（食品科学专业论文）马铃薯淀粉制备磷酸寡糖的研究.pdf

t，、r_摘要磷酸寡糖( p h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s ，p o s ) 是指麦芽低聚糖中的葡萄糖残基与磷酸根通过共价键连接的一种新型功能性低聚糖，由麦芽三糖至麦芽六糖组成。具有抗龋齿、抗淀粉老化等多种特性，其最突出的生理功能是抑制不溶性钙盐的形成，促进人体对钙质的吸收，它是一种天然安全、应用广泛的新型糖类。磷酸寡糖的概念最早是由日本学者k a m a s a k a ，h 等于1 9 9 5 年提出的，目前日本已有磷酸寡糖的商业化产品问市，而我国对其重视较晚，当前对其生产制备研究尚属空白，因此，完善制备磷酸寡糖的相关理论研究，具有重要的现实意义。本研究以马铃薯淀粉为原料，采用全酶法并借以喷射液化工艺制各低d e 值的麦芽低聚糖浆，采用高效阴离子交换色谱法( 啪c p a d ) 测定所制各样品的糖分组成，离子树脂交换法从中分离制备磷酸寡糖，最后，。采用薄层层析法和i - i p a e c p a d法对其进行定性分析，红外光谱法进行结构分析。通过对其制备工艺的研究，为早日实现磷酸寡糖的工业化生产奠定坚实的理论依据。本文通过低压蒸汽喷射液化技术制备低d e 值的麦芽低聚糖浆，具体操作过程为：在配料罐里注入水，投入淀粉搅拌到浆料浓度为1 0o b e ，然后加入o 6 o 7k gc a c h 做为酶活促进剂，将浆料调至p h 值为5 4 ，加入1 0 0m l 新型耐高温a - 淀粉酶。料液搅拌均匀后，用泵将物料泵入喷射液化器，在喷射器中进行喷射液化，喷射温度1 1 0 ，并维持钆8r a i n ，控制出料温度为9 5 9 7 。喷射液化后的料液进入层流罐，在9 5 条件下保温3 0r a i n ，碘试反应显碘本色时，通蒸汽灭酶。将液化液进行一次板框压滤，开始压力应不低于0 6m p a ，待滤饼形成阻力增大时再增加压力，但以不超过2m p a为宜。将料液冷却至6 0 进行糖化操作，向糖化罐中加入1 0 0m l 真菌淀粉酶和5 0r n l普鲁兰酶，调节p h 值为5 2 ，反应2 4h ，然后通入高压蒸汽1 0 0 条件下灭酶2 3h 。糖化后糖液随着管道进入脱色罐，脱去糖液所含的色素以及部分无机盐，随后活性碳随同糖液一并进入板框压滤机，经过压滤除去活性碳。通过h p a e c p a d 法测定所制备的低聚糖浆的糖分组成，结果表明：样品中含有葡萄糖及麦芽二糖至麦芽七糖，其中葡萄糖含量甚微，以麦芽二糖至麦芽五糖居多，说明该工艺所制备的低聚糖浆符合分离制备磷酸寡糖对糖组分的要求。本课题在分离操作过程中，考察了d 2 0 1 大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、d 3 1 5 大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂以及2 0 1 x 4 强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂三种树脂对磷酸寡糖的分离效果。结果表明：在一定的洗脱条件下，d 2 0 1 、d 3 1 5及2 0 1 x 4 对磷酸寡糖的洗脱收率分别为6 5 4 、7 6 3 和8 9 4 ，2 0 1 x 4 强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂对磷酸寡糖的分离效果最好。通过考察不同洗脱剂浓度及洗脱速率对磷酸寡糖分离效果的影响，确定了最佳洗脱条件：经去离子水洗脱中性糖后，以0 4m o l l n a c l 为洗脱液洗脱磷酸寡糖，洗脱速度为1 4m l r n i n 进行洗脱，并通过苯酚硫酸法进行检测，收集出峰管，即为所要磷酸寡糖粗品。采用薄层层析( t l c ) 及h p a e c p a d 法对所制备磷酸寡糖进行定性分析，证实磷酸寡糖为结合有磷酸根的麦芽低聚糖混合物，聚合度为2 7 ，以麦芽三糖至麦芽六糖组分居多。最后采用红外光谱法对其进行基团结构分析，经过对谱图进行分析，结果表明该物质为结合有磷酸根的寡糖类物质，即磷酸寡糖。关键词：磷酸寡糖，制备，分离，定性分析，结构分析a b s t r a c t sp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e sw a san e wk i n do ff u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d eb yc o n n e c t i n gg l u c o s er e s i d u eo fo l i o s a c c h a r d e 、蕊也p h o s p h a t er a d i c a lt o g e t h e rb yc o v a l e mb o n d ，w a sc o m p o s e do fm a l t o t r i o s et om a l t o h e x a o s e ，i th a dm a n yc h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha sn od e n t a lc a r i e sa n da n t is t a r c ha g i n ge t c a m o n gw h i c ht h eo u t s t a n d i n gp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sw e r ei n h i b i t i n gf o r m a t i o no fi n s o l u b l ec a l c i u mp h o s p h a t ea n dp r o m o t i n ga b s o r p t i o no fc a l c a r e o u s i tw a san e wc a r b o h y d r a t ew h i c hw a sn a t u r a l ，s a f ea n dw i d e l yu s e d t h ec o n c e p to fp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d ew a sm o s te a r l yp r o p o s e db yj a p a n e s es c h o l a r sn a m e dk a m a s a k a , h i n19 9 5 a tp r e s e n t , c o m m e r c i a lp r o d u c to fp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d eh a da l r e a d yo c c u r r e di nt h em a r k e ti nj a p a n ，h o w e v e r , t h ea t t e n t i o no fc h i n at op h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d ei sr e l a t i v el a t e r , t h e r ew e r en os t u d yo np r o d u c t i o np r e p a r a t i o no fp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e ，t h e r e f o r e ，p e r f e c t i n gt o w a r d sr e l e v a n tt h e o r e t i c a lr e s e a r c hh a di m p o r t a n tr e a l i s t i cm e a n i n g s m a l ts y r u po l i g o s a c c h a r i d ew i t hl o w e rd ev a l u ew a sp r e p a r e db yf u l l ye n z y m a t i cm e t h o da n dj e tl i q u e f a c t i o np r o c e s st h r o u g ht a k i n g p o t a t os t a r c ha sm a t e r i a l c o m p o s i t i o no fc a r b o h y d r a t eo fp r e p a r e ds a m p l ew a sd e t e r m i n a t e db yh p a e c - p a d p h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d ew a ss e p a r a t e db yi o ne x c h a n g er e s i n s ，a tl a s t ，q u a l i t a t i v ea n a l y s i sw a sd e v e l o p e db yt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) a n dh p a e c p a d a n a l y s i e dt h es t r u c t u r eo fp o sb yi n f r a r e ds p e c t r o s c o p i cm e t h o d t h es t u d yo fp r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yp r o v i d eas o l i dt h e o r e t i c a lb a s i sf o ri m p l e m e n t a t i o no fi n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e i nt h es t u d y , m a l ts y r u po l i g o s a c c h a r i d e w i t hl o w e rd ev a l u ew a sp r e p a r e db yl o w - p m s s u r ei n j e c t i o nl i q u e f a c t i o nt e c h n o l o g y , c o n c r e t eo p e r a t i o nt e c h n o l o g i e sw e r ea sf o l l o w s ：a d d i n gw a t e rt om a t e r i a l c o m p o u n d 跳s l u r r yd e n s i t yw a sa d j u s t e dt o10o b ea f t e ra d d i n gs t a r c h ，s u b s e q u e n t l y , o 伽7k gc a c l 2a se n z y m ea c t i v i t ya c c e l e r a t o rw a sa d d e d ，a d j u s t i n gp hv a l u eo fs l u r r yt o5 4 ，t h e nn e wa - a m y l a s eo flo o m lw i t hh i g ht e m p e r a t u r er e s i s t a n c ew a sa d d e d m a t e r i a lw a sp u m p e di n t oi n je c t i o nl i q u e f i e ra f t e rs t i r r i n gu n i f o r m l y , t h ep a r a m e t e r so fi n j e c t i o nl i q u e f i e rw e r e ：i n j e c t i o nt e m p e r a t u r eo f110，t i m eo f4 - - 8r a i n ，d i s c h a r g et e m p e r a t u r eo f9 5 - 9 7 ，a d d i n gs o l i dt ol i q u i da f t e ri n j e c t i o nl i q u e f a c t i o nt ol a m i n a rf l o wt a n k , i tw a sh o l d e di n9 5 f o r3 0 m i n e n z y m ew a si l li n a c t i v a t e db ys t e a mw h e nt h ec o l o ro fi o d i n et e s tr e a c t i o np r e s e n t e dn a t u r a lc o l o ro fi o d i n e m e a n w h i l e ，p l a t e - f r a m ep r e s s u r ef i l t r a t i o nw a sp e r f o r m e dk e e p i n gi n i t i a lp r e s s u r ea tl o w e rt h a n0 6m p al e v e l ，i n c r e a s e dg r a d u a l l yp r e s s u r et on o te x c e e d2m p aw i t ht h ei n c r e a s i n go ff o r m a t i o nr e s i s t a n c eo ff i l t e rc a k e ，s o l i dt ol i q u i dw a sc o o l e dt o6 0 ，t h e nw a ss a c c h a r i f i e d ，a d d i n gf u n g a la m y l a s eo f10 0m la n dp u l l u l a n u s eo f 5 0m lt os a c c h a r i f i c a t i o np o t ，p hv a l u ew a sa d j u s t e dt o5 2f o rr e a c t i o no f2 - 4h s u b s e q u e n t l y ,e n z y m ew a si n a c t i v a t e di n10 0 f o r2 3 hb yh i g hp r e s s u r es t e a m s u g a rs o l u t i o na f t e rs a c c h a r i f i c a t i o ne n t e r e di n t ob l e a c h i n gt a n ka l o n gt h ep i p e l i n e ，p i g m e n ta n ds o m e i n o r g a n i cs a l tw e r es t r i p e dd o w n , a c t i v a t e dc a r b o nw a sr e m o v e du s i i l gp r e s s u r ef i l t r a t i o nb ya l l o w i n ga c t i v a t e dc a r b o ne n t e r i n gp l a t ea n df l a m ef i l t e rp r e s st o g e t h e rw i t hs u g a rs o l u t i o n s u g a rc o m p o s i t i o no fo l i g o s a c c h a r i d es y r u pp r e p a r e dw a sd e t e r m i n e du s i n gh p a e c - p a dm e t h o d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：，t h es a m p l ec o n t a i n e dg l u c o s e ，m a l t o s et om a l t o h e p t a o s e ，a m o n gw h i c hc o n t e n t so fg l u c o s ew a sl o w e ra n dm a l t o s et om a l t o p e n t a o s ew e r eh i g h e r ,w h i c he x p l a i n e do l i g o s a c c h a r i d es y r u p ，p r o d u c t e db ya b o v ep r o c e s s ，a c c o r d e d 证t hr e q u i r e m e n t so fs u g a rc o m p o n e n ti n t h ep r o c e s so fs e p a r a t i o na n dp r e p a r a t i o no fp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s e p a r a t i o ne f f e c t so fd 2 01 、d 315a n d2 01x 4o np h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d ew e r es t u d i e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a te l u t i v er a t i o n sw e r e6 5 4 、7 6 3 a n d8 9 4 ，r e s p e c t i v e l y s e p a r a t i o ne f f e c to f2 01x 4o np h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a f i d ew a st h eb e 鸭b yi n v e s t i g a t i n gt h es e p a r a t i o ne f f e c to fe l u e n tc o n c e n t r a t i o na n df l o wr a t eo np h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e ，t h eo p t i m u me l u t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：a f t e rn e u t r a ls u g a rw a se l u t e db yd e i o n i z e dw a t e r ，e l u t i n gt h ep o sb y0 4m o l ln a c la tt h es p e e do f1 4m l m i n ，c o l l e c tt h ee l u e n ta n dt e s t e db yp h e n o l s u l f e r i ca c i dm e t h o d p o sw a sa n a l y s i e db yt l ca n dh p a e c - p a dm e 也o d n 圮r e s u l t ss h o w e dt h a tp o sw a sm a l t o o l i g o s a c c h a r i d e sw h i c hc o n b i n e d 丽t hp h o s p h a t eg r o u p ，a n di t sd pr a n g ew a s2 0 ，m a l t o t r i o s e ，m a l t o t e t r a o s e ，m a l t o p e n t a o s ea n dm a l t o h e x a o s ew e r et h em o s to ft h ec o m p o n e n t s a n a l y s i e dt h eu n i ts t r u c t u r eo fp o sb yi n f r a r e ds p e c t r o s c o p i cm e t h o d 1 1 1 ea n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em a t e r i a lw a sak i n do fo l i g o s a c c h a r i d e sw h i c hb i n d i n gp h o s p h a t e ，n a m e dp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e k e yw o r d s ：p o s ，p r e p a r a t i o n , s e p a r a t i o n , q u a l i t a t i v ea n a l y s i s ，s t r u c t u r a la n a l y s i s目录摘要i英文摘要l 文献综述11 1 功能性寡糖国内外研究开发现状l1 2 寡糖的常用分离分析方法。21 2 1色谱法。21 2 2 毛细管电泳( c e ) 法21 2 3 柱层析法21 3磷酸寡糖的组成与结构特点31 4磷酸寡糖的分离与制备41 4 1 理论基础。41 4 2 磷酸寡糖的分析方法51 4 3 磷酸寡糖的制备方法61 5磷酸寡糖的功能特性61 5 1促进人体对钙、铁等矿物质元素的吸收61 5 2抗淀粉老化。71 5 3保护牙齿71 6 磷酸寡糖相关研究背景81 6 1l ，6 二磷酸果糖81 6 2 酪蛋白磷酸肤82 引言102 1 研究目的及意义102 1 1研究目的1o2 2 2 研究意义。1 02 2 本实验主要研究内容1 03 实验材料1 23 1实验原料1 23 2 酶制剂1 23 3 主要化学试剂j 。1 23 4 标准品1 23 5 阴离子交换树脂1 23 6 仪器及耗材1 23 7 主要设备1 34 试验方法1 44 1 原料分析1 44 1 1 淀粉水分含量的测定1 44 1 2 结合磷含量测定1 44 2 低d e 值的麦芽低聚糖浆的制备1 54 2 1 淀粉酶酶活测定1 54 2 2 麦芽低聚糖浆d e 值测定方法。1 64 2 3 低压喷射液化法制备低d e 值麦芽低聚糖浆。1 64 3 磷酸寡糖的分离研究1 84 3 1 阴离子交换树脂的活化和再生1 84 3 2 树脂装柱与上样l84 3 3 洗脱和检测。1 94 3 4 分离树脂的筛选。1 94 3 5 中性糖的洗脱1 94 3 6 洗脱剂浓度的选择1 94 3 7 洗脱速度的选择2 04 3 8 磷酸寡糖的脱盐处理。2 94 4 磷酸寡糖的定性分析2 04 4 1 磷酸寡糖的脱磷处理。2 04 4 2 磷酸寡糖的薄层色谱( t l c ) 分析2 04 4 3 磷酸寡糖的高效阴离子交换色谱( 眦c p a d ) 分析2 l4 5 磷酸寡糖的结构分析2 15 结果与分析2 35 1 马铃薯淀粉原料分析。2 35 1 1 马铃薯淀粉原料分析结果。2 35 2 低d e 值的麦芽低聚糖浆的制备2 35 2 1 淀粉酶酶活测定。2 35 2 2 低压喷射液化法制备低d e 值麦芽低聚糖浆2 35 2 3 麦芽低聚糖糖组分的检测2 35 3 磷酸寡糖的分离研究2 55 3 1阴离子交换树脂分离磷酸寡糖2 55 4 磷酸寡糖的定性分析2 75 4 1 磷酸寡糖的薄层层析2 75 4 2 磷酸寡糖的高效阴离子交换色谱( m 灶c p a d ) 分析2 95 5 磷酸寡糖的结构分析3 16 结论与讨论3 4参考文献。3 61 致谢z 1 1作者简介。4 2攻读硕士学位期间发表的论文。4 21 文献综述1 1 功能性寡糖国内外研究开发现状寡糖亦称低聚糖( o l i g o s a e e h a r i d e s ) ，最早是由b h e i g e r i e h 等于1 9 3 0 年提出，最初是指两个以上单糖分子脱水构成的糖，“寡 数一般不超过9 【l 】。1 9 5 9 年，j a j h o m e正式建议1 0 个以下单糖残基的聚合物称为寡糖或低聚糖，是指由2 l o 个单糖经脱水缩合由糖苷键连接形成的具有直链或支链的低度聚合糖类的总称【2 】，其分子通式一般表示为( c 6 h l o o s ) n ，n = 2 1 0 ，分子量约3 0 0 - 2 0 0 0 道尔顿。根据单糖组分不同，可以将寡糖分为两类：由一种单糖结合而成的均寡糖，由两种或两种以上单糖结合而成的杂寡糖。根据寡糖的生物学功能又可分为功能性寡糖和普通寡糖两大类。蔗糖、麦芽糖、大豆低聚糖、及麦芽寡糖等属于普通寡糖，它们可被消化吸收，产生能量。而功能性寡糖不被人和动物肠道吸收并可促进双歧杆菌的增殖，有益于肠健康的一类寡糖，即双歧因子。功能性寡糖的特殊功效已逐渐引起学术界的重视。它具有促进双歧杆菌的增殖 3 1 、改善消化道功能、抗病毒作用【4 】、抑菌作用【5 】等生理功效，对人体健康具有重要作用。目前用于制备功能性低聚糖的原料主要为含大量碳水化合物的农作物及其副产品，如甜菜、甘蔗渣、玉米芯、动植物多糖、各种淀粉等【6 】。功能性寡糖由于其具备特殊的生理功能，越来越受到学者们的重视，相关产品品种愈加丰富，应用领域也更加广阔。功能性寡糖的研究已经有近二十年的历史，随着各国学者研究的不断深入，使得寡糖开发产业得到了迅速的发展。目前在寡糖研究领域，欧美以及日本等发达国家处于领先地位，同时也是寡糖的主要消费市场。美国已经利用其在寡糖研究方面的理论经验基础，开发出了寡糖药物及寡糖疫苗等衍生产品【7 】。为了推动功能性低聚糖的更快发展，欧洲率先启动了“欧洲糖研究开发网络发展规划，日本也实施了“糖工程前沿计划 。目前，不论是寡糖开发研究技术方面，还是产量、消费及出口等方面，日本都走在了国际的前列嘲。表1 1 列举了日本开发的寡糖种类及其功能特性1 9 。表1 - 1e t 本新型寡糖及其功钱特性t a b l e1 - 1n e wt y p eo fo i i g o s a c c h a r i d e sa n df u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c si nj a p a n寡糖种类功能特性与应用磷酸寡糖藻蔗糖龙胆寡糖果胶寡糖菊芋寡糖抑制磷酸钙沉淀，抗龋齿，促进双歧杆菌增殖，抗淀粉老化甜度与消化性与蔗糖相同，可作为抗龋齿甜味剂促进双歧杆菌和乳酸菌的增殖，耐热耐酸，吸湿性良好抗溃疡，抑制血压升高，降低胆固醇，抑制脂肪肝，具有抗菌性低热量，保湿性、稳定性好，可促进有益菌增殖我国研究开发功能性寡糖较晚，但在相关研究方面也取得了不少成就。2 0 0 1 年功能性低聚糖产量已达到1 8 4 万吨，市场消费总额约6 4 2 亿元。2 0 0 2 年超过2 万吨，销售额也保持强劲增长趋势。随着相关研究的不断进步和完善，我国功能性低聚糖品种也日益丰富。在我国寡糖类产品主要应用于功能性食品添加剂及保健食品。随着人们健康意识的不断增强，功能性低聚糖的功能特性越来越受到人们的重视，相信其将会有更广阔的发展和应用空间。1 2 寡糖的常用分离分析方法1 2 1色谱法在寡糖分离及分析方面，高效液相色谱法( h p l c ) 、薄层色谱法( t l c ) 和气相色谱法都是很好的方法。房子等研究表明采用高效液相色谱法( h p l c ) 缨i 合薄层色谱法( t l c ) 对甲壳胺寡糖有良好的分离效果【1 0 1 。彭建和等利用h p l c e s i m s 对寡糖衍生物进行分离和结构分析，得到了非常理想的分析效果，为生物体内寡糖的分析提供了一套有效的研究方法【l l 】。1 2 2 毛细管电泳( c e ) 法除了少数带有羧基和磺酸基的糖类化合物，绝大多数的糖类化合物不带电荷，极性很大，而且没有发色基团或荧光基团，所以用一般的高效毛细管电泳系统无法得到分离和检测。因此，为了使用毛细管电泳法对寡糖类进行分析，必须采用衍生的方法使之带上发色荧光基团或电荷，与硼酸盐等络合，与缓冲溶液中的添加剂形成配合物、使之在高p h 缓冲条件下电离及加入表面活性剂使之形成胶束等方法。m a ow 等采用毛细管电泳对肝素及其寡糖进行了分离分析【1 2 】。n a s h a b e h 等阐述了荧光辅助毛细管电泳法 1 3 q 5 】。毛细管电泳不仅作为一种分离手段，而且还可利用它进行寡糖的纯度鉴定、组成分析和结构归属判定【1 6 1 。常理文将寡糖的还原端接上a 萘胺基团，进行毛细管区带电泳分析取得了良好的效果【l 。1 2 3 柱层析法进行柱层析法时，对于不同的寡糖可采用不同介质，再根据不同的介质选择不同的柱层析法。柱层析法主要有活性碳柱层析法、纤维柱层析法、硅胶柱层析法。活性碳柱层析法是利用活性炭与天然硅藻土等量混合的吸附柱来分离寡糖的方法。张建波利用活性碳柱层析具有选择性高、吸附型大的特点，获得了高分子的低聚糖【l 引。利用纸层析的纤维柱层析法分离中性糖类也非常成功。利用硅胶柱层析法是最常用的分离手段，但糖的极性强，在硅胶薄层上进行层离时，所承载的样品量较少，一般点样量不大于5 腭，若点样量多时，色点形状变长，酣值下降，这样对某些r f 值比较接近的糖的分离就有影响。不过，这种缺点可以用硼酸溶液或一些无机盐的水溶液代替水调制吸附剂涂铺薄层而得到改进，在这些特殊处理的硅胶薄层上，样品承载量可以显著提高，并且分离效果也有改善1 1 9 1 。21 3磷酸寡糖的组成与结构特点磷酸寡糖( p h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s ) 的概念最早是由k a m a s a k a , h 等于1 9 9 5 年提出的，他们在生产淀粉糖的废液中，发现了这种新物质 2 0 1 。在对其结构进行分析以后发现，这是由麦芽低聚糖中的葡萄糖残基与磷酸根共价连接得到的一类低聚糖，聚合度在3 “之间。由于其结合有磷酸根，因此，其整个基团带有负电荷，k a m a s a k a ，h 等人将其命名为p h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s ( p o s ) ，即磷酸寡糖。使用高效阴离子交换色谱( 蚴c p a d ) 对其进行组分分析，结果表明磷酸寡糖由p o 1和p o 2 两部分组成，其中p o 1 为主要表现形式。分别对p o 1 和p o - 2 两部分进行组分分析，结果表明：p o 1 由麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖构成，每一寡糖组分上连接有一个磷酸根。而p o 2 则由麦芽五糖和麦芽六糖构成，每一个寡糖组分上至少连接有两个磷酸根，将p o 1 和p o - 2 脱磷后测得其平均聚合度分别为4 0 2 和5 2 8 ，未脱磷之前的聚合度为4 3 0 ，由此，推断出磷酸寡糖是磷酸化的a 1 ，4 麦芽低聚糖【2 0 l 。经过进一步的结构分析，发现p o 1 部分由3 磷酸寡糖( 3 3 - 磷酸麦芽四糖和3 4 磷酸麦芽五糖) 和6 磷酸寡糖( 6 3 磷酸麦芽三糖和6 2 磷酸麦芽三糖，6 3 磷酸麦芽四糖和6 4 磷酸麦芽五糖) 组成【2 l j 。磷酸寡糖的主要结构如图1 1 所示，图1 2 为p o 1 结构简图。p o 2 的具体结构目前尚不清楚，有待深入研究。口代t 氍c t l ?i 一一揖魄带电翰a 辨k 图1 1 磺酸寡糖的主要结构图f z 2 lf i g1 - 1m a i ns t r u c t u r eo fp o sc o m p o n e n t s3叩3 a m1帮右pl6 pl王辚酸寡挺童磷酸寡谤注：o 代震蔼萄橱残基。代表葡萄糖残基还原束增3 p 代表与硼码焉殁丕弟3 位硪康于相绪合的焉酸磊团，卯代表与匍码韬残基的第6位碳原子相结合的磷酸基团圈1 2p o 1 的结构简副2 3 lf i g1 - 2s t r u c t u r eo fp o - i1 4 磷酸寡糖的分离与制备1 4 1磷酸寡糖制备的相关理论研究采用全酶法对原淀粉进行水解是制备磷酸寡糖的主要手段。实验可以采用的酶主要有：耐高温a 淀粉酶、糖化酶、真菌淀粉酶以及普鲁兰酶。在液化糖化过程中，由于淀粉酶水解糖苷键的反应受到连接在葡萄糖残基上磷酸根的电荷效应和空间位阻效应的影响，因此，与磷酸基团邻近的糖苷键难以被淀粉酶作用，从而生成磷酸寡糖。同时，结合在淀粉分子非还原性末端上不含磷酸基团的糖片段会在淀粉酶的作用下水解生成中性糖【2 4 1 。因此，所选淀粉原料结合磷含量的高低对磷酸寡糖的制备具有很大影响。淀粉中通常含有少量的含氮化合物、脂质和无机盐。而无机盐主要是磷酸和某些金属离子盐类。磷酸在淀粉中一部分以磷脂质的形式存在，另一部分则以磷酸酯的形式结合在葡萄糖残基上1 2 5 1 。谷物淀粉含磷酸基团较少，马铃薯淀粉是含有磷酸酯键最多的天然淀粉，约含有0 0 8 的结合磷，以共价键形式存在于淀粉中，赋予马铃薯淀粉很多特殊的性质【2 6 】。马铃薯淀粉微晶体上结合有磷酸基，这是马铃薯淀粉分子结构的特点【2 7 1 。马铃薯淀粉所含的磷酸基约7 0 结合于葡萄糖残基的6 位上，分子中平均4是敲每2 0 0 - - - 4 0 0 个葡萄糖基结合有一个磷酸基【2 引。马铃薯淀粉结合磷含量一般大约为6 0 0m g k g ，含磷量高的品种可达1 0 0 0m g k g 左右。因此，马铃薯淀粉是生产磷酸寡糖最佳的天然淀粉原料。将磷酸寡糖与制备糖液中的中性糖进行分离是该项目中的另一项关键技术。由于磷酸寡糖结合有磷酸根，带负电荷，因此理论上可以通过离子交换法将二者分离。日本学者将所制备糖液通过壳聚糖修饰的层析柱进行分离，制备出了磷酸寡糖【2 l 】。本实验室朱培蕾采用弱碱性阴离子交换树脂h j 3 0 成功分离制备出磷酸寡糖，并确定了最佳洗脱工艺 2 9 1 。国内学者在其它低聚糖的分离提纯研究方面，也曾使用离子交换法，并取得了理想的效果。姜守霞等利用离子交换法分离提纯异麦芽低聚糖，将糖液中所含葡萄糖及四糖以上组分大量除去，最终使异麦芽低聚糖的得率达到6 0 以上【3 0 l 。彭红等曾研究采用阳离子交换树脂法分离纤维低聚糖，经过h p l c 对分离所得的物质进行检测，表明离子交换树脂对纤维低聚糖有很好的分离效果【3 i 】。另外，采用活性炭吸附也可以去除中性糖，但其吸附专一性差，可能将目标产物吸附去除。有的学者曾研究采用膜过滤系统进行糖分离，但糖粘度较大，流动性较弱，对滤过分离产生很大影响，因此，目前很多研究及生产均采用离子交换法进行糖液的分离及纯化。1 4 2 磷酸寡糖的分析方法磷酸寡糖为结合有磷酸基团的麦芽低聚糖混合物，为麦芽低聚糖制备过程中的副产品，存在含量少、分子复杂、纯化难度大及定性定量分析困难等特点。由于目前未有磷酸寡糖标准品面市，所以无法直接对其进行定性定量分析，只能采用碱性磷酸酯酶对磷酸寡糖进行脱磷酸根处理之后，使其转化为麦芽低聚糖，与麦芽低聚糖标准品作为对照，采用低聚糖类通用的分析和检测方法对其进行分析测定。日本学者曾对脱磷酸根后的磷酸寡糖进行了薄层层析分析，实验选用乙腈水( 8 ：2 ，v ) 作为展开剂，使用硫酸甲醇溶液对样斑进行显色，推断出了p o 1 的糖组分1 2 2 1 。我国学者毛跟年等采用正丁醇：乙酸：水( 3 ：1 ：1 ) 作为展开剂，显色剂为苯胺二苯胺磷酸对磷酸寡糖进行了薄层层析，将磷酸寡糖中各糖组分有效的展开，定性定量结果比较理想【3 2 】。房子等采用薄层层析法对甲壳胺寡糖进行分析，选用乙酸乙脂：甲醇：水：氨水( 5 ：9 ：l ：1 5 ) 作为展开剂，显色剂( 移取大茴香醛溶液2 5 。0m l 于4 5 0m l 乙醇中，然后缓缓加入2 5 0m l 浓硫酸，最后加入5 0m l 乙酸混匀) 喷雾显色，结果显示可将不同聚合度的甲壳胺寡糖很好地分开，且实验重现性高i l o j 。杨雅麟等采用正丁醇：异丙醇：乙酸：水( 7 ：5 ：2 ：4 ) 作为展开剂，苯胺二苯胺磷酸溶液为显色剂，对菊芋汁中低聚糖进行二次薄层层析，结果显示：该法能很好的将菊芋汁中葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖等组分展开，达到实验预期效果【3 3 】。上世纪九十年代，学者们开始采用毛细管电泳对糖类进行分析，有学者提到利用毛细管电泳法分析糖类的相关研究【3 4 】。毛细管电泳虽然是一种新型的高效的检测手5段，但其在糖类分析应用中还有些许不便，主要因为多数糖类解离程度十分微弱，且具有较强的亲水性，使得依靠样品淌度差异的毛细管区带电泳和样品疏水性差异的胶束毛细管电动色谱都难以直接解决糖的分离问题，其次多数糖类不具备很强的紫外和荧光生色团，给分离检测带来一定困剌驺j 。为了方便分析，必须经过衍生化处理，如a p t s 衍生【3 6 】、对氨基苯甲酸乙酯( a b e e ) 衍生 3 7 1 等，但衍生化试剂一般价格较贵，且衍生处理比较繁琐，效果很难把握。糖类化合物具有弱酸性及亲水性，在比较强的碱性溶液中以阴离子形态存在，因此可用强碱性溶液做流动相进行阴离子交换分离口引。由于i - i p a e c p a d 法在强碱性条件下有灵敏度高、检测限低、操作简单及无需衍生处理等优势，在糖类检测方面受到越来越多的重视 3 9 1 。r o c k l i n 等于1 9 8 3 年首先报道了用i - i p a e c p a d 法检测糖的方法 4 0 l 。目前高效阴离子交换色谱法已经成为糖类分析检测的主要手段，我国国标【4 l 】中规定采用离子色谱法对蜂蜜中淀粉糖进行测定，日本学者就曾发表采用h p a e c p a d法分析磷酸寡糖的相关文献报道【2 0 j 。1 4 3 磷酸寡糖的制备方法磷酸寡糖属于功能性低聚糖范畴，目前有关功能性低聚糖的制备途径大致有五种 4 2 1 ：a 从天然原料中提取，再经纯化而得，如棉籽糖【4 3 删、水苏糖的生产；b 利用糖苷酶( 包括糖基转移和水解两种形式) 生产制备，如低聚果糖、低聚半乳糖【4 5 】的生产；c 利用水解酶作用制备，如低聚木糖、低聚壳聚糖【4 6 j 、低聚甘露糖的制备；d 酸碱水解法制备，如乳酮糖的生产；e 化学合成法。天然原料中所含低聚糖量甚微，而且其无色、不带电荷，分离手段复杂，制各成本较高，不适合工业化生产。酸碱水解不易控制水解程度，制备糖类组分复杂，难以获得特定结构的低聚糖。而化学合成法，其需要复杂而冗长的保护和去保护操作以达到选择性控制合成的目的，并且可能带来安全性问题，不适合低聚糖类产品的规模化生产h 7 1 。而利用酶技术生产低聚糖，不论是酶法水解还是酶法合成，它都能在不需要基团保护操作的温和条件下发挥其专一性的特定，进行具有立体和区域选择性的反应，生产制备出特定的低聚糖产品1 4 引，因此酶技术是生产低聚糖最适宜的手段。日本学者即采用全酶法对马铃薯淀粉进行水解处理，从而制得磷酸寡糖 4 9 1 ，因此，利用酶法技术生产磷酸寡糖具有很好的手段。1 5磷酸寡糖的功能特性1 5 1促进人体对钙、铁等矿物质元素的吸收钙是人体内的常量元素，约占人体体重的2 ，是构成人体骨骼与牙齿的主要材料，9 9 的钙形成人体骨架支撑着整个身躯。骨钙以羟磷灰石 c a 3 ( p 0 4 ) 2 3 c a ( o h ) 2 】的结晶牢固地结合在胶原纤维上，形成有机与无机的复合材料【5 0 l 。其余1 的钙广泛分布在软组织和细胞外液中【5 1 1 。近年来，由于居民饮食结构失衡，尤其是以谷类为主的人群，钙的摄入量无法满足人体正常需要，因此，补钙成为关系大众健康的一个重大6课题。能够抑制磷酸钙形成促进钙吸收的产品有很多种，如酪蛋白磷酸肽( c p p s ) 、卵黄高磷蛋白、柠檬酸盐、硫酸软骨素等。但它们中除了c p p s 外，很少能真正应用到食品中去。c p p s 它在中性或碱性的条下，能够与金属离子，特别是钙离子形成可溶性复合物【5 2 1 。但c p p s 由于具有苦味以及价格昂贵等缺点，其应用受到一定的限制。而磷酸寡糖作为一种新型功能性低聚糖，不仅在一定条件下可以抑制不溶性钙盐的形成，促进人体对钙质的吸收，效果与c p p s 相当，而且没有苦味。k a m a s a k a h 等学者对磷酸寡糖的持钙能力进行了研究，将p o 1 和p o 一2 分别添加至含有1 0m m 磷酸盐、4m m 钙离子的溶液中，当p o 2 的浓度为1 0m m 时，2 4 小时后仍能使溶液中可溶性钙离子的浓度保持在原来的6 0 左右，而p o i 抑制钙盐沉淀形成的能力小于p o 2 1 2 0 l 。铁也是人体必需的营养元素之一，占人体体重的0 0 0 6 ，其中7 0 的铁存在于血红蛋白、肌红蛋白、血红素酶类、辅助因子及运载铁中，又叫功能性铁；其余3 0 的铁作为体内贮存铁，主要以铁蛋白和含铁血黄素的形式存在于肝、脾和骨髓中【5 3 1 。人体缺铁时，可产生很大危害，如贫血、含铁酶的功能下降、机体免疫功能和抗感染能力下降、影响机体的生长发育、神经精神系统异常等【5 4 1 。为了避免铁元素缺乏对人体造成危害，平衡膳食注意摄入含铁食物及补铁成为必要，开发新型的促进人体对铁质吸收的新型功能性食品成为一重要研究课题。磷酸寡糖除了促进人体对钙质吸收的功能之外，还可以作为铁的强化剂起到增加无机铁溶解性的功效。对磷酸寡糖进行增加无机铁溶解性的实验，结果表明：p o 1 组分能够促进与其自身摩尔质量相当的铁离子溶解，而p o 2 则能促进约1 0 倍于其自身摩尔质量的铁离子溶解【5 5 1 。1 5 2抗淀粉老化老化的本质是糊化的淀粉分子又自动有序排列，并由氢键结合成微晶束状结构，使淀粉溶解度降低，有晶体沉淀析出。老化淀粉会产生一些不良品质，对加工生产有一定影响。淀粉的老化与淀粉的种类、支链与直链淀粉比例、分子大小、所含无机盐种类及冷却速度等因素有关联f 2 们。磷酸寡糖结构上具有