（食品科学专业论文）薏米酒酵母菌的选种及其酿造工艺的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：癌邑乱时间：a 如7年6 月压日 导师签名： 时间：棚年多月以瑁 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：韶毛驭时间：寸犯口年6 月心日 导师签名 蝴：川年i ! ；只f 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 利用麦芽培养基，以市售鸭梨、猕猴桃和葡萄为分离源，从其果皮或果肉中分离得 到1 2 6 株酵母菌，经过四次筛选，获得一株来自葡萄的酵母菌株，通过性能测试，证明 该菌株为适宜薏米酒酿造的酵母菌。同时，通过形态和培养特征，酵母假菌丝的观察等 酵母菌鉴定步骤，该菌株最终被鉴定属于酵母属( s a c c h a r o m y c e s ) 。经过测试，该酵母菌 能耐受2 0 的酒精度，p h 为1 的酸度，能在3 5 ( g m l ) 的糖溶液中正常发酵，在6 0 ( g m l ) 的糖溶液中仍能起酵，在薏米酒酿造过程中发酵性能良好，是株适宜酿造薏米保健酒的 酵母菌种。 将自选酵母菌与安琪活性干酵母在温度等酿酒特性上进行比较，结果表明：在3 0 下进行薏米酒发酵，自选酵母发酵性能优于安琪活性干酵母，同时，在此温度下，自选 酵母的起酵时间较早，发酵周期短且发酵效果较好；在加菌量为1 0 时自选酵母酿薏米 酒发酵效果较好：在p h 值为5 时，起酵时间早，发酵效果好。通过感官评定，自选酵 母菌所酿造的薏米酒明显优于安琪活性干酵母所酿的薏米酒。经过气相色谱分析结果表 明：自选酵母所酿造的薏米酒主要酯成分的含量高于安琪酵母所酿造薏米酒中酯含量。 采用三因素三水平正交试验确定了薏米的糖化条件以及适宜自选酵母的薏米酒酿造工 艺参数，并结合压榨工艺以及液态发酵工艺研制出新型薏米保健酒。结果表明薏米最佳 搪化条件为：加水比例为1 ：5 ：糖化p h 值为4 ；糖化时间为1 2 小时；适宜的薏米酒酿 造条件为：发酵温度：3 0 ；加菌量：1 0 ；初始p h 值为5 。自选酵母在此工艺条件 下发酵而成的薏米酒，优于安琪活性干酵母酿造的慧米酒，且薏米酒质量较好。 关键字：蔫米酒，酵母菌，筛选，鉴定，酿造工艺 a b s t r a c t a b s t r a c t u s i n gt h em a l tc u l t u r em e d i u m ，1 2 6s a c c h a r o m y c e t e sw e r es e p a r a t e df r o mt h em a r k e t p e a r ，t h ek i w if r u i ta n dt h eg r a p ew h i c hw e r es o l di nt h ec o m m o nm a r k e t a f t e rs e l e c t i n gb y f o u rg r a d e s ，t h eo n l yo n es t r a i n ，w h i c hw e r es u i t e dt of e r m e n t i n gc o x is e e dw i n e ，w e r eg o t f r o mg r a p e t h i ss t r a i n i d e n t i f i e da ss a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew e r en o tp o i s o n o u st oh u m a n b e i n ga n dc o u l db ea p p l i e dt ot h ep r o d u c t i o no fc o x is e e dw i n e t h i ss a c c h a r o m y c e t ec o u l d e n d u r et h ea l c o h o lc o n c e n t r a t i o no f2 0 ，t h ep hv a l u eo f1 i nt h eo t h e rh a n d ，i tc o u l d f e r m e n ti nt h es u g a rc o n c e n t r a t i o no f3 5 n o r m a l l y a n ds t i l ls t a r tt of e r m e n ti nt h es u g a ro f 6 0 s oi t sp o t e n t i a l t h ep r o p e r t i e so ff e r m e n t a t i o no ft h et w ot r a i n s ，t h es a c c h a r o m y c e t ew eg o ta n da n g l e w e r es t u d i e d c o n c l u s i o n sw e r em a d et h a ta tt e m p e r a t u r eo f3 0 c ，t h ep r o p e r t i e so fo u ro w n c h o o s e ，w a sb e t t e rt h a nt h o s eo fa n g l e ，u n d e rt h i st e m p e r a t u r e ，t h el o g a r i t h m i cs t a g eo fo u r c h o o s ew a ss h o r t e rt h a nt h a to fa n g e l ：s e n s o r ye v a l u a t i o nt e s t e dt h a tt h ek i n d so fw i n e f e r m e n t e db yo u ro w nc h o o s ei n3 0 c w e r eb e t t e rt h a nt h ew i n eb ya n g l e r e s u l t sb yg a s c h r o m a t o g r a p h st e s t e dt h a tt h ec o n t e n t so ft h em a j o rf a v o rs u b s t a n c e si nt h ec o x is e e dw i n e f e r m e n t e dw a sh i 曲e rt h a nt h o s eb ya n g e l o p t i m u mf e r m e n t a t i o np a r a m e t e r so fb r e w i n g p r o c e s s i n gb yt h es t r a i nw a sg a i n e db yo r t h o g o n a lt e s t i tw a sp r o v e dt h a tt h ep r o p e rc o n d i t i o n o f d i a s t a t i ca c t i o ni s ：w a t e rp r o p o r t i o n 1 ：5 ；p hv a l u e ：4 ；t i m e ：1 2h o u r s i tw a sp r o v e dt h a t t h ep r o p e rp a r a m e t e r so ft h es t r a i nw a sa ss a m ea sf o l l o w i n g ：f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ， 3 0 ( 2 ；a d d i t i o no fy e a s t1 0 ；p r i m i t i v ep hv a l u e ，5 b yu s i n gt h ea b o v ec o n d i t i o n s ，t h ec o x i s e e dw i n eb yo u ro w nc h o o s ew a sb e t t e rt h a nt h ew i n e sb ya n g e l k e yw o r d s ：c o x is e e dw i n e ，y e a s t ，s c r e e n ，i d e n t i f i c a t i o n ，b r e w i n gp r o c e s s i n g 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 薏米学名薏苡仁( c o i xl a c r y m a j o b il i n n v a r m a y u e n ( r o m a n ) s t a p f ) 为禾本科药食两 用植物薏苡( c o i xl a c h r y m a - j o b i ) 的种仁，原产缅甸、印度，属一年生或多年生草本 植物，禾本科光合c 4 高产作物。惹米俗称药王米”、“回回米”或“六谷米”，其质地坚实， 断面白色，粉性，气微，味微甜，果仁大而雪白( 全国中草药汇编编写组，1 9 7 6 ) 。薏 苡宿根再生能力强，种一季可收割三年，尤其以第二年产量为高。薏苡性喜晨雾时间长、 昼夜温差大的气候条件。由于惹苡是一种在荒地里也能茁壮成长的谷物，人们充分感受 到薏苡顽强的生命力，因此特意经常食用，因其具有较高的营养价值和独特的药用价值， 自古以来就是声誉卓著的滋补食品。在我国用薏米驱温治病已经有4 0 0 0 多年的历史，长 久以来就被认定是老幼皆宜的保健食品。薏米在我国主要产于福建，全国各地都有种植， 山西在太古等地也有种植，但产量不大。民间对薏米早有认识，一直作为饭食佳肴，并 视其为名贵中药，在药膳中应用很广泛，被列为宫廷膳食之一( 赵晓红，2 0 0 2 ) 。8 0 年 代，薏米食品曾风靡日本、欧洲等地，近年来随着保健食品的风行，在国外，特剐是日 本开发薏米食品已经较为深入和广泛，利用薏米生产出了许多保健食品如药酒、饮料、 调味酱、快食粉等。我国对此也做了大量研究和开发工作。 1 1 研究意义 随着社会的发展、科技的进步，人们对惹米的营养成分已有了系统的研究。据报道， 薏米所含的营养素非常丰富，不仅含蛋白高，而且还富含维生素b 、钙、铁、食物纤维 等，是一种营养平衡的谷物。每1 0 0 9 薏米中含蛋白质1 2 8 9 ，脂肪3 3 9 ，磷2 1 7 m g ，铁 3 6 m g ，这些成分的含量均大大超过稻米，所含蛋白质远比米、面高，同时每l o o g 薏米 含硫胺素0 2 2 m g ，核黄素0 1 5 9 ，尼克酸2 0 m g ，钾2 3 8 m g ，钠3 6 r a g ，钙4 2 r a g ，镁8 8 m g ， 锰1 3 7 9 ，锌1 6 8 m g ，铜0 2 9 m g ，硒3 0 7 m g 。薏米中人体必需的八种氨基酸齐全，其 比例接近人体需要，亮氨酸、酪氨酸含量均高于小麦，脂肪含量为大米和小麦粉的3 - 4 倍。薏米中还含有薏苡素、薏苡酯( o ，2 5 左右) 、薏苡内酯及特有的三萜类化合物等保 健因子，具有易被人体消化吸收的特点，对减轻肠胃负担、增强体质有益。美国一项研 究发现，薏米、蒜头、水田芥等事物含有锗，锗可使大脑得到加氧的效果，让孩子吃的 更聪明( 刘占文，2 0 0 0 ) 。由此可见薏米是名副其实的营养佳品。 薏米中含有药用价值很高的薏八醇及b 叫两种谷兹醇，这些特殊成分对癌细胞有抑制 作用，特别是对胃癌、子宫颈癌、绒毛膜上皮癌有特殊功效，这便是薏米具有抗癌作用 的奥秘所在( 八木晟，1 9 8 9 ) 。惹米还是一种美容食品，常食可以保持人体皮肤光滑细 腻，对于消除粉刺、雀斑、老年斑、妊娠斑、蝴蝶斑，对脱屑、痔疮、龟裂、皮肤粗糙 等有良好疗效。同时经常食用薏米食品对慢性肠胃炎、消化不良等症状也有效果。正常 健康人常食薏米食品，既可化湿利尿，又使身体轻捷，还可减少患癌的几率。医学研究 发现，福含膳食纤维的薏米有预防高血脂、高血压、中风及心血管疾病的功效。研究认 为，每人每天吃5 0 1 0 0 克薏米就可以达到防病的目的。中医理论也认为，薏米性寒，入 脾肺肾经，具有健脾、补肺、清热、渗湿的功能。本草纲目谓薏米“健脾宜胃、补肺 清热、祛风胜湿、养颜驻容、轻身延年”。现代药理认为薏米能抑制癌细胞的增殖，增 强肾上腺皮质功能，升提白细胞血小板，增强免疫力和抗炎作用，降血钙、抑制骨骼肌 收缩，降血糖抗肿瘤。有专家认为其保健美容的功效同冬菇、灵芝相比毫不逊色。 1 2 国内外研究现状 薏米虽然营养价值高，又有药用价值，可是薏米淀粉不容易a 化，食用时必须经过 长时间浸渍后煮沸，而薏米的淀粉颗粒较大，使得对其加工具有一定困难( 吴雪辉等， 2 0 0 4 ) ，加之其具有的特殊气味，使消费者对其具有一定的芥蒂，这就影响了薏米在 食品中的利用，通常薏米作为茶饮用。日常食用时，既可单独煮粥食用，又可和绿豆、 白果等一些常见的食疗保健食品一起煲粥饮用。为了有效的利用薏米中的药效成分，可 将薏米经过水洗、浸渍、加热使薏米中的淀粉充分a 化，与大麦、玉米、大豆等混合， 制成营养丰富薏米大麦粉、薏米饼干、薏米类膨化食品及薏米类咖啡饮料、薏米醋等。 目前，世界上广泛饮用咖啡饮料，其实饮用过多宜得肠胃病和不眠症，且引用咖啡 可能制癌的观点也有人提出。通过特殊方法生产的薏米类咖啡饮料，既有咖啡的风味又 弥补了咖啡的不足，是风味极佳的营养保健饮料，而且原料丰富、价格低廉、加工成本 低。在日本有8 0 的薏米加工成麦茶型薏米茶来消费。薏米焙烤至微黄色，开水沏茶常 饮，有健身美容功效。薏米粉膨化物经烘烤，由于美拉德反应极大的改善了其色香味， 经适当调配即可做薏米茶冲泡饮用。也可作为胶股蓝等固体饮料的赋形剂，取代4 0 5 0 的蔗糖用量，既降低产品甜度又节省成本，这种低甜度饮料更受消费者欢迎。湖南 的研究人员将薏米与酸奶混合发酵，不仅药食互补，更主要的是混合发酵后产生的氨 基酸种类与含量明显增加，可增加发酵液的营养成分。发酵型薏米酸奶作为一种药食两 用的食品有其7 r 发价值，既适应我困人【c 祈的饮食珲念的需要，又能满足功能性保健食 4 沈阳农业大学硕士学位论文 品不断扩大的市场需求，也为我国丰富的薏米资源提供了一条新的开发途径。渤海大学 的研究人员将薏米提取液添加到豆乳中制成薏米豆腐，赋予豆腐薏米特有的清香，增加 了豆腐的营养价值，又改善了豆腐的口感风味，从而为大豆、薏米食品的开发，开辟了 新的途径。 在新加坡，年无季节之分，天气炎热，人们特别注重营养饮食搭配，其中含薏米 的饮料、食品非常之多，薏米饮料可以说是防暑降温的主要产品。有罐装薏米水，有简 装薏米水，也有薏米和其他原料混合制成的食品。最多的由单纯的薏米和白糖混合而成 的饮料。经过科学加工，合理调配，完全去掉了薏米特有的令人不愉快的气味，制成风 味独特的美容保健饮料。由于饮料的消费在饮食中占相当重要的比例，而且薏米饮料易 于加工，如果充分利用好薏米的营养和医用价值，将对人体起到积极的保健作用( 丁纯 笑，周奇文，1 9 9 9 ) 。 以薏米为原料还可以生产糕点、糖果、及食米饭、方便粥、酱油等。只要掌握好薏 米的特性，根据需要采取烘焙、蒸煮及高压湿处理等多种方法，去掉其特殊异味，一定 能生产出更好的保健饮料及其他色、香、味俱全的营养保健食品，从而更好的丰富人们 的生活。 随着生活水平的提高，人们对食品的要求越来越高，不仅要求具有良好的口味，还 要求具有营养保健功能。因此具有保健功能的营养发酵酒是人们酒类消费的一个必然趋 势。传统保健酒常常是一种加工酒，即以其他酒为酒基加入稽液、药材等泡制而成( 康 明官，1 9 9 1 ) 。如竹叶青是在汾酒酒基中浸泡翥叶以取淡绿清香色味而得名，再配以竹 叶、桅子等中草药再利而成。也有薏米酒是利用禾本科作物种子薏仁米直接发酵蒸馏， 采用半固态发酵方式得到低度保健酒。薏米酒也可采用传统方法进行泡制，同时为了提 高其药用价值，也可在发酵中加入杜仲、鸡血藤、木瓜等通筋活络、强身壮体的中草药。 中草药的添加量在5 以下，在发酵时一起添加，随酒醅一起蒸馏。薏米酒中含有多种 营养成分，除了具有薏米的基本功能消炎、利尿、化脓、镇痛、消肿、润肤、美容等功 效，长期饮用还具有抗癌的功效，薏米酒色泽淡黄，荧光自然，酒昧醇厚，麦香味悠远。 由于我国具有广泛的薏米产地，原料充足，价格低廉，因此可以说薏米酒具有广泛的社 会效益和经济效益。 1 3 研究内容及方法 棕七所述，薏米是一种营养成分和药川成分都1 常： 三寓的谷物，而薏米酒更是种 前言 营养丰富的保健饮品。通常传统蒸馏工艺容易造成薏米营养成分的流失，因此为了保持 薏米的营养价值，本研究采用压榨工艺获得原酒同时结合液态发酵工艺，将所选原料的 营养成分及药理成分有效地溶于酒中，并保持天然色香味，避开传统的蒸馏工艺对营养 成分的损失。而后，结合新型白酒工艺勾兑成大众需要的色、香、味、格及其功能性均 佳的薏米营养保健酒。 酵母菌是影响薏米酒香气及营养成分的重要因素，菌种的性能好坏直接营养保健酒 的质量。酒类酵母分为酒精酵母、生香酵母和威士忌酵母。其中生香酵母有较好的产醋 酸及其乙酯的能力，在发酵中可以提高白酒的有机酸和酯的含量，增进酒的香味，是提 高酒质量的有效途径( 熊子书，2 0 0 2 ) 。而目前保健酒生产上常用的酵母菌多为活性干 酵母。它们通常为酿酒酵母，主要有啤酒酵母( s a c c h a r o m u c e sc e r e v i s i a e ) 、葡萄酒酵母 ( s a c c h a r o m v c e s el l i s o i d e n s ) 等( 李玉振译，1 9 8 9 ) 。活性干酵母具有使用方便的优点， 虽然活性干酵母的使用可以简化酵母培养工艺及相应设备，但也存在价格偏高、不易储 藏等缺点。同时，活性干酵母在生产上多是经过好氧培养，因此其厌氧性能、低温发酵 性能及耐乙醇性能等较差( f l e e t h ，1 9 9 3 ) 。在生产中，厂家一般都应使用适合自己产品 特点的酵母菌株，从而使产品性能更优。在薏米酒酿造过程中，由于蕙米本身带有一定 的味道，不容易被所有消费者认同，这使薏米酒在感官质量上尚存在某些缺陷，不能酿 出质量上乘的薏米酒，因此对于惹米酒的研究较少。同时，目前尚无专门适宜薏米酒酿 造的酵母菌株。在以往的研究中，大多数研究者都在工艺上做文章，到目前为止，尚未 见有关于筛选薏米酒酵母菌的报道，这也是本课题的创新点。由于实验采用液态发酵方 式，而液态发酵方式存在容易产生曲霉味和异杂昧的缺点，再加之薏米本身又存在其特 殊气味，因此，本实验在对酵母菌进行筛选时，倾向对生香酵母的筛选。针对薏米本身 的特点，本试验的目的就是选育一株或几株适宜薏米酒酿造的产香酵母，并根据该菌株 的特点确定薏米酒的酿造工艺。 酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物坏境中分离 得到。在成熟水果的果皮、果肉中就有大量的酵母菌存在。除水果果实外，土壤环境中 也有十分丰富的酵母菌，特别是有水果钱渣等的果园土壤巾酵母较多，因此可以从自然 界中分离筛选酵母菌以满足不同生产要求，( 陈陶声，1 9 9 1 ) 。由于薏米本身固有的气 味，钳刘薏米酒酿造需要，所筛选的酵母菌要求有一定的产香性能。除从自然界中筛选 适直的酵m 陶株外，利用现代生物技术，如紫外线诱变、原7 卜赝体融合及克隆技术等对 6 沈阳农业大学顼士学位论文 现有菌株进行改良己成为一热门研究领域( 李剑芳，2 0 0 1 ) 。但是，由于目前消费者对 转基因食品的态度相对保守，加之利用生物技术改造菌株的成本比较昂贵，因此经生物 工程改造的酵母菌株在实际生产上尚不多见。所以，本课题考虑从自然界水果及果皮中 筛选适宜薏米酒酿造的酵母菌株，以期改善薏米酒的质量。 本实验采用液态发酵方式进行薏米酒酿造。由于薏米淀粉颗粒较大，使薏米淀粉糖 化过程相对较难。因此，本研究对薏米酒液态发酵过程进行摸索，特别是对于薏米淀粉 糖化条件进行研究，同时，利用正交实验，对发酵过程中的工艺参数进行研究，以期酿 造出兼具营养与口感的新型薏米保健酒。 对于对一种新型的食品来讲，最常用的评价方法是感官评定( 中国食品工业标准汇 编饮料酒卷，2 0 0 1 ) ，随着科学的发展，气相色谱逐渐被用于食品中各种理化指标的测 定，但因为理化分析和感官评定的结果还有着一定的距离，所以在酒质量的评定中，常 以感官尝评为主，根据评比酒样得分多少来决定其等级和名次，随着色谱分析的逐渐普 及，依靠色谱分析作为感官评定已经成为酒的质量评定中的一个重要辅助手段( 熊子书， 1 9 9 8 ) 。故在本研究中对薏米酒的质量评价主要运用了感官评定。对于最终产品，利用 气相色谱进行了测定，目的是为了验证感官评定与气相色谱测定的结果是否吻合。本研 究的主要内容包括以下几个方面： ( 1 ) 从葡萄，鸭梨，猕猴桃果肉及果皮中分离酵母菌； ( 2 ) 根据薏米酒酿造要求对分离出的酵母菌进行筛选； ( 3 ) 以安琪活性干酵母为对照，测定所筛选酵母的发酵性能特征； ( 4 ) 对所筛选的酵母菌进行鉴定； ( 5 ) 确定所筛选出的酵母菌发酵薏米酒的适宜工艺参数。 通过对不同来源的酵母菌的筛选，选育出一株或者凡株适宜酿造薏米保健酒的酵母 菌种，并将菌种应用于薏米保健酒的液态发酵工艺中，同时结合压榨工艺，研制出新型 薏米保健酒，以达到使薏米的营养成分在酒中充分发挥的目的。 本实验技术路线为： 前言 采样 l 菌种分离 i 初级筛选 ( 测定菌活力、发酵能力及产酯能力等) i 复筛 ( 测定耐酒精、高温及低温发酵性能、耐酸性) l 鉴定 ( 形态和培养特征、酵母假菌丝以及子囊孢子的观察) i 自选酵母发酵性能测试及薏米酒的酿造 ( 正交实验) i 薏米酒感官评定 l 薏米酒营养成分测定 实验欲达到以下结果： ( 1 ) 筛选出适宜酿造薏米保健酒的酵母菌种； ( 2 ) 确定新型薏米保健酒酿造工艺。 沈阳农业大学顼士学位论文 第二章材料与方法 2 1 实验材料 发酵原料：薏米( 市售) 糖化剂：a 一淀粉酶( 活力单位2 0 0 0 单位信) 糖化酶( 酶活力5 万单位g 发酵剂：自选酵母( 分自市售鸭梨，称猴桃以及葡萄) 安琪活性干酵母( 麦汁活化培养) 产酯筛选培养基：用1 0 的麦芽汁配成5 的蔗糖溶液，分装试管，于1 2 1 c ，灭菌 1 5r a i n s ( 周德庆，1 9 8 6 ) 。 性能测试培养基( p d 营养液) ：马铃薯葡萄糖培养基，用于酵母菌耐糖性能的测试。 称取马铃薯3 0 0 9 ，去皮，切块，加水1 l ，煮沸2 0 m i n s ，过滤，加入葡萄糖2 0 0 9 ，加 水至1 l ，于1 2 1 ，加热2 0 m i n s ，分装三角瓶备用( 熊子书，2 0 0 2 ) 。 玉米粉琼脂培养基：用于酵母菌假菌丝的观察。 将1 2 5 9 黄玉米粉溶于3 0 0 l m l 水中，搅匀，以6 0 热水浴加热1 小时，滤纸过滤，滤 液加水调至3 0 0 m l ，加入琼脂3 8 9 ，于1 2 16 0 ，灭菌1 5 m i n s ，趁热用脱脂棉过滤，分装试 管，然后在1 1 2 c 下，灭菌1 5 m i n s ，倒平板备用( 周德庆，1 9 8 6 ) 。 产子囊孢子培养基( e y n 氏培养基) ：分别称取醋酸钠，9 8 9 ；d 一葡萄耱，1 o g in a c i ， 1 2g ：七水硫酸镁，0 7 9 ；干酵母浸出物，2 5 9 ；琼脂，2 0 9 。将上述物质浴于1 l 蒸馏水 中，然后在1 2 0 下，灭菌1 5 m i n s ，制成斜面备用( 周德庆，1 9 8 6 ) 。 其他化学试剂：乙醇；甘油三酯标准液( 2 2 6 m m o l l ) ；异丙醇；正庚烷；k o h ； 乙酰丙酮；冰醋酸；无水醋酸铵：过碘酸钠。以上试剂均为分析纯。 主要仪器设备： 分光光度计( 7 2 0 型) ：龙尼柯( 上海) 仪器有限公司； h g 3 0 3 恒温培养箱：南京实验仪器厂； d l - c j 2 v 医用型洁净工作台； h g l 0 1 一i a 型电热鼓风干燥箱：南京实验仪器厂； 显微镜：日本o l y m p u s ； 恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器厂： 材料与方法 p h 0 0 4 型电子天平：上海精科天平有限公司； p h s 3 c 型精密p h 计：上海雷磁仪器厂 另外，还有杜氏小管、酒精蒸馏设备、酒精比重计、发酵罐、血球计数板、目镜测 微尺、镜台测、微尺容量瓶、比色管等。 2 2 方法 2 2 1 酵母菌的分离 ( 1 ) 分离源的采集：分别从市售的鸭梨、葡萄、猕猴桃的果皮或果肉中采样，并分离。 ( 2 ) 分离方法：采用富集培养法，以灭菌麦芽汁培养基为富集培养基，2 5 c 恒温培养 3 天后，进行扩大培养，通过梯度浓缩后，在灭菌的麦芽汁琼脂培养基上用稀释平板法 进行分离，待长出菌落后，选择具有典型酵母菌特征的单个菌落进一步划线分离2 3 次， 经镜检为纯种后，分别移植单个菌落于麦芽斜面上保存待用。为了保持酵母的活性，每 隔两个月转接一次。 2 2 2 酵母菌的筛选( 宋安东，吴云汉，2 0 0 2 ；孙尤海等，1 9 9 4 ；王俊沪，2 0 0 1 ；刘 素纯，1 9 9 8 ) ( 1 ) 一级筛： 筛选方法：杜氏小管发酵法； 筛选标准：在规定时间内菌种产气泡的大小及多少； 筛选过程：2 59 c 下将菌种接种在液态麦芽培养基中，发酵4 8 4 时，发酵过程中不 断观察，进行记录； 接种量：1 0 试验重复三次。 f 2 ) - - 级筛： 筛选方法：薏米汁发酵法； 筛选标准：菌种产酒精度的大小： 筛选过程；2 5 。c 下将菌种接种于薏米汁中发酵4 天，测其产酒精度大小； 接种量：1 0 ： 试验重复三次。 ( 3 ) 三级筛： 筛选方法：杜氏小管法； 沈阳农业大学硕士学位论文 筛选标准：菌种耐乙醇性能、耐酸性能； 筛选过程：将酵母菌分别接入含不同乙醇浓度梯度( 1 0 - 1 5 ) 、不同p h 值( o 9 8 ， 1 5 0 ，2 0 4 ，2 7 2 ，4 0 3 1 的薏米汁中，2 5 下，培养一周，观察 杜氏小管中的气泡情况并进行记录。 接种量：1 0 ； 试验重复三次。 ( 4 ) 四级筛： 筛选方法：试管发酵法，嗅觉判断其产酯能力； 筛选标准：测定酵母菌的产酯性能； 筛选过程：用l o f l _ 勺麦芽汁配成5 ( g ，m l ) 的葡萄糖溶液，接入新培养的酵母菌， 在2 5 下，培养3 巧天。打开试管塞，轻轻摇动试管，用嗅觉判断是 否有酯类香气。 接种量：1 0 ； 试验重复三次。 2 2 3 酵母菌的鉴定 酵母鉴定方法参考 t h ey e a s t ：at a x o n o m i cs t u d y ) ) ( 第三版) ( 1 ) 形态与培养特征的观察 经过四级筛选后，将筛选出的菌种接种到麦芽汁液体培养基中，2 5 0 下，于恒温培 养箱中培养2 巧天，观察其是否发酵、培养液的清浊情况，并用水浸法制片于显微镜下 观察，以目镜测微尺和镜台测微尺测其营养细胞的大小。将酵母在麦芽汁琼脂培养基平 板上划线培养，2 5 0 ，培养2 3 天，待长出菌落，观察其菌落形态特点并记录。 ( 2 ) 酵母假菌丝的观察 将筛选出的菌种进行活化，活化后划线于玉米粉琼脂培养基平板上，每个平板划2 0 条，在菌线上面盖以无菌盖玻片，2 5 培养4 8 天。镜检是否有假菌丝产生。 ( 3 ) 酵母菌子囊孢子的观察 将保存在在麦芽汁培养基上的菌株，于2 5 下，重新培养1 2 天进行活化。将已活 化好的酵母在产孢子培养基斜面上划线，2 5 。c 培养2 天，镜检是否有子囊孢子产生。如 未见孢子则需继续培养，并保持3 6 周，每周再检查是否出现子囊孢子。注意观察于囊 与子囊孢子的形状，饱予是否有颜色，并进行记录。 材料与方法 2 2 4 自选酵母发酵性能的测试( 曲晓凤等，1 9 9 9 ；王岁楼，1 9 9 7 ；高h 渝，陈孝廉， 1 9 9 9 ) 菌种活化：自选酵母先在盛有5 m l 的麦芽汁的试管中2 5 。c 培养l o d , 时，然后转入盛 有薏米汁的三角瓶中继续扩大培养1 0 小时； 活性干酵母的活化：3 5 4 0 。c 的温水，加入5 的蔗糖，再加入1 0 的干酵母，小心 混匀，静置，每隔1 0 分钟轻轻搅拌一次，经2 0 一3 0 分钟，接入斜面，待用。进行发酵试 验时再进行活化，活化方法与自选酵母活化方法相同。 2 2 ，4 1 不同 盈度条件下自选酵母的发酵性能测试( 以安琪活性干酵母为对照) 将筛选出来的酵母菌与安琪活性干酵母分别于2 0 。c ，2 5 。c ，3 0 三个温度下进行薏 米酒发酵，对酵母菌在不同温度下的生长情况，产酸情况，产酒精情况，降糖情况进行 测试。接种量为1 0 ，实验重复三次。 测试项目：菌数，起酵时间、含糖量、含酒精量以及发酵液的p h 值。 操作方法：从接种开始，每隔1 小时观察一次，看是否有气泡产生，以此来判断起 酵时间：每隔2 4 d 时用血球计数板测定发酵液中的酵母数，并以此来绘制酵母菌生长曲 线；与此同时用酒精计测定其酒精度，用p h 计测定其p h 值。 2 2 4 2 酵母菌耐糖性能的测试 用p d 营养液配制含蔗糖浓度为2 0 m b 9 0 咖l 的发酵液，分装于三角瓶，每 个三角瓶装2 0 0 m l ，并接种已活化好的酵母菌，2 5 c 培养三天。观察并记录每个三角瓶 的起酵时间、产生气泡情况，接种量为1 0 。试验重复三次。 测试项目：起酵时间；发酵结束时的酒精度。 2 2 5 薏米酒酿造工艺的确定 2 2 5 1 薏米糖化条件的确定 由于糖化条件对于发酵结果好坏具有决定性影响，而对于薏米糖化条件显有报道， 因次，根据薏米淀粉特征以及糖化酶糖化温度要求，采用正交实验，确定糖化过程条件。 实验方法：将薏米粉碎，以1 ：3 l ：5 的比例加水。加热，调节温度至6 0 。c ，p h 值至 5 7 ，加入a 一淀粉酶( 1 0 单位秘，继续加热至9 0 c ( 保持温度半个小时) ，降温至6 0 。c ， 调d h 4 - 5 加糖化酶。糖化8 1 2 小时，糖化过后，对其糖度进行测定，从而确定糖化条 件。所以，本实验采用三水平三因素正交实验，其中加水比例( a ) 设为1 ：3 ，1 ：4 ，1 ：5 三 个水t r 糖化p h 值( b ) 设为8 ，1 0 ，1 2 三个水平；糖化时问( c ) 设为4 。4 5 ，5 三个水 沈阳农业大学硕士学位论文 平。试验用l 9 ( 3 ) 4 正交表安排设计并进行糖化实验，以期寻找薏米糖化过程中的适宜条 件。实验因子水平对照表见表1 ，b ( 3 ) 4 试验方案见表2 。 表1 试验因子对照表 t a b l c h e c k o f e x p e r i m e n t a l f a c t o r s 2 2 5 2 自选酵母酿造薏米酒的工艺确定 薏米酒酿造工艺：薏米粉碎一糖化一接种一发酵一出坛一压榨一过滤一勾兑一过滤 一装瓶一贮藏 ( 1 ) 薏米粉碎：薏米粉碎后，使原料成本大大降低，同时粉碎成细粉后，增加了表面 积，减少了用菌量，提高了薏米淀粉利用率，更提高了出酒率。 ( 2 ) 薏米酒的液态发酵：薏米粉醉后加入相应比例的水、a 淀粉酶液化，然后把液化 液升温灭酶后冷却，之后加入糖化酶，拧制p h 、温度，糖化结束后加入酵母，进行发酵。 材料与方法 采用全液态化生产方式不但省却了浸米、洗米、蒸饭、淋饭工序，消除了大量污水的产 生，既节能降耗又环保，物料在生产过程为液态，可采用封闭生产和输送，不但提高劳 动生产率和改善工人的劳动条件，也符合现代化大生产流程和食品卫生法的要求。 ( 3 ) 压榨：压榨得到酒液，置于低温下静置2 0 天，取出上层清液再进行压榨过滤， 滤得的酒液与上述上层清液合并。液态发酵与压榨工艺的结合，使薏米酒出酒率得到很 大提高，酒液澄清，同时减少煎酒和蒸馏过程中薏米营养成分的损失，使薏米中的营养 成分得到最大程度的保留。 ( 4 ) 勾兑：发酵完毕经保存一段时间的薏米原酒。逐渐趋向老熟，酒味变得醇和起来， 可以对原酒的酒度、风味等进行调配。 ( 5 ) 装瓶，杀菌：装瓶前，酒瓶预先经过灭菌处理，再装瓶密封，在6 0 7 0 。c 温度下 杀菌l o ，1 5 分钟。也可采用瓶前杀菌，若装瓶前杀菌，将酒液快速升温到9 0 ，持续一 分钟，即可装瓶密封。 2 2 5 3 自选酵母发酵条件的确定 由于生香酵母发酵的适宜温度在2 0 c 一3 0 。c 的范围内，发酵的最佳p h 值大致3 5 4 5 ( 王岁楼等，1 9 9 7 ) 。同时，为了不影响酒的风味，加菌量不宜过大，一般控制在1 0 - 2 0 。 所以本试验温度( a ) 设为2 0 。c ，2 5 。c ，3 0 。c = 个水平：加菌浓度( b ) ，设为1 0 、1 5 、2 0 三个水平，初始p h 值( c ) 设为3 ，4 ，5 z 个水平。试验用l9 ( 3 ) 4 正交表安排设计并进行发 酵试验，以期寻找酿造薏米酒的适宜酿造工艺条件。将薏米酒进行陈酿后对所酿制的薏 米酒进行感官评定。试验因子水平对照表见表3 ，b ( 3 ) 4 试验方案见表4 。 表3 试验因子对照表 t a b 3 c h e c k o f e x p e r i m e n t a l f a c t o r s 4 沈阳农业大学硕士学位论文 2 2 6 薏米酒的感官评定 ( 1 ) 分析型感官评定 本试验中，分析型感官评定主要用于薏米酒适宜酿造工艺的确定，对自选酵母菌酿 造的薏米酒进行感官评定。评定项目有色泽、透明度、香、昧、风味评分标准见表5 。 表5 薏米酒感官评分标准表 t a b 5 s t a n d a r d so fa p p r a i s a lo ns e m e nc o i x w i n e ( 2 ) 嗜好型感官评定 材料与方法 选1 0 名评审员，按顺序法( r a i l l ( i n g m e t h o d ) ( 李里特，2 0 0 1 ) 对薏米酒进行嗜好型感 官评定。按照问卷形式，对2 个样品进行评价并写出自己喜欢的顺序，品尝时采用随机摆 放的方法。嗜好型感官评定表格格式如下： 2 2 7 薏米酒气相色谱分析 采用气相色谱法对薏米酒中主要酯成分进行测定。 2 2 8 薏米酒中薏苡酯的测定( 化学法) 据有关资料报道，薏米中主要药用成分为薏苡酯，有抗癌作用，含量为o 2 5 ( 陈 建白，2 0 0 2 ) ，而其中甘油三酯占8 5 以上( 李大鹏，1 9 9 9 ) 薏苡酯( c o i x e n o l i d e ) 系从禾木科植物薏苡的种仁中提取的不饱和脂肪酸酯( 刘永， 2 0 0 2 ) 。化学名称为1 - 甲基2 ( 顺9 十六碳烯酰氧) 丙基反1 1 十八烯酸酯，( 1 - m e t h y 1 - 2 ( c i s - 9 - h e x a d e c e n o y l o x y ) p r o p y l 1 1 o c t a d e c e n o a t e ) 。 2 2 8 1 试剂的配制 ( 1 ) 抽提液：7 0 m l 异丙醇与5 0 m l 正庚烷混合，然后再加入1 0 m l 蒸馏水。 ( 2 ) a 液：称取2 5 9 k o h 溶于8 0 m l 蒸馏水中，溶解后加入等量的异丙醇，加入3 m l 乙酰丙酮，再用异丙醇稀释至5 0 0 m l 。 o ) b 液：称取8 9 无水醋酸铵溶于5 0 0 m l 蒸馏水中，而后加入6 5 m l 冰醋酸，再加 入过碘酸钠o 0 6 5 9 ，溶解后用蒸馏水稀释至1 0 0 m l 。 ( 4 ) 标准液：甘油三酯标准液( 2 2 6 m m o l l ) 2 2 8 2 测定方法 ( 1 ) 空白、测定和标准管分别加o 1 m l 水、待测薏米酒和标准液，再向f ；i 两管各加1 5 m l 抽提液，标准管加o 1 m l 水和1 4 m l 抽提液，振摇1 r a i n 。 ( 2 ) 待分层后各吸取o 2 m l 上清夜置于另外三支标明空白、测定和杯准管中，各管加 a 试剂2 m l ，6 0 水浴5 分钟。 ( 3 ) 各管冉加b 试剂o 5 m l ，充分混合，6 0 c 水浴1 5 分钟。冷却后，7 2 0 分光光瞍计 ( 4 2 0 n m ) 测定。 沈阳农业大学硕士学位论文 2 2 8 3 计算 甘油三酯浓度( m m o l l ) = 测定管吸光度标准管吸光度标准管浓度 2 2 9 薏米酒中甲醇含量的测定 甲醇对人体危害极大，人吸n 1 l o g 甲醇可引起严重中毒，而且在体内有积蓄作用 不易排出体外。国家标准规定对以谷类为原料的酒，甲醇含量不得大于0 0 4 9 m l ，其中 对3 5 4 0 度低度白酒，甲醇含量不得大于0 2 3g m l - - o 2 7 9 m l ；以薯类及代用品为原料的 酒，甲醇含量不得大于1 ，2 9 m l ；葡萄酒中的甲醇含量不得大于0 8 9 l ( 中国食品工业标 准汇编饮料酒卷，2 0 0 1 ) 。 结果与分折 第三章结果与分析 3 1 酵母菌的分离 从市售的鸭梨、葡萄、称猴桃的果实及果皮中共分离得到酵母菌1 2 6 株。结果见表6 。 表6 酵母营分离结果 ， t a b 6 r e s u l t so f s e l e c t i n g y e a s t s 3 2 酵母菌的筛选 为了得到适宜薏米酒酿造的优良酵母菌种，对分离得到的1 2 6 株酵母菌根据不同标 准进行四个级别的筛选。 3 2 1 酵母菌一次筛 表7 杜氏小管产气情况 t a b 7 r e s u l t so f p r o d u c i n gg a s 沈用农业大学硕士学位论文 由上表可以看出，酵母菌在含有杜氏小管的试管中，2 5 ( 2 ，发酵2 4 d 时，能产气达 到杜氏小管体积的一半或一半以上的酵母菌有1 6 株，打开棉塞摇动试管，该1 6 株菌株均 能嗅到淡淡的酒香，说明这些菌株能在厌氧条件下能较快地起酵并产生酒精和二氧化 碳，因此将此1 6 株菌进行下一步的筛选。 3 2 2 酵母菌二次筛 将一级筛得到的1 6 株菌在盛有2 0 0 m l 的慧米汁的三角瓶中，2 5 ，发酵2 天，测其 酒精度，并进行感官评定。结果如表8 。 袭8 酵母菌产酒糟度情况 t a b 8 r e s u l t so fp r o d u c i n ga l c o h o l 产酒精度( v v ) ( p r o p 。n 。ao f a l c o l a 0 1 ) 菌株数 ( q u a n t i t y o f y e a s 曲 4 4 5 5 6 6 由上表可以看出，其中酒精度大于6 ( v v ) 的酵母菌有4 株，酒精度在5 6 的酵 母菌有5 株，在4 一5 的酵母菌有2 株，其余5 株的酒精度均小于4 ，也就是说酒精得率 大于5 的酵母菌有9 株，而酒精度小于5 的酵母菌产酒性能较差。对酒精得率大于5 的9 株酵母菌所酿造的薏米酒的感官评定，结果可以概括为：酒香浓郁，产酒精性能好， 典型性较好，因此，对该9 株菌进行进一步的筛选。 3 2 3 酵母菌三级筛 上述9 株菌在不同浓度的乙醇、p h 值的薏米汁中产气情况见表9 1 0 结果与分析 表9 酵母菌在不同浓度乙醇中的产气情况 t a b 9 r e s u l t so f p r o d u c i n gg a si nd i f f e r e n ta l c o h o lc o n c e n t r a t i o n s 由表9 可以看出，在这9 株酵母菌中能耐受2 0 酒精度的有3 株。由于对酵母菌耐 酒精度过低会影响发酵效果，故将此3 株菌用于下一步的耐酸筛选。 由于生香酵母所用的培养液需要一定量的有机酸，以利于生香酵母的生长和酯类物 质的生成( 熊子书，2 0 0 2 ) 。生香酵母发酵适宜的p h 值在3 5 5 5 的范围内，故对该3 株酵母进行耐酸度筛选的范围为p h 3 5 5 5 ，结果见表1 0 。 由表1 0 可以看出，上述3 株酵母菌均能耐受p h 4 5 的酸度，其中有1 株酵母还能 耐受p h l 的酸度，由此说明，此3 株菌均符合生香酵母的要求，具有较强的耐酸性，因 此将该三株菌株再进行进一步筛选。 沈踞农业大学硕士争位论文 4 5 3 0 3 ，2 4 酵母菌四级筛 产香酵母应具有较强的产酯能力，所以选择酵母的标准之一是在同等条件下有较强 的产酯能力，产酯能力的强弱主要依靠嗅觉判断。本试验对j ：述3 株酵母菌进行了产酯 筛选，结果如表1 1 。 3 2 3 o 2 3 0 l 1 3 d o l 1 3 o o 0 l 1 j i l 2 l 2 3 1 2 3 4 1 2 3 4