（食品科学专业论文）高产油脂酵母的选育及发酵工艺的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 中文摘要 中文摘要 油脂既是构成和维持生命运动的基本物质之一，也是重要的工业原料目前， 随着人口的日益增长，油脂供求矛盾日益尖锐，动植物油脂已经不能满足人类的需求 微生物油脂是继动植物油脂后开发的一种新油脂资源。大多数微生物油脂富含可以降 低血清胆固醇的不饱和脂肪酸，具有促进人类健康的重要作用，同时也可以作为生物 柴油生产的油脂原料。微生物油脂的开发利用可以缓解动植物油脂资源紧缺的局面， 为油脂资源的获得提供了一条新的途径。 本试验对比了真菌油脂抽提的几种方法，确定了酸热法作为油脂抽提的方法； 通过对十六株酵母菌产油能力的比较研究，筛选到了一株产油脂的优良菌株：子囊菌 油脂酵母( l i p o m y c e st e l r a s p o r u s ) y 11 5 6 2 。以y l l5 6 2 为出发菌株，采用紫外线诱变 的方法，获得了一株油脂高产菌株将其命名为u v 5 。该突变菌株经过摇瓶培养9 6 h 后，生物量可达2 1 7 7 - 4 - 0 3 3 ( g l 发酵液) ，油脂含量达到8 0 7 士0 2 0 ( g l 发酵液) ， 油脂得率达到3 7 0 5 + 0 3 5 ( g g 菌体干重) ，均比出发菌株有明显的提高。该菌株 连续传代二十次后，其油脂得率保持稳定。因此，突变菌株u v 5 是一株具有工业生 产潜力的油脂生产菌株。 通过单因素试验确定了突变菌株u v 5 的发酵条件为：碳源为葡萄糖7 0 9 l ，氮 源为硫酸铵0 5 9 l ，碳氮比为3 0 8 ，初始p h 为6 5 ，接种量为1 0 ，培养温度为2 8 。c ， 培养时间为9 6 h ，油脂含量达到9 0 9 士0 1 4 ( g i 发酵液) ，油脂得率达到5 3 士0 2 3 ( g g 菌体干重) 用响应面试验设计的方法对u v 5 进行了发酵培养基优化，确定了u v 5 的最佳 发酵培养基组成为：葡萄糖浓度为1 2 9 3 6 9 l 、硫酸铵浓度为0 7 7 9 l 、酵母粉浓度为 2 0 6 7 9 l ，磷酸二氢钾浓度为1 o g l 、硫酸镁浓度为0 5 9 l 。在以上条件下，理论最 大油脂得率可达5 8 4 2 ( g g 菌体干重) 。经过验证试验，实际油脂得率达到 5 7 9 0 - a ：o 5 0 ( g g 菌体干重) ，预测值- 9 实测值之间有良好的拟合性，模型是有效的， 对应的生物量为3 0 4 7 + 0 3 4 ( g l 发酵液) ，发酵液含油量1 7 6 4 4 - 0 3 5 ( g l 发酵液) 。 菌株优化培养基中的油脂得率比原培养基提高了6 4 8 9 。 关键词：子囊菌油脂酵母，油脂，诱变，发酵，响应面实验设计 i 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a e t l i p i di s o n eo ft h eb a s i cm a t e r i a la n dl i f e s u s t a i n i n ga c t i v i t i e s ，a sw e l la so n e i m p o r t a n ti n d u s t r i a l a tp r e s e n t ，a n i m a la n dv e g e t a b l eo i lc a nn o tm e e t 谢t ht h ed e m a n d so f p e o p l en o w a d a y sb yt h ed e v e l o p m e n to fp o p u l a t i o n m i c r o b i a lo i l i san e wk i n do f r e s o u r c e sa f t e ra n i m a la n dv e g e t a b l eo i l al o to fm i c r o b i a lo i li sr i c hi np o l y u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d sw h i c hc a nl o w e rt h es e r u mc h o l e s t e r 0 1 s ot h e yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h e h e a l t ho fh u m a nb e i n g ，w h i c ha r ca l s or a wm a t e r i a l so ft h eb i o d i e s e lp r o d u c t i o n t h e e x p l o i t a t i o no fm i c r o b i a lo i lc a ne a s et h es i t u a t i o no fs h o r t a g eo fa n i m a la n dv e g e t a b l eo i l r e s o u r c e t h e r e f o r e ，t h ed e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no fm i c r o b i a lo i l sh a v et h ep r a c t i c a l s i g n i f i c a n c ef o rt h ee d i b l eo i la n db i o d i e s e l m i c r o b i a lo i l sp r o v i d ean e ww a yo ft h eo i l r e s o u r c e s t h e p a p e ri sb a s e do nt h e s ep o i n t s ，r e s e a r c h e dt h ee x t r a c t i o nm e t h o d s ，a n di d e n t i f i e d a c i d - h e a t i n ge x t r a c t i o na st h ee x t r a c t i o nm e t h o d s c o m p a r e dt h eo i lp r o d u c t i v ea b i l i t yo f s i x t e e ny e a s t s ，a n dd e t e r m i n e dt h el i p o m y c e st e t r a s p o r u sy115 6 2a st h eb e s to i l p r o d u c t i o ns t r a i n t oi m p r o v et h ep r o d u c t i o no fo i l ，l i p o m y c e st e t r a s p o r u sy 115 6 2w a s m u t a t e db yu vt r e a t m e n t m u t a n tu v 5w a so b t a i n e da f t e rp a s s i n gp r i m a r y - s c r e e na n d m u l t i p l e s c r e e n t h eb i o m a s s21 7 7 + 0 3 3 9 l t h eo i lc o n t e n t8 0 7 + 0 2 0 9 la n dt h eo i l p r o d u c t i v i t y3 7 0 5 + 0 3 5 w a so b t a i n e da f t e r9 6 h o u r sf l a s kc u l t u r i n go fu v 5 t h e s ev a l u e s w e r eo b v i o u sh i g h e rt h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n d i s t i n c tc h a n g e so nt h ey i e l d f e r m e n t a t i o n i m p r o v e dt oi n d u s t r i a ls t r a i n a f t e rp a s s i n go nm a n yt i m e s ，t h e s ew e r en o t e s t ss h o wt h a tu v 5h a sac a p a b i li t yt ob e w es t u d i e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni nt h e f l a s kc u l t u r eo fu v 5b yo n e f a c t o r e x p e r i m e n t a ld e s i g n w h e ns h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eg l u c o s ea sc a r b o n s o u r c e ；( n h 4 ) 2 s 0 4 a sn i t r o g e ns o u r c e ，r a t i oo fc a r b o nt on i t r o g e na t3 0 8 ；i n i t i a lp ho f6 5 ： i n o c u l a t i o np r o p o r t i o no f1o ；c u l t i v a t e dt e m p e r a t u r ea t2 8 。c ；c u l t i v a t e dt i m eo f9 6 h ，t h e l i p i dp r o d u c t i v i t yr e a c h e d5 3 + 0 2 3 ，t h el i p i dc o n t e n tr e a c h e d9 0 9 士0 14 9 l w e o p t i m i z e dt h ec u l t u r em e d i u mi nt h ef l a s kc u l t u r eo f t h eu v 5b yr e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y t h eo p t i m a ls h a k i n gf l a s kc u l t u r em e d i u mw e r e ：g l u c o s ea t 12 9 3 6 e g l ， ( n h 4 h s 0 4a to 7 7 9 l ，y e a s tp o w d e r a t2 0 7 9 l ，k h 2 p 0 4a t1 o g l ，m g s 0 4 7 h 2 0a t0 5 9 l t h el i p i dp r o d u c t i v i t yw a s5 8 4 2 t h e o r e t i c a l l y ，5 7 9 0 - a ：0 5 0 p r a c t i c a l l y k e y w o r d s ：l i p o m y c e st e t r a s p o r u s ，l i p i d ，m u t a t e ，f e r m e n t a t i o n ，r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y i v 浙江大学硕士论文 浙江大学研究生学位论文独创性声明 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送 交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘鲎可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月 日 签字日期：年月 日 浙江大学硕士论文致谢 致谢 在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成， 有很多可敬的师长、同学、朋友给了我无数的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意! 本论文在导师郑晓冬教授的悉心指导下完成。从论文选题、实验方案、实验开 展到论文撰写无不凝聚着导师的大量心血和汗水。郑晓冬教授正直宽厚的为人品格、 严谨的治学态度、忘我的工作热情、广博的学术知识、敏锐的洞察力常使我受益非浅， 并在为人处世方面深深地影响着我。在此，谨向导师致以崇高的敬意和衷心的感谢! 本论文还得到了本系何国庆教授、尹源明副教授、陈启和副教授、罗自生副教 授、王友永副教授、朱加进副教授、李铎教授和余挺老师在实验上给予我的大力支持 与帮助! 感谢5 0 6 实验室的蔡成岗博士、姜峰博士、王一非博士、汤海青博士、张辉 博士、刘霞博士、刘娜博士、王惠丽博士、殷赞博士、黄斌硕士、王艺熹硕士、戚炯 炯硕士对我的支持与帮助同时，也深深感谢生物系统工程与食品科学学院的领导和其 他老师在我研究生学习期间给予我的关心和帮助! 最后，我把深深的谢意献给我的家人，他们给予我生活上无微不至的关怀，给 予我精神上无尽的支持与鼓励，让我顺利完成学业，教会了我用感恩的心来回报社会、 回报家庭、回报所有关心爱护我的人! 再次对所有关心、支持、帮助我的老师、同学、亲人、朋友表示最诚挚的谢意! 张嘉 2 0 0 8 年6 月于浙江大学华家池畔 浙江大学硕士学位论文鄹罱 前言 油脂是我们维持生命的重要营养物质，也是工业生产的重要原料目前，随着 人口的日益增长，油脂供求矛盾日益尖锐，动植物油脂已经不能满足人类的需求。石 油能源是人类生存和发展的重要物质基础。2 0 世纪7 0 年代出现的石油危机使人们认 识到，解决石油能源问题，除了有效利用现有的石油资源外，开发新能源是重要的解 决办法。 生物柴油是一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源，其化学成分主要为长链 脂肪酸的甲酯( 或乙酯) ，可以作为优质的石化柴油替代品。生物柴油具有润滑性能 好、储运安全、抗爆性好，燃烧充分等优良性能，还具有能量密度高，可再生、易生 物降解、含硫量低等特点。目前，生物柴油是以植物油脂作为原料，但是以植物油脂 为原料生产生物柴油，原料的成本占到总成本的7 0 8 5 ，经济可行性差。原料成 本成为限制生物柴油广泛应用的最主要问题。只有降低成本，生物柴油才具有广阔的 商业化应用前景。 无论是食用油脂，还是生物柴油原料油脂的主要来源仍旧是动植物油脂。但是 利用动植物油脂已经不能完全满足人类的使用和生活中各种油脂的需要。 微生物油脂又称单细胞油脂，是少数产脂微生物在适宜条件下以碳水化合物、 碳氢化合物和普通的油脂为碳，氮源，辅以无机盐生产油脂和另一些有商业价值的脂 质。微生物油脂的脂肪酸组成类似植物油脂，如菜籽油、棕榈油和大豆油等，并且富 含饱和和不饱和的长链脂肪酸，能够代替食用植物油脂，并可以作为生产生物柴油的 原料，是继动植物油脂后开发的一种新油脂资源。 用于生产微生物油脂的微生物主要有：酵母菌、霉菌、细菌和藻类，以酵母菌 和霉菌类真核微生物居多。 微生物油脂制造成本较高，尚未实现大规模工业化生产，现还无法和动植物油 脂相竞争。所以目前对微生物油脂的研究和开发主要集中在利用微生物生产附加值高 的功能性油脂和特殊用途油脂方面。但是随着现代生物技术的快速发展，越来越多的 研究者投身于微生物油脂研究中，将各种生物技术应用于该领域。如利用细胞融合、 细胞诱变等高科技方法，使微生物生产出比动、植物油脂更符合人们需要的高营养油 】 浙江大学硕士学位论文前言 脂或某些特定脂肪酸的油脂。现代分子生物学、化学生物学和生物化学技术获得的最 新成果，将加快对产油微生物菌种筛选、改良、代谢调控和发酵的研究，从而降低微 生物油脂的生产成本，使产油微生物的研究发展更快。 与传统的生产油脂技术相比，利用微生物发酵生产油脂，具有以下优点：微生 物细胞增殖快，生产周期短；微生物生长所需的原料丰富，价格便宜，如淀粉、糖类 特别是食品工业和造纸行业的废弃物都可以加以利用，从而保护了环境；用微生物方 法生产油脂，比农业生产油脂所需的劳动力少，同时不受季节、气候变化的限制；能 连续大规模生产，生产成本低。 微生物油脂的研究和开发，不仅丰富了传统的油脂工业技术，而且是工业化生 产油脂的一个重要途径。特别是在目前人i z l 增长使得油脂需求量与自然资源严重短缺 的矛盾日益尖锐的情况下，开辟新的油脂资源致生物油脂更具有重要的理论和现 实意义 浙江大学硕士学位论文文献综述 1 文献综述 1 1微生物油脂的研究进展 微生物油脂研究历史悠久，最早可以追溯到1 9 世纪7 0 年代中期。在第一次世 界大战前，德国科学家曾经试图利用油脂酵母、单细胞藻类和菌类生产油脂，以缓解 当时油脂供应不足的状况，但后来由于战争爆发而中止了研究。其后，美国对微生物 油脂也做过研究f l 】 利用微生物生产油脂的研究，从2 0 世纪4 0 年代发现高产油脂的斯达氏酵母、 粘红酵母、曲霉属及毛霉属等微生物开始。2 0 世纪8 0 年代初，日本成功建立发酵法 工业化生产长链二元酸的新技术，结束了用蓖麻油裂解合成十三碳二元酸的历史。 1 9 8 6 年日本、英国首先推出含有y _ 亚麻酸微生物油脂的保健食品，功能性饮料、高 级化妆品等。自2 0 世纪9 0 年代以后，功能性油脂的发展越来越受到重视。相继从丝 状真菌、细菌、酵母和微藻类中，寻找到能够生产功能性油脂的菌种，并且取得了突 破，为进一步形成生产力提供了技术依据1 2 1 。 国内利用微生物生产多不饱和脂肪酸油脂是从上世纪8 0 年代末开始的。1 9 8 8 年 上海工业微生物研究所利用m 1 0 2 菌株进行发酵生产, - 3 e 麻酸油脂，含量为8 0 t 3 1 1 9 9 1 年赵振英等人从毛霉目6 个属的菌株中筛选出c 6 7 6 1 和t 8 7 6 5 ，c 6 7 6 1 菌体脂 肪酸产量为2 5 3 5 ，, - 亚麻酸油脂含量可达1 2 1 4 ，t 8 7 6 5 菌株的脂肪酸产量为 1 5 2 0 ，十亚麻酸油脂含量可达2 2 2 4 【4 1 。1 9 9 3 年南开大学生物系张峻等人以毛 霉目的2 2 个菌株进行发酵初筛，从中选出一株深黄色被孢霉为出发菌株进行诱变育 种及高碳源培养发酵生产油脂，菌体得率为2 9 3 0 ，油脂含量为4 4 2 0 ，y 亚麻酸 油脂含量为9 4 4 p j 。 与此同时，随着石化资源的日趋枯竭、石油价格的不断上涨、油品供求矛盾的 日渐突出，寻找和开发石化能源的替代能源具有重要的战略意义 生物柴油是最重要的液体可再生能源产品之一，其化学成分主要是长链脂肪酸 甲酯( 或乙酯) ，可以替代全部或部分石化柴油f 6 1 。生物柴油具有能量密度高、润滑 性能好、储运安全、抗爆性能好、燃烧充分等优良使用性能和可再生性。环境友好性 浙江大学硕士学位论文文献综述 及良好的替代性能，是极具潜力的石化能源替代品。 目前，用于生产生物柴油的原料主要是植物油脂。生产生物柴油的原料在欧洲 主要为菜籽油，而美国则主要利用大豆油。巴西政府于2 0 0 3 年重新启动生物柴油计 划，发展以蓖麻籽油为原料的生物柴油技术。我国海南省正和生物能源有限公司经过 长期努力，2 0 0 1 年在河北邯郸建成以回收废油、野生油料为原料年产l 万吨生物柴 油的试验厂，其技术和产品已于2 0 0 2 年1 0 月通过了国家经贸委新产品技术鉴定吲 限制生物柴油广泛应用的最主要问题是成本问题。只有降低成本，生物柴油才 具有广阔的商业化应用前景。以植物油脂为原料生产生物柴油，原料的成本占到总成 本的7 0 8 5 ，经济可行性差【8 】 以植物油脂为原料生产生物柴油是生物柴油产业发展的瓶颈。目前的技术没有 利用获取植物油脂时伴生的废弃生物质资源，比如油料作物的秸秆、炼油饼渣等。这 些废弃生物质在质量上远远超过植物油脂，并且蕴藏的能量也远远超过植物油脂所贮 藏的能量。这些废弃生物质能源若不能充分开发利用，不仅会造成能源的巨大浪费， 同时也将引起严重的生态环境问题【9 】。 目前生物柴油主要由各种动物、植物油脂经过酯化或者转酯化工艺而得。由于 大部分微生物油脂的脂肪酸组成与一般植物油脂相近，以c 1 6 和c 1 8 系脂肪酸，如油 酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸为主，所以微生物油脂可以替代植物油脂生产生物柴油。 美国国家可再生能源实验室( n r e l ) 报道指出，微生物油脂发酵可作为生物柴油产业 和生物经济的重要研究方向 i o 】。 目前生物柴油是世界科研的焦点，世界各国纷纷根据本国国情选择合适的油脂 原料生产生物柴油，大多数采用植物油脂制取生物柴油。欧洲和北美地区耕地资源丰 富，农业高度发达。因此欧洲各国，尤其是德国，大规模种植油菜，采用菜籽油生产 生物柴油，并建立了相应的产品标准。美国主要利用高产转基因大豆，采用大豆油生 产生物柴油。东南亚国家属于热带雨林气候或热带季风气候，全年高温、雨水丰富， 适于规模化种植油棕，棕榈油成为当地发展生物柴油的重要原料。世界可再生能源生 产大国巴西，主要利用蓖麻籽油进行生物柴油生产【l 。 我国是植物油脂资源短缺的国家，现有的油料作物年产油脂在一千万吨左右， 尚不足以满足国内食用油消费市场需求。用植物油脂来生产生物柴油不适合我国国 4 浙江大学硕士学位论文文献综述 情。我国目前进行小规模生物柴油生产的企业，基本依赖资源非常有限的餐饮业废油， 缺少稳定、可靠的油脂原料供应基地与渠道。生物柴油的油脂原料供给问题是我国生 物柴油产业发展的关键9 1 。 微生物油脂发酵周期短，不受场地、季节、气候变化等影响，一年四季除设备 维修外都可以连续生产；同时，产油微生物菌种资源丰富，具有碳源广谱性，能够利 用和转化各种农林废弃木质纤维素原料因此利用微生物转化法获取油脂具有巨大的 发展前景1 1 2 】 从目前各国的研究成果看，借助生物工程技术，利用微生物体内生物合成的方 法来制取微生物油脂具有重要的应用价值。利用微生物生产油脂是开发油脂资源的新 方向 1 2 产油微生物的种类 细菌、酵母、霉菌、藻类均能产生油脂，但以酵母和霉菌为主。 1 2 1 产油细菌 细菌是最简单、最小的微生物细胞。大多数产油细菌在高葡萄糖时产生不饱和 的甘油三酸酯，但大多细菌不产甘油三酯而是积累复杂的类脂。加之产生于细胞外膜 上，提取困难，因此产油细菌；l - r 业意义【13 1 1 2 2 产油霉菌和酵母菌 霉菌和酵母菌被认为是良好的产油微生物。从8 0 年代开始，大量的研究报道集 中在霉菌和酵母菌。 酵母在脂肪酸的分布模式上相当单一，绝大多数酵母仅有c 1 6 和c 1 8 脂肪酸，与 许多植物油脂相似，其中基本的饱和脂肪酸是软脂酸，基本的不饱和脂肪酸是油酸， 少数酵母中最多的单不饱和脂肪酸是棕榈油酸，多不饱和脂肪酸在酵母中也存在，油 酸含量一般较丰富，但亚油酸含量很少。大多数酵母中总的油脂含量低于2 0 。微生 物中油脂的含量与他们的生长条件有很大的关系，即使高产的产油微生物在生长条件 不佳的时候，积累的油脂量也很少。这是高产油脂酵母的普遍特征【h 】。产油酵母能在 各种碳源上生长良好，如蔗糖、糖蜜、乳糖等。酵母转化碳水化合物为油脂的理论转 s 浙江大学硕士学位论文文献综述 化率为3 3 ，但实际转化率很少超过2 0 1 5 。赵宗保等筛选出的4 株产油酵母能同 时转化葡萄糖、木糖和阿拉伯糖为油脂，菌体含油量超过其干质量的5 5 1 9 1 罗玉平 等分离到一株高产棕榈油酸的酵母，总脂棕榈油酸含量高达5 0 1 4 1 1 6 霉菌中脂肪酸类型要比酵母丰富很多。油脂含量超过2 5 的霉菌约有6 4 种，很 多霉菌油脂含量在2 0 一2 5 之间。霉菌主要用于生产高比例的不饱和脂肪酸。不同 霉菌的脂肪酸的组成有很大的差别。如被孢子霉属能产生相对量较大的丫亚麻酸。土 曲霉的脂肪酸组成与食用植物油相近，有的能够产生特殊的脂肪酸，如蓖麻油酸等【”】。 1 2 3 产油藻类 海藻中有少量的产油藻，他们生产的油脂中多不饱和脂肪酸含量较高，包括p 亚麻酸，其中尤以棕榈酸、棕榈油酸和二十碳五烯酸( e p a ) 为主目前常见的产油藻 类主要是微藻。微藻种类繁多，主要有1 4 类，包括原核生物蓝细菌、黄藻、绿藻、 金黄藻、棕藻，硅藻等。微藻的太阳能利用效率高、个体小、营养丰富、生长繁殖迅 速、对环境的适应能力强、容易培养，微藻中油脂含量有些超过7 0 ，因此受到人们 的重视。目前国内外对微藻脂肪酸进行了大量研究，但报道较多的是小球藻、球等鞭 金藻、三角褐指藻等，其总脂含量高达细胞干质量的1 2 ，1 。易翠平、杨明毅用重量 法测定了3 种绿藻，其总脂肪含量在1 7 6 9 一2 1 4 4 之间【1 7 】。清华大学缪晓玲博 士通过异养转化细胞工程技术获得脂类含量高达细胞干质量5 5 的异养藻细胞【1 8 】。 1 3 微生物油脂合成途径和影响因素 1 3 1 微生物油脂合成途径 微生物油脂的生物合成是一个非常复杂并且由多酶催化的过程，属于初级代谢 的一部分。产生的油脂主要有甘油三酯和磷脂，其中甘油三酯约占8 0 以上，磷脂约 占1 0 以上。 微生物产生油脂过程，本质上与动植物产生油脂过程相似，都是从利用乙酰c o a 羧化酶的羧化催化反应开始，经过多次链的延长，或再经去饱和酶的一系列去饱和作 用等，完成整个生化过程。其中去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径、生成不饱和 脂肪酸的关键酶，该过程称之为脂肪酸氧化循环【1 9 】 浙江大学硕士学位论文 文献综述 微生物油脂的积累大体可分为两个阶段，发酵培养的前期为细胞增殖期，这个 时期微生物要消耗培养基中的碳源和氮源，以保证菌体代谢旺盛和增殖过程。在这一 阶段中细胞也合成油脂，但主要用于细胞骨架的组成，即以体质脂形式存在。当培养 基中碳源充足而某些营养成分( 特别是氮源) 缺乏时，菌体细胞分裂速度锐减，微生物 基本不再进行细胞繁殖，而过量的碳元素继续被细胞吸入，在细胞质中经糖酵解途径 进入三羧酸循环，同时甘油三酯的积累过程被激活【2 0 】 1 3 2 微生物油脂合成的影响因素 不同种属的微生物产油脂量、油脂成分及含量各不相同。而就同一种微生物菌 株，在不同培养条件下，其产油脂量、油脂成分及含量也不尽相同。产油菌种是生产 微生物油脂的关键，而培养基组成、培养时间、温度、p h 值等，又是影响各类菌种 油脂得率的重要因素，必须综合考虑。 1 3 2 1 产油菌种对微生物油脂合成的影响 不同的微生物，其产生油脂的含量及油脂脂肪酸组成均不同( 如表1 1 所示) 【2 1 1 。 表1 1 不同菌种在同样培养条件下的油脂含量 t a b 1 - ll i p i dc o n t e n to fd i f f e r e n ts t r a i n su n d e rt h es a m ec u l t u r ec o n d i t i o n s 浙江大学硕士学位论文文献综述 1 3 2 2 碳源对微生物油脂合成的影响 微生物高产油脂的一个关键因素，就是培养基中碳源充足而其他营养成分缺乏， 在这种状况下，微生物菌株主要将过量的碳水化合物转化为脂类用于培养产油微生 物的碳源很多，如葡萄糖、蔗糖、淀粉糖化液、废糖蜜、乳糖、淀粉厂废水、纸浆工 业废水及木材水解液等，但葡萄糖作为碳源所生产的菌体生物量高，且产脂量也高， 所以最适合细胞生长和油脂合成的碳源是葡萄糖【2 2 1 。 1 3 。2 1 3 氮源及碳氮比对徼生物油脂合成的影响 氮源主要有玉米浆、氨基酸、硝酸盐、氨盐及尿素。黄建忠等人进行了不同氮 源影响细胞油脂合成的实验表明f 2 3 1 ，n h 4 n 0 3 和尿素等适合于细胞生长但不适合油 脂的合成；蛋白胨、牛肉膏不适于细胞生长但利于油脂合成；酵母膏不仅适细胞生长， 而且是油脂合成的最佳氮源氮源的作用是促进细胞的生长，在严重缺氮的条件下，可 观察到细胞内脂类的积累。一般认为无机氮有利于不饱和脂肪酸产生，有机氮有利于 细胞增殖，低c n 比有利于菌丝体产量的提高，高c n 比则促进菌体细胞内的油脂 合成【2 4 】。 1 - 3 2 4 温度对微生物油脂合成的影响 湿度调节脂肪酸成分，是由于细胞对外界湿度变化的一种适应性反应。通常情 况下不饱和脂肪酸的熔点比饱和脂肪酸低，短链脂肪酸比长链脂肪酸低。因此当菌株 从高温转移到低温生长时，细胞膜中不饱和脂肪酸及短链脂肪酸含量增加，主要是棕 榈油酸或油酸等含量的增加；而当温度升高时，平均链长就增长。这些变化都是为了 保证细胞膜的正常流动性和通透性【2 5 1 。 1 3 z 5 l a h 值对微生物油脂合成的影响 产生油脂的最适p h 值依微生物种类而不同，酵母为3 5 - - 6 0 ，霉菌为中性至偏 碱性。构巢曲霉在p h 2 8 7 4 培养时，随p h 值上升，油酸含量增加。而培养油脂酵 母的培养基最初p h 值越接近中性，稳定期细胞油脂含量越高2 6 1 8 浙江大学硕士学位论文 文献综述 1 3 2 6 无机盐和微量元素对微生物油脂合成的影响 一般地对于真菌，适当增加无机盐和微量元素的使用量，可提高产油速度及产 油量。c a r r i d 等人对构巢曲霉的研究表明，调整n a + 、m g “、s 0 4 2 。、p 0 4 3 等离子的含 量比，可使油脂含量由2 5 2 6 ( 生成率6 7 7 9 ) 提高到5 1 ( 生成率1 7 2 ) 。一项有 关油脂酵母产油的实验证明，在培养基中增加铁离子浓度可加快油脂合成，而增加锌 离子浓度( 有些菌株要求维生素b ) 可提高积累量【2 7 1 。任何无机盐及微量元素的增加剂 量都是有限的，不宜过多。 1 3 2 7 培养时间对微生物油脂合成的影响 培养时间对油脂的合成也很重要。如黑曲霉、米曲霉、根霉、红酵母、酿酒酵 母最佳培养时间分别为3 d 、7 d 、7 d ，5 d ，6 d 。培养时间不足，微生物菌体总数达不 到最大量而影响油脂量；培养时间过长，微生物个体变形、自溶，形成的油脂进入培 养基中难以收集，同样影响油脂产量【2 8 】。 1 3 2 8 孢子数量对微生物油脂合成的影响 菌体生长期孢子数量过多，单细胞油脂产量反而可能低。细胞内积存的油脂过 多，又会使菌体失去增殖能力。因此培养产油微生物时应使之达到最佳孢子数量，以 保持菌体的增殖能力和产油生理状态。 1 3 2 9 氧气供给量对微生物油脂合成的影响 微生物利用基质糖类合成油脂及不饱和脂肪酸都需要氧气参与，因此必须供应 充足的氧气【2 9 】 1 3 2 1 0 其他添加物对微生物油脂合成的影响 在培养基中添加乙醇、乙酸盐、乙醛等脂肪酸合成的中间产物或能形成中间产 物的c 2 化合物可增加油脂含量，有些菌株还要求b 族维生素。添加e d t a 可抑制糖 和盐类复合物的形成，减少同化性糖的损失，并增加油脂的含量3 们 浙江大学硕士学位论文文献综述 1 4 微生物油脂的制备 1 4 1 产油微生物菌株的选择 用于生产微生物油脂的菌株应该具备以下条件【3 1 3 2 3 ： ( 1 ) 菌株细胞的油脂积累量应达到5 0 6 0 以上，油脂生成率应高于1 5 1 8 。 ( 2 ) 能进行工业化液体深层培养，培养装置简单。 ( 3 ) 生长速度快，抗污染能力强。 ( 4 ) 油脂易提取。 1 4 2 微生物油脂的制备工艺 微生物油脂的生产工艺流程如下【3 3 1 ： 菌种筛选_ 原料一灭菌一菌体培养_ 菌体收集一预处理一油脂提取一精炼一成 品油脂 1 4 3 微生物油脂的提取 1 4 3 1 l 预处理 微生物油脂大多存在于由较坚韧的细胞壁所包裹的菌体细胞内，部分与蛋白质 或糖类结合以脂蛋白、脂多糖的形式存在，较难分离出来，因此在提取油脂前必须对 菌体进行前处理。前处理方法主要有掺砂共磨法( 将菌体与砂子一起进行研磨) 、与盐 酸共煮法( 共煮使细胞分解有利于获得油) 、菌种自析法和蛋白质溶剂变性法( 用乙醇或 丙醇使结合蛋白变性) 、反复冻融【3 4 】、超声波破碎等方法。 1 4 3 2 油脂提取 用于油脂浸提的溶剂应该使全部油脂物质都能溶解而且要求有足够的极性使其 与细胞膜、脂蛋白等连接键破坏而得以提取【35 1 。 目前，研究者常采用油脂提取方法有：酸热法、索氏提取法、超临界c 0 2 萃取法 ( s c f c 0 2 法) 、有机溶剂法【3 6 1 。 1 0 浙江大学硕士学位论文文献综述 1 4 3 3 油脂分析方法 提取所得油脂需要对所含总油脂定性、定量分析以及对其组成和各组分含量进 行分析检测目前所用的油脂定性分析主要是苏丹黑染色法定性分析菌体油脂【3 7 1 ，而 定量油脂得率通常用的是苏丹黑染色测吸光度绘制标准曲线法定量分析菌体油脂得 率和索氏提取重量差法求油脂得率【3 8 1 。 油脂成份分析一般利用气质联用仪在线检测，即待测样品的酯化茵体油脂加入 5 k o h 甲醇溶液封管水解_ 加1 4 b f 3 甲醇溶液封管甲酯化_ 加饱和n a c i 溶液分 层，以石油醚( b p 3 0 6 0 ) 提取_ 无水硫酸钠干燥_ 挥发溶剂_ 进样测定【3 9 1 。 1 5 微生物油脂的优点与组成 1 5 1 微生物油脂的优点 与动、植物油脂生产相比，微生物油脂生产具有许多优点【4 叫1 ： ( 1 ) 微生物适应性强，细胞增殖快，生长周期短，代谢活力强，易于培养和进 行品种改良。 ( 2 ) 微生物生长所需要原材料来源丰富廉价，可利用农副产品、食品加工及造 纸业的废弃物、农林废弃物等为培养基原料，十分有利于废物利用和生态保护。 ( 3 ) 微生物所需劳动力少，占地面积小，不受场地、气候和季节变化等的制约。 ( 4 ) 能够连续大规模生产，降低成本。 ( 5 ) 微生物油脂的生物安全性好，毒副作用小 ( 6 ) 利用不同菌株和不同培养条件对产品的影响，以及利用细胞融合、细胞诱 变等方法，使微生物产生更能符合人体需要的高营养油脂或某些特定脂肪酸组成的油 脂，如e p a 、d h a 、类可可脂等。 1 5 2 微生物油脂的组成 油脂是微生物生命活动的代谢产物之一。微生物油脂和动植物油脂类似，以两 种形式存在，一种是体质脂形式，作为细胞的结构组成部分存在于细胞之中，在微生 物中含量十分恒定，如微生物细胞膜上的磷脂；另一种形式是贮存脂形式，油脂在微 生物细胞内以脂肪粒或脂滴形式贮存于细胞质中。 浙江大学硕士学位论文文献综述 微生物油脂中甘油三酯占9 5 ，其他脂质( 如糖脂、甘油一酯、甘油二酯) 约 占1 0 少数不常见脂质如硫脂( 硫酸脑苷脂，脑硫脂) 、肽脂、甾醇、羟基脂、蜡 酯、甘油硫酸酯、醚酯等，在细菌( 包括古细菌) 中也有发现。酵母和霉菌还可生产 各种类胡萝卜素、甾醇、脂酰基鞘氨醇类神经鞘脂及糖脂。微生物油脂的成分组成大 致上类似植物油，主要为中性脂肪酸、游离脂肪酸、磷脂及不皂化物【4 2 1 1 6 微生物油脂的应用 微生物油脂的研究方兴未艾，从食品保健行业到粉末涂料、可塑剂、润滑油、 香料和农药生产，以及精细化工上的中间体等行业都有着广泛的用途【4 3 1 1 , 6 1 食品工业 微生物油脂可以作为食品强化剂、添加剂等应用于食品工业。 1 6 1 1 奶与奶制品 从被孢子霉属真菌油脂中提取的中亚麻酸，添加到奶或者奶粉中，可以提高奶 或奶粉的营养价值，使其接近母乳。比如亨氏公司、贝因美、飞鹤乳业、银桥乳业等 知名乳品企业生产的奶粉类产品中已经添加武汉福星生物药业有限公司生产的富含 a a 的微生物油脂。 1 6 1 2 糕点 冷冻糕点都含有一定量的油脂，油脂既是油脂源又能形成产品的质构和口感。 使用富含亚油酸的微生物油脂作为糕点的油脂来源，可使亚油酸和其他活性物质产生 协同增效作用，对高血压、动脉硬化等疾病起到积极预防的效果。 1 6 1 3 乳化饮料 以富含不饱和脂肪酸的功能性微生物油脂作为油相，用乳糖酶对脱脂乳中的乳 糖进行水解，以水解溶液为水相，添加适量的乳化剂，可以制成水包油型的乳化饮料。 此乳化饮料可以代替牛乳，既可以预防动脉硬化，也可以避免乳糖不适症。 浙江大学硕士学位论文文献综述 1 6 1 4 其他方面 微生物油脂在面包制作与酱油新产品中也有应用。 1 6 2 饲料工业 微生物油脂可作为添加剂应用于虾、蛋鸡等的饲料中微生物油脂的粗制品作 为微生物饲料添加剂加入饲料中，可以明显提高畜禽的消化吸收率，改善肉蛋的品质 笙 寸o 1 6 3 医疗方面 人体缺乏多不饱和脂肪酸将产生某些疾病，而补充多不饱和脂肪酸可预防或治 疗某些疾病。微生物油脂富含多不饱和脂肪酸，具有医疗作用。 1 6 4 能源方面 目前生物柴油主要由动物、植物油脂通过转酯化生产，但动植物油脂日益紧缺， 已无法满足人类的需求。微生物油脂的脂肪酸组成类似植物油脂，如菜籽油、棕榈油 和大豆油等，并且富含饱和和不饱和的长链脂肪酸，能够代替食用植物油脂作为生产 生物柴油的原料 1 7 微生物的育种技术 微生物育种是运用遗传学原理和技术对微生物菌株进行改造，去除不良性质， 增加有益新性状的一种育种方法。 1 7 1 常规育种 常规育种是以自然突变为基础，从中筛选出具有优良性状菌株的一种育种方法。 一般情况下，由于d n a 的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、 重组修复、诱导修复等作用，发生自然突变的几率特别低，一般为1 0 。6 一l o o 。据报 道，曾在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac 0 1 0 中分离到一系列增变基因，主要有d n d e ，m u t d ， m u t t ，d a m ，m u t m ，m u t h ，m u t i ，m u t s 等，含有这类增变基因的菌类突变 相对较高1 4 4 1 。富集法筛选技术的不断完善与改进，使常规育种效率有所提高，但选育 浙江大学硕士学位论文文献综述 效果较其他育种方法还是很低。 1 7 2 诱变育种 微生物诱变育种的方法主要有物理诱变、化学诱变、基因工程、离子注入诱变、 基因重组及航天诱变六种方法。 1 7 2 1 物理诱变育种 物理诱变主要有：紫外线、x 射线、1 ，射线、快中子、激光。其中紫外线是一种 使用最早、沿用最久、应用广泛、效果明显的方法。紫外诱变安全，效率高，而且不 易回复突变，在工业微生物育种史上曾经发挥过极其重要的作用，至今仍是微生物育 种最常用的有效的诱变剂之一。其他几种射线都有电离性质，具有穿透力，使用时有 一定的危险性【4 5 】 谷氨酸的生产菌株经紫外线诱变处理，发生了多方面的变异，产酸率提高了 3 1 ，菌体形态从典型的八字形变的长短不一，用电镜超薄切片观察其亚显微结构， 发现细胞厚度及透光度发生变化【4 6 】。 用亚硝酸钠、紫外线等物化方法诱变产碱性蛋白酶的地衣芽抱杆菌，使其从原 来的以玉米粉为碳源转变为以大米为碳源进行发酵产酶，后用紫外线辐射进行诱变， 最终筛选出f 8 0 1 4 菌株，产酶量提高了3 7 4 7 1 。 1 7 2 2 化学诱交 化学诱变常用的诱变剂主要有：天然碱基类似物、5 一氟尿嘧啶、亚硝酸、烷化剂 等。化学诱变的一个主要的优点是：经济、设备要求简单、突变率通常比电物理诱变 高；但化学诱变剂大多是强致癌剂。因此，在使用化学诱变剂时必须十分谨慎，避免 直接接触或吸入其蒸气【4 8 】。 1 7 3 基因工程育种 c o h e n 和b o y e r1 9 7 3 年首次成功完成了d n a 分子的体外重组实验，宣告基因工 程诞生，为微生物育种带来了一场革命【4 9 1 。 基因工程育种技术是在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先 设计和控制的育种新技术，可以完全突破物种间的障碍，实现远缘杂交，可以进行自 1 4 浙江大学硕士学位论文 文献综述 然演化过程中不可能发生的新的遗传组合，创造新物种。因此，基因工程育种技术是 最新最有前途的一种育种新技术【5 0 】。 基因工程育种具有定向性，但是外源基因的表达对微生物的特性产生的影响以 及外缘基因的安全性一直未被确定，而且操作方法比较复杂，限制了基因工程育种的 广泛应用。 1 7 4 离子注入技术 离子注入诱变是利用离子注入生物体引起遗传物质的改变，导致性状变异，从 而达到育种目的经加速后的离子具有一定的静止质量，注入生物体后可以使质量、 能量和电荷共同作用于生物体，不同的质量数、电荷数和能量又可以根据需要进行组 合因此，离子注入生物体后质、能、电的联合作用比其它电离辐射对生物体的作用 内容更为丰富和复杂【5 l 】。 离子注入技术最先用于农作物小麦，水稻等的育种，现在己应用于动植物和微 生物育种。离子注入技术已育成的优良菌种包括细菌、霉菌、酵母菌等。在抗生素产 生菌、酶制剂产生菌及生物制品产生菌等方面菌种选育上取得了非常好的效果。 1 7 5 基因重组育种 基因重组育种包括常规杂交、控制杂交和原生质融合等方法。 杂交育种方法复杂，许多工业微生物有性世代不十分清楚，所以在工业微生物 育种中，应用转化、转导或结合等重组技术来培育应用于生产实践中的高产菌株的例 子还不多见。 原生质体融合育种是2 0 世纪6 0 年代发展起来的基因重组技术用水解酶除去 遗传物质转