 0 左右。 花芽萌发期：花芽的芽体继续肥大延伸，当其平齐或超过两侧芽鳞长度的数量占花芽总 量的1 0 以上时，称为花芽萌发期。 圆珠期；花前半个月左右时间，芽体外侧的2 片鳞芽开裂度加大，芽体本身很快成圆球 形或椭球形。其数量占花芽总量1 0 时，成为圆珠期。圆珠期是桂花开花的明显先兆。 项壳期：花前约1 周时间，继续肥大生长的圆珠花芽内部生长不均衡而开始变形。两侧鳞 芽先后散落。包被在芽体表层的苞片也随之分裂成许多大小不等的黄褐色膜壳，覆盖在芽体 上方。当全树2 5 的花芽项壳出现花营时称之为顶壳期。 铃梗期：花前3 - 5 天，聚伞花序开始分散延伸。花梗由短变长，梗色由青变黄。原黏附 在众多小花蕾上方的黄褐色膜壳，大量散落到地面。当全树达2 5 时称之为铃梗期。 香眼期：花前1 天左右时间，簇生花序的每一朵小花，彼此开始分离。外形发育齐全。都 7 桂花花芽分化的研究 分小花顶端出现空隙，其大小似局香眼，由此处散逸出阵阵清香。当全树达2 5 时称之为香 眼期。 初花期：花约1 0 开放，大部分处于半闭合状态。花色较淡。内涵香气浓郁，此时桂花 开始具有观赏价值。 盛花初期：初花期持续1 天时间即进入盛花初期。此时花有3 0 5 0 开放，花色转深，香 气袭人。 盛花期：盛花初期持续1 天即进入盛花期。此时7 0 或近全部开放，项梢的花色开始变 淡，香气也有所逸散。 盛花束期：盛花期约持续2 天时间即进入盛花末期。此时花全部开放，花色转淡，香味 顿减。花冠裂片和花梗开始从枝梢脱落。 花谢期：盛花末期一般维持一两天时间就进入花谢期。树上遇见少量残花，花事至此全 部终了。姜纪红等，李军分别对杭州和苏州部分桂花品种进行物候研究，发现桂花初花期与 初花前最低气温相关密切。影响桂花开花的主要气象因子是桂花开花前1 0 天的平均气温和最 低温度；对桂花初花的气候短期预报和桂花物候对气候变化的响应提供了依据1 6 9 4 q 。 1 6 研究内容和意义 通过光学显微镜和电子显微镜技术，对籽锓桂、丹桂、四季桂、金桂花芽分化过程进行 研究，确定其各分化时期及主要特征，描述花芽分化进程：比较结实与不结实品种在花芽分 化过程的差异探讨不结实品种败育的原因：通过野夕 观察法，调查四个桂花品静的开花物 候期。目的在于丰富桂花研究的基本理论，为桂花的花期调控和提高花产量以及确定采收期 提供科学依据。 8 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 2 材料与方法 2 1 材料 供试材料为丹桂，籽银桂，四季桂金桂，均取自河南大学校园内。树高约4 m ，冠幅3 5 m 。孤植，各方向受光均匀，生长势良好。 2 2 方法 2 2 1 花芽分化研究方法 取样从2 0 0 5 年4 月开始。自4 月1 0 日开始每十天取样1 次；6 月5 日开始每五天采样一 次，8 月5 日开始每三天取样一次。取样时从树冠中上部外围不同方向选择生长良好、中等 长度的当年生枝条，除去叶片，剪取自顶端向下的第二、三节带芽茎节，水洗后用f a a 液固 定。将叠生芽中最上位者按常规石蜡切片法制片，铁矾苏木精染色。 石蜡切片制作方法p 1 】： 固定液：福尔马林5 i n l ，冰醋酸5 m l ，7 0 酒精9 0 m l ，f a a 液中固定2 4h 备用。 脱水：将材料从固定液中转入7 0 酒精并按照7 0 一8 5 一9 0 一9 5 一1 0 0 - - 1 0 0 7 , 醇的梯度逐级处理每次处理1 5 2h 。 透明浸蜡：供试材料经各级酒精脱水后进行透明处理，把材料从无水乙醇中转入1 足无 水乙醇+ 1 ，2 二甲苯，并按照1 2 无水乙醇+ 1 2 二甲苯一二甲苯一二甲苯的梯度进行，每级处 理1 5h 。浸蜡时把材料放入蜡杯中加入浮蜡然后放入恒温箱3 6 - 4 0 过夜。 包埋：将恒温箱升至6 0 一6 5 用包埋所用的纯蜡，石蜡+ 蜂蜡，每2h 换一次，共处理三 次。然后将溶解的石蜡转入包埋盒内，迅速取出蜡杯，用热镊子夹取材料放入盒内彼此间留 一定距离并整齐排放，待到盒内蜡面渐呈薄膜凝固面平放与水中浸没后翻转盒底向上将己冷 却凝固的蜡块捞出盒底向上晾干。 修蜡块切片：分割下每个小样品，修整蜡块上窄下宽固着于台木上。沿花芽侧面纵切切 片厚度切片厚8 1 0i 1m 。 展片粘片烘干：蘸一滴粘片剂于载玻片中央，用手指涂抹均匀至整张载玻片，滴2 滴蒸馏 水。将蜡带平放其上，然后置于展片台上，当蜡片受热均匀完全伸展看不到有任何皱纹时， 从展片台上取下，用滤纸吸去多余的液体，放入4 0 恒温箱烘干。 9 挂花花芽分化的研究 脱蜡，复水，染色，脱水，透明，过程如下： 二甲苯一二甲笨一1 2 二甲苯+ 1 21 0 0 乙醇一】0 0 乙醇一1 0 0 乙醇一9 5 乙醇一8 5 乙 醇一7 0 乙醇一5 0 乙醇- - 3 0 7 , 醇一蒸馏水- - 4 铁矾一流水冲洗一o 5 苏木精一流水冲 洗一：铁矾一3 0 乙醇- - 5 0 乙醇一7 0 乙醇一8 5 z - 酵- - 9 5 乙醇一1 0 0 乙醇一1 0 0 乙 醇一1 21 0 0 乙醇+ 1 2 二甲苯一二甲苯一二甲苯。 封片：在载玻片上放上申性树胶，再放上材料，盖上盖玻片，烘干。 摄影：o l y m p u s b h 一2 显微镜观察并拍照。 2 ，2 2 扫描电镜检测 取不同时期桂花叠生芽，真空干燥，喷金度膜，用h 1 t a c h i s - 4 5 0 型扫描电镜观察并拍 照。 2 2 3 物候期的观察 采用定株观测法，花芽萌动开始每天观察一次。进行开花物候期的观察记载。 3 结果与分析 3 1 桂花花芽芽分化进程 通过对供试的四个桂花品种花芽的形态学观察发现，桂花从营养生长转向生殖生长，最 后到花器官的形成，经历一系列形态发育过程大致可以划分为6 个时期：即分化初始期 总苞分化期，小花原基分化期，顶花花被分化期，雄蕊分化期，雌磊分化期。 ( 1 ) 分化初始期 春季，休眠芽开始萌动并抽出新梢，随着新梢的生长，新梢各叶腋的芽也随之形成并不 断增大。开始采样时新梢已停止生长，但叶片尚未完全成熟，叶片嫩绿色。这一时期切片观 察到芽鳞片紧抱生长点，生长点顶端尖而狭小，分生组织细胞体积小。形状相似，排列紧密 细胞核大，染色较深，下部的芽基组织细胞较大，核小，排列疏松不规则( 图版l ， ) 。 ( 2 ) 总苞分化期 初始期芽内生长锥变平变宽，在生长点表面产生两个突起，即总苞原基。随着细胞的强 烈分裂，总苞原基不断向上伸长并向内弯曲生长，顶端逐渐抱合，而此时生长点内部的细 1 0 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 胞由于强烈的分裂呈锥形( 图版i 2 - 5 ) 。自分化开始至总苞片台拢，历时2 个多月，整个时 期分化进程较慢。 ( 3 ) 小花原基分化期 总苞内部生长点逐渐膨大隆起呈半球形顶端中央及下部周围染色较深( 图版i ，6 ) 。 随后项部中央及其下部周围隆起并渐渐分离，形成多个近圆形的突起，即为花原基分化期。 总苞基部外侧突起形成聚伞花序中的侧花原基。总苞内部中央顶端突起逐渐由圆变宽变平， 形成聚伞花序的项花原基，此时花序中其它的侧花原基呈椭圆形( 图版，1 ) 。 ( 4 ) 顶花花被分化期 顶花原基变平，周围形成4 个小突起，进入花萼原基分化期，花萼原基生长很快，细胞分 裂使突起渐渐伸长，稍向上怒，萼片较短，很快停止伸长。随后花萼原基内侧又形成4 个突起， 为花瓣原基。花瓣原基生长很快，不久就成为曲瓣状。侧花原基明显膨大，顶部变圆，开始 花器官的分化。当顶花花瓣合拢时，各小花的花瓣也发育成形。至此，一个花序中各小花的 发育进程基本一致( 图版，2 - 6 ) 。从花原基出现到花被原基的形成是一个连续而相对短暂 的过程，历时一个月时间。此时，芽体外观芽鳞片开裂程度增大，露出其中芽体，但芽体顶 端低于鳞片顶端。位置较下者叠生芽此时芽鳞紧闭( 图版_ ，7 ) 。 ( 5 ) 雄蕊分化期 雄磊原基首先出现在花瓣内侧( 图版，1 2 ) 。开始是两个小突起，逐渐发育增大，分化 成花丝、花药、药隔、药室等。花药大，呈豆瓣状，花丝很短。雄蕊是着生在花瓣基部的， 分化过程也证明了这一点。芽的外观表现为芽体膨大，芽尖伸出鳞片之外，本期末，几乎一 半芽体伸出鳞片之外。位置较下的叠生芽此时鳞片开始开裂( 图版，8 ) 。 ( 6 雌蕊分化期 对于可育的籽银桂和金桂，花药内侧生长点中央形成一个小突起，随着进一步发育，中 心逐渐形成一个小孔，小孔逐渐延伸，形成两个愈合在一起的心皮原基。心皮原基继续发育 基部膨大形成子房，上部伸长形成花柱和柱头( 图版，3 6 ) 。雄蕊原基的出现到胚囊成熟 持续时间较长，历时两个多月。此时的芽体膨大如珠状，剥去厚质的鳞片和膜质的苞片，可 以看到内部自色的小花蟹。 桂花花芽分化的研究 对于不育的丹桂和四季桂，已发育成形的花药内侧生长点中央形成分开的两i 、突起，即 心皮原基。随着进一步的发育，两个分离的心皮原基并不愈合，而是发育成两片叶状体( 图 版，1 4 ) ，两片叶状体或者紧密贴合，或者相互分离；没有子房和花柱的结构( 图版n t ， 5 - 6 ) 。 3 2 小孢子发生和雄配子体的发育 造胞时期( 图版，1 3 ) ：在据蕊原基的幼小花药的横切面上，四个角隅表皮之下由薄壁 细胞分化出1 至几个胞原细胞。这种细胞比其它细胞大，胞质浓厚、染色较深、细胞核大， 与周围的其它细胞有明显的区别。孢原细胞进行1 次平周分裂，产生内外两层细胞。外层为 周缘细胞，内层为造孢细胞。周缘细胞进行2 次平周分裂，形成4 层细胞。最外层为药室内 壁，最内层为绒毡层，中间2 层为中层。由于花药四个角隅的细胞分裂较快，此时花药横切 面呈四个裂瓣状。造孢细胞此时又进行有丝分裂，形成较多的造孢细胞，逐渐发育为小孢子 母细胞。 小孢子母细胞期( 图版，4 5 ) ：小孢子母细胞为多边形，细胞质浓，细胞核大，具多核 仁。绒毡层只有一层细胞，紧邻花粉囊。 减数分裂期( 图版v i ，6 - 8 ) ：整个减数分裂过程基本上在2 4 - 4 8h 内完成。同一花内的不瓦 花药或同一花药的不同药室，小孢子母细胞减数分裂有时不同步。同一室药室，小孢子母纸 胞减数分裂同步。绒毡层细胞体积增大，并开始进行有丝分裂，但不伴随细胞质的分裂。因 此，每个绒毡层细胞有多个细胞核。 四分体时期( 图版，9 ) ：经过减数分裂，小孢子母细胞形成四个小孢子，即单核花粉粒。 减数分裂的胞质分裂为同时型，因为减数第一次分裂末期，没有看到两个子核之间有细胞壁 的产生。减数分裂后所形成的四分体呈四面体形。绒毡层细胞发育至顶峰，细胞体积大，细 胞质稠，细胞核大而数目多，中层细胞消失。 单核小孢子期( 图版，1 0 - 1 2 ) ：四分体形成后不久，其骈胝质壁即降解+ 小孢子很快变 圆，其细胞壁薄，细胞质浓厚，细胞核较大，位于细胞的中央部位，核仁明显，绝丈部分靠 近核膜。绒毡层细胞开始解体，其营养物质逐渐被发育中的小孢子利用。药室内壁开始纤维 化增厚。 1 2 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 二核花粉粒时期( 图版，1 3 一1 5 ) ：小孢子不断地从周围的绒毡层中吸取营养和水分，细 胞壁逐渐完整并加厚，体积不断增大，细胞质内出现小液泡，液泡逐渐融合形成较大的液泡。 细胞质和细胞核向侧面移动，小孢子的细胞核移到一侧后，进行一次有丝分裂，形成两个核。 靠近花粉粒壁的核为生殖核，另外一个为营养核。接着发生胞质分裂，形成两个大