（食品科学专业论文）原料乳中金黄色葡萄球菌的分离及PCR检测.pdf

摘要 摘要 食源性疾病是近年来倍受关注的话题之一，对相关的食源性致病菌的检测研究受到 了前所未有的重视，其中细菌性食物中毒又占据了重要地位。金黄色葡萄球菌( 金葡菌) 是引起食物中毒的主要病源菌之一，同时也是引起奶牛乳房炎及多种临床化脓性感染的 主要病原菌，其快速检测技术一直是研究热点。p c r 技术自问世以来由于其本身高特异 性、灵敏生及操作简便等常规方法无法媲美的优点而被广泛应川于包括食品微生物检测 在内的诸多领域。 本实验首先利川金葡菌的高度耐盐性及法国梅里埃公司的选择性培养基 ( b a i r d p a r k e r + 兔血浆) 自行从乳中分离出金葡菌菌株；对阳性标准株a t c c 2 5 9 2 3 、 自行分离金葡菌株，以及大肠杆菌、沙门氏菌等阴性对照菌同时进行p c r 扩增以是否 出现2 7 9 b p 条带为标准验证h u e 基因对金葡菌的特异性，完成了p c r 扩增产物的洲序并 与g e n e b a n k 中标准序列v 0 1 2 8 l 比对，结果显示两者有9 9 的同源性，进一步确定了扩 增片段的特异性：通过比较7 5 乙醇、丙酮预处理后的扩增效果确定了丙酮处理对金葡 菌细胞壁有更好的裂解作川；以影响p c r 反应的主要因素：m g ”浓度、引物浓度、d n t p 浓度及t a q 酶浓度为对象进行了单因素及多因素正交优化实验，并最终确定了各成分的 最佳配比为：m g ”2 u l 、引物2 u l 、d n t p 3 u l 、t a q 酶15 u 。在上述实验条件下确定了检测 灵敏性为1 2 1 0 5 c f u m 1 菌或1 99 5 n g d n a ；干扰实验表明火肠杆菌和沙门氏菌对特异性 扩增及灵敏性无明显影响；培养基增菌检测实验表明：初始菌浓度为1 5 1 0 4 、1 0 3 、 1 0 2 c f u m l 时p c r 方法可分别在培养4 h 、6 h 及l2 h 后检出。 比较了生理盐水洗涤、p b s 缓冲液洗涤和有机试剂处理三种方法对乳中金葡菌d n a 提取的不同影响作j _ ；j ，确定了有机试剂处理对排除乳中背景基质的影响作用效果最好； 灵敏性实验表明可检测出乳中存在的32 1 0s c f u m i 金葡菌，或2 5 4 n g d n a ，这与培养 基中的检测灵敏性接近；初步比较了不同乳脂含量、乳钙含量对p c r 反应的影响作刚， 发现乳脂含量对扩增结果无明显影响，而乳钙含量则相对米说有更明显的影响作川： 对典型的市售食品( 羊肉片、豆腐干、肉肠、巴氏乳) 进行了增菌检测实验，虽然 由于各次实验中初始接菌量及增菌条件略有不同而导致检测结果出现了一定的差异，但 从整体来看，初始菌鲑为1 0 、l0 2 、1 0 3 c f u m l 时各种食，锅中均可以在1 0 h 内检测出。 本实验验证了n u e 基因在金黄色葡萄球菌鉴定实验中的特异性，通过优化反应条件 确定了p c r 检测的灵敏性，并完成了儿种常见市售食r 铺的模拟检测实验，证明了以r l u c 为目的基因的p c r 检测方法在实际病原菌检测时的可行性。 关键词：金黄色葡萄球菌p c r 检测食r 诮 ! 玺i ! 垒些查耋；! 耋堡兰耋堡垒耋! t h ei s o l a t i o na n dp c r b a s e dd e t e c t i o no fs a u r e u s a b s t r a c t f o o d b o r n ed i s e a s e sh a dr e c e iv e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n st h e s e y e a r s ，p a t h o g e n sw e r ec o n s i d e r e dt ob eo n eo ft h e o s ti m p o r t a n tr e a s o n si nc a u s i n g f o o d p o is o n in ga g e n tsa n dt h er a p i dd e t e c t i o nr e s e a r c hh a db e e ns t u d i e dd e t a i l y r e c e n ty e a r s s f a j 9 冉，o c o c c u sa u r p ，s ( s a u r e u s ) p l a y e da ni m p o r t a n tr 0 1 ei nf o o d p o is o n i n ga c c i d e n t sa n db o v in em a s t ic ( b m ) ，a n dt h er a p i dd e t e c t i o n e t h o d sh a d b e e ns n l d i e dd e t a i l l yt h e s ey e a r s d u et ot h es u p e r i o r i t i e ss u c ha sh i g hs p e c i t y ， s e n s i t i v i t ya n ds i m p l ep r o c e s s e s ，t h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r )h a db e e n u s e df r e q u e n tl yi na1 0 t o fa r e a si n c l u d i n gp a t h o g e n s r a p i dd e t e c t i o n i no u re x d e r i m e n t s f ir s t l yw eis o l a t e ds o es t r a i n so fsa u r e u sf r o mr a w m i l ks a m p l e sa c c o r d i n gt ot h e irr e s is t e n c et oh i g hs a l tc o n c e n t r a t i o n sa n d c u l t u r e dins e le c t i v e m e d i u mb a ir d p a r k e r + r p fd r o d u c e db yb i o m e r i e u x t h e nw e a m p l i f ic dt h et a r g e tg e n en u ci n a 1l is o l a t e ds t r a i n s 、p o s i t i v ec o n t r 0 1s t r a i n a t c c 2 5 9 2 3 、n e g c t i v es t r a i n ss u c ha se c o l i 、s a l m o n e l l aa n dt h ee x p e c t e da m p l i f i e d b a n do f2 7 9 b pw a sc o n s i d e r e dt ob e t h es t a n d a n do fs p e c i a l i t y ，f u r t h e r m o r ew e c o m p a r e dt h ep r o d u c t ss e q u e n c ew it ht h ev 0 1 2 8 1i ng e n e b a n ka n d t h e r e s u l t i n d ic a t e d9 9 i d e n t i f i c a t i o n ， w h i c h s u g u e s t e dg r e a ts p e c i a l ic y o fo u r a m p l i f i c a l i o 【1 i no r d e rt oc h o o s ear e l a t iv es u p e r i o ra p p r o a c hf o rt h ee x t r a c t i o n o f d n a ，w ec o m p a r e dt w op r e p r o c c s s e dm e t h o d si n c l u i n g7 5 e t h a n o la n d a c e t o n e ，t h e nt h er e s u l t ss h o w e dt h a ta c e t o n ew a sm o r es u i t a b i ei ne x t r a c t i n gi ) n a ： t h e nw cc h o s ef o u rm a j o rf a c t o r si np c ri n c l u d i n gm g 。、 p r i m e r s c o n c e n t r a t i o n 、 d n t p 、j a qc o n c c n t r a t i o n a n dd idaf c wo ft e s t sw i t hs i n g l ef a c t o ra n dm u l t i p l e x f a c t o r so r t h o g o n a le x p e r i m e n ts ，a t 】a s tw ec o n f i r e dt h em o s ts u p e r i o rc o n d i t i o n s f o rp c rd e t o c t i o nw h i c hc o n s isc e do f g 。2 u l 、e a c hp r i m e r2 u l 、d n t p3 u l 、t a q1 5 ua w i t hs u c hc o n d i t i o n so u re x p e r i m e n t ss u g g e s t e dt h ed e t e c t i o nl i m i t i o nw a s 1 0 1 c f u m lsl r a in sa n dl g9 5 n 碍d n ae a n w h il et h ei n t e r f e r i n ge x p e r i m e n t ss h o w e d t h a tt h ee c o lia n ds a l m o n o l a rd l a v e d1i t t l er o l eo no u rd e t e c t i o nl i m i t i t i o n e n l a r g e dc u l t u r ee x p e r i m e n t ss h o w e dl h a tw ec o u l dd e t e c tp o s i t i v er e s u l t si n4 h 、 6 ha n d1 2 hr o s p c c t i v e l yj na c c o r d a n c ew i t ht h eo r i g i n a ls t r a i n s c o n c e n t r a t i o n s 1 5 l o 。、1 0 1 、1 0 。c f u m l t of in d t h eb e s ta p p r o a c hf o ro x tr a c t i n gd n af o r msa u r e u si n i l ks a m d l e s ， w ec o m p a r e dt h r e ed i f f e r e n tp r o c e s s i n gm e t h o d si n c l u d i n gb r i n ew a s h i n g 、 p b s b u f f e rw a s h in ga n do r g a n i cr e a g e n t st r e a t m e n t ，t h er e s u l tsc o n f i r m e dt h a to r g a n i c r e a g e n t sw e r em o r ee f f e c t i v e ：t h ed e t e c t i o n1 i m i t i t i o na c h i e v e d3 2 l o 。c f u m l a n d2 5 4 n g d n a ， w h i c ha p p e a r e dt h es a m el e v e la sw h a tw eh a v ed o n eb e f o r ei np u r e c u l t u r e s ：af e wo fe x d e r i m e n t sw e r ed o n et oc o m d a r et h ed i f f e r e n te f f e c t so fm i l k f a ta n dc a 2 + o np c r ，a n dt h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tm i l kf a td i d n ta f f e c to u r a m p i i f i c a t i o nr e s u i t sa p p a r e n t l y ，b u tt h ec o n c e n t r a t i o no fc a ”d i d as e r i e so fe n l a r g e dc u l t u r i n ge x p e r i m e n t sh a db e e nd o n et od e t e c tt h eq u a n t i t y o fs a u r e u si nf o o ds a m p l e ss u c ha sm u t t o n s 、b e a nc u r d s 、s a u s a g e sa n dp a s t e u r m il k a 1 t h o u g ht h e r ew e r es o m e w h a t d i f f e r e n c e si nt h e s et e s t s o p e r a t i o n c o n d i t i o n sa n do r i g i n a ls t r a i nc o n c e n t r a t i o n ，w ec o u l dd e t e c ta 1 1 t h es t r a i n s i n c l u d i n gi 0 、1 0 2 、1 0 4 c f u m l i n1 0 h o u re x p e r i m e n t sc o n f i r m e dt h es p e c i f i t yo fn u cg e n ei ns a u r e u s d e t e c t i o n ， a n df u r t h e r m o r e w ea s c e r t a i n e dt h ed e t e c t i o nl i m i t i o no fp c rb yo p t i m i z i n g r e a c t i o nc o n d i t i o n s as e r i e so fe x p e r i m e n t sw e r ed o n et od e t e c tt h ea r t i f i c i a l l y p o l l u t e df o o ds a m p l e s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a to u rd e t e c t i o nm e t h o du s i n gn u c a s t a r g e tg e n ew a sf e a s i b l e k e yw o r d s ：s t a p h y l o c o c c u sa u r q u sp c rd e t e c t i o nf o o d c a n d i d a t e ：j i a n gy a n l o n g s p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：h u og u i c h e n g 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 壁；塑熊互基熊盂要壁型童塑的：奎拦互窒) 或其他教育机构的学位或证书使用 过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名喜蛳 日期刈年6 月阮 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权学校可以将学位沦文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文 在解密后适用本授权书。) 学位论文作者签名：猫 日期：洳6 年占月胂 导师签名 日期：沙锌月伽 1 引言 金黄色葡萄球菌( 以一f 简称金葡菌) 属于微球菌科葡萄球菌属，在自然界中无处不在， 空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中部可找到( 韩北忠，2 0 0 5 ) 。因而，食品受其污染的 机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金葡菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆 菌。金葡菌肠毒素是个世界性卫生问题，如2 0 0 0 年日本“雪印奶粉”事件中1 4 0 0 0 多人中 毒是该致病菌的典型案例；在美国由金葡菌肠毒索引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的 3 3 ，加拿大则更多，占4 5 ，我国每年发生的此类中毒事件也非常多，同时金葡菌也是引 起奶牛乳房炎的主要病原菌。 1 1 研究意义及目的 随着近年米消费者对食品安全的关注及国际贸易环境的要求，食品安全问题得到了前所 未有的重视。食源性疾病可以由微生物性、化学性雨i 物理性危害所致。过去儿十年中，大多 数国家病例报告中微生物性食源性疾病发生率一直在增加，在美国由致病菌造成的损失达 3 5 0 亿美元，而发展中国家的情况更为严重。当前对食源性致病菌的安全评价已经由安全性 评价过度到危害性评价，因此世卫组织等机构已经建立了微生物危险性评估专家联席会议， 开展微生物危险性评估以保证微生物食品安全。全世界所有的食源性疾病中6 6 以上的为细 菌性致病菌所致。w t o 的s p s 邯定已经将危险性分析指定为卫生措施的科学基础，通过定 量危险性评估实现食品安全评估。金黄色葡萄球菌由于其分布广泛、适应性强，故虽然其危 害程度不如沙门氏菌、火肠杆菌o l5 7 等但同样引起大量的食物中毒事件。而传统的食品 微生物检测方法常需要3 。5 d 才能得到结果，虽然准确但耗时过长，无法满足当前食品安全形 势的要求，因此，食品级致病性微生物的快速检测研究受到越来越多的重视。 牛乳作为一种广泛食川并且是无数加：【：食品原( 辅) 料的重要动物源性食品品种，是人类最 理想的营养食品之一，然而牛乳也是一种最易遭受污染而腐败变质的食品之一。在国内，对牛 乳中致病菌监测局限于一般性的细菌总数或与牛有关的病原微生物，而对于易污染牛乳并引 发严重人群食物中的致病菌涉及较少。从历史的总结资料来看，大部分的食品卫生问题是由致 病性细菌引发。细菌性污染趋涉及面最，影响最大，问题最多的一种污染，而且未来这种现象 还将继续下去。牛乳中污染了沙门氏菌、金葡菌、李斯特茁、结核杆菌等细菌后易引起大规 模食物中毒爆发等食源性疾病。监洲结果表明，金葡菌是污染牛乳的重要致病菌，金葡菌的污 染率较高同奶牛乳房炎患病率高有密切关系，患乳房炎的奶牛乳汁中以金黄色葡萄球菌的带 曲率最高，其次是大肠柑：茵平链球菌。 肠毒素( s e ) 是金葡菌引起食物中毒的主要致病因子，传统分型包括七型，即s e as e b 、 s e c l 、s e c 2 、s e c 3 、s e d 和s e e 。如果存在于食品中的金葡菌在适宜的条件下大量繁殖， 就很可能产生毒索，发生食物中毒，因此对肠毒索的检测一直以米倍受研究人员重视，而对 总金葡菌数的检测虽也有相当的研究，但其受重视程度远不如前者。然而值得注意的是，肠 毒素的产生是需要一定外界条件的，很多时候食品中存在大量的金葡菌但由于生长环境不适 东北农业大学工学硕：i ：学位论文 宜，它们并不会产生肠毒索，而在新的环境条件下又可能迅速产生毒索，因此这时对肠毒索 的检测显然无法满足食品安全的要求。而对金葡菌数量的检测，虽然不能直接说明其是否已 经产生肠毒索，但的确可以说明潜在的危险性，具有重要的应j _ | ；| 价值。因此我们认为：对肠 毒素及总金葡茁数的检测，分别在不同方面显示了对食品安全问题的指示作用，各有利弊， 可结合检测。一般认为，当每克m i 食物中含有约1 0 6 或1 0 6 个细菌时应引起注意，j a b l o n s k i a n db o h a c h 指出当存在1 0 c f u m l 的金葡茁时容易引发毒索中毒( d e r c o l i n i ，2 0 0 4 ) 。本 实验拟通过金葡菌特异基因n u c 的p c r 检测来确定食品中存在的金葡菌数量，以此为指标评 价食品的安全隐患。 1 2 金黄色葡萄球菌概述 典型的金葡菌为球型，直径0 8 p m 左右，显微镜下排列成葡萄串状，无芽胞、鞭毛，大 多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金葡菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼 性厌氧，展适生长温度3 7 。c ，最适生跃p h7 4 。在普通营养琼脂平板上培养2 4 4 8 h 后，可 形成圆形凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明菡落，直径通常1 2 r a m ，但也 有大到4 - 5 m m 者；血平板菌落周围形成透明的b 溶血环；有高度的耐盐性，可在1 0 1 5 n a c i 肉汤中生长，适宜生k 的盐浓度为5 一7 5 ，可以利用这个特性对金葡菌增菌，抑制杂菌： 可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱，所以在b a i r d - - p a r k e r ( 含 卵黄和亚碲酸钾) 平板上生k ，菌落为黑色，周围有一混浊带，在其外层有一透明圈，利用 此特性可分离金葡菌。金葡菌还可产生凝固酶，凝固酶可使血浆中的血浆蛋白酶原变成血浆 蛋白酶，使血浆凝固，这是鉴定致病性金葡菌的重要指标( 牛天贵，2 0 0 3 ) 。金葡菌在食品 污染病例中占据十分重要的位置，同时也是医院临床感染导致肺炎及伤口感染的主要病原 菌，占医院感染病例的1 0 ；而抗生素的广泛应用导致了耐药菌株尤其是耐甲氧西林葡萄球 菌的大量出现，使其成为与爱滋病、乙型肝炎并列的世界三大感染顽疾( 杨正时，2 0 0 3 ) 。 因此对金葡菌的检测研究一直以来备受重视，其研究方向主要集中在两个方面：耐甲氧西林 金葡菌的检测及产致病性毒素金葡菌的检测。 1 3 耐甲氧西林金葡菌( m e t hic iiin r e sis t a n t s t a p h y o c o c c u sa u f 6 u s ，m r s a ) 检测 抗生素的火量使用促进了耐药性菌株的不断出现，尤以耐甲氧西林菌为主。该菌主要包 括耐甲氧西林金葡茁( m e t h i c i l l i nr e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 。m r s a ) 平【| 凝【州酶阴性葡萄 球菌( c o a g u l a s en e g a t i v es t a p h y l o c o c c i ，c n s ) 中的表皮葡萄球菌( s e p i d e r m i d i s ，s e ) 。 1 3 1 m r s a 检测方法 目前临床常采用的, m r s a 检测方法大致分三类( 乔文涛，2 0 0 1 ) ：除了针对m r s a 的耐药性 表型的传统药敏性实验及一些快速成品鉴定试剂盒外分子生物学手段已经日趋成熟，主要 包括基因探针技术 i i p c r 技术。 金葡苗的耐药性是由染色体和质粒共同控制的， m e cd n a 是耐甲氧西林葡萄球菌特有 的d n a 序列，| 丈约3 0 4 5 k b ，位于细菌染色体上( 杨正时，2 0 0 3 ) ：m e c a 基因大量表达一 种特殊的与b2 内酰胺类抗生索结合活性很低的青霉素结合蛋a p b p 2 a ，因此表现出耐药性 它包含于一个被称为s c c m e c ( s t a p h y l o c o c c a lc a s s e t t ec h r o m o s o m em e c ) 的基因构件中， 该构件以一系列位点特异性重组基因c c ra 、c c r b 的末端反向及正向重复为特征，且插入到 一功能未知的开放阅读框o r f x 的3 端( a h u l e t s k y ，2 0 0 4 ) 。另有研究表明m e c a 基因的表达 受控于其上游的m e c r i m e c 【凋控基因，呈现可诱导表达( e p e l i n a k i ，2 0 0 1 ) 因m e c a 在耐甲 氧西林凝刮酶阴性葡萄球菌( m e t h i c i l l i nr e s i s t a n tc n s ，m r c n s ) 中也有检出，因此单独 检# j ! j m e c a 的存在与否米判断是否为m r s a 不够准确，而检测m r s a 的分子技术主要基于同时检测 sa u r e u s 特异性基因及m e c a ：f e m a ( f a c t o r se s s e n t i a lf o rt h ee x p r e s s i o no fm e t h i c i l l i n r e s is t a n c eg e n e ) 是m r s a 耐弱辅助基因且在m r c n s 中很少存在( 陈智鸿，2 0 0 3 ) ，因此 m e c a 与f e m a 基因的联合检测方法己被广泛接受；l l o u i e 等人通过对m e c a 、1 6 s d n a 及耐热核 酸酶基因n u c 的同时扩增很好的检测了m r s a 的存在( l l o u i e ，2 0 0 2 ) ：同i b g r i s o l d a j 等人以 s a u r e u s 特异性基因s a 4 4 2 为内参同时扩l 曾m e c a ，可有效排除m r c n s 干扰，且利用了自动提取 d n a 殴备，使结果更加可靠( g r i s o l d a j ，2 0 0 2 ) 。 1 3 2m r s a 基因分型技术 m r s a 与m s s a ( 甲氧西林敏感金葡菌) 相比，前者的基因多态性较低，迄今为i t 一些 基因分型技术已经应删到f i f i 床检验中，主要包括：质粒分析、酶处理后的染色体d n a 分析、 s o u t h e r n b i o t 探针杂交、脉冲场凝胶l u 泳( p u l s e df i e i dg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p f g e ) 法 分析染色体d n a 、p c r , f h 关技术、m l s t ( m u l t i l o c u ss e q u e n c e t y p i n g ) 等。p c r 用于微生物 分型主要有四种方法：p c r r f l p 、p c r r i b o t y p i n g 、a p p c r ( r a p d ) 及r e p - p c r ，而在m r s a 分型中主要应用后两者( p a t r i n d a d e 2 0 0 3 ) 。p f g e 结果可靠且有很好的重复性，但操作 复杂、耗时长：a p p c r 操作简单快速，但重复性较差；相比而言，r e p p c r 不仅操作简单、 快速，而且结果重复性好( a n n e k ev a nd e r z e e ，1 9 9 9 ) 。 1 4 产毒素金葡菌的检测方法概述 金葡菌的致病力强弱主要取决于三类毒力因子：产生的毒素、侵袭性酶和其他结构成分： 毒素：肠毒素( s t a p h y l o c c o c c l ae n t e r o t o x i n ，s e ) 、毒性体克综合征毒素一1 、表皮剥落毒 銮j l 堡些丕兰：! 兰竺：! ：主垡丝苎 素、溶血毒索及杀自细胞素等：侵袭性酶：血浆凝吲酶、耐热脱氧核糖核酸酶、纤维蛋白溶 解酶、透明质酸酶、脂酶等：其他：粘附素、英膜、胞壁肽聚糖等。 1 4 1 传统检测方法 检测食品中金葡菌的两个常用方法( 李卫华，2 0 0 4 ) 是：在b a i r d p a r k e r 培养基上直 接划平板，或先用6 i o i i t t i 和c a n t o n i 亚碲酸盐甘露醇甘氨酸肉汤对食品增苗，然后在奶 盐琼脂上划线分离菌落；i s 0 d i s 6 8 8 8 1 标准先用b a i r d p a r k e r 培养基分离茁落，然后用凝 固酶和耐热核酸酶反应进行验证；i s 0 d i s 6 8 8 8 2 的方法中，用兔血浆纤维蛋白原琼脂代替 了b a i r d p a r k e r 培养基，葡萄球菌在这种分离培养基上凝固酶反应呈阳性。 对于金黄色葡萄球菌含量较低的食品可用最近视值法进行检验。先用g i o l i t t i 和 c a n t o n i 培养基对样品增菌，然后划线接种所有培养基颜色变黑的试管。对肠毒索的检测曾 由于不能有效的进行实验室试验而一度停滞了许多年，除了人以外，唯一令人满意的实验动 物是猴子和猫，常用的实验动物如小鼠，豚鼠和家兔等都没有呕吐机制：猴子价格昂贵，而且 马上就对肠毒素产生骶抗陛猫往往出现非特异性的呕吐：而现阶段利用人类志愿者进行实 验显然不现实，所有这些因素都决定了肠毒素的动物实验进展缓慢：虽然对有关肠毒索与某 些葡萄球菌的生物学反应作了一些尝试，但唯一适用于检测肠毒索的方法是根据毒素对己鉴 定的毒素抗体的反应，即免疫学反应( h d 格来翰著，黄伟坤译，1 9 8 7 ) i c m s f ( 1 9 7 8 ) 推荐了 两种提取和浓缩食品中肠毒索的方法( 李卫华，2 0 0 4 ) ，再_ e ! | 载波片凝胶扩散实验进行肠毒 素的检测和鉴定。该方法能检测出引起食品中毒的毒素的最小浓度。用亲和层析柱等技术能 有效浓缩肠毒素，但在操作过程中，有时会造成毒素的损失。 1 4 2快速检测方法 所说的快速检测方法，通常是指能够在一次实验中同时检测多个样品、多个指标或，和减 少检测时间的方法，它们具有方便、灵敏、特异和快速等优点。针对食源性病原茁的检测方 法很多，概括起来主要包括微型化生化试剂盒、以抗原抗体反应为基础的各种免疫学方法， 以及对d n a 为基础的分子生物学方法。 ( 一) 微型化的生化试剂盒：是对传统培养方法的改良，通常将十多种甚至儿十种培养基 或其成分集成在特定的微型化装置中，将传统方法中需要多次实验才能完成的任务一次完 成，并在1 8 2 4 h 内获得结果，少数还能在4 h 内获得结果，节约分析时间；同时，可以节约 试剂，：竹省检测成本。目前已经有很多市售的_ _ j 于检测金葡菌的成品试剂盒，如a p i 、m i s 、 w a l k a w a y 等，可根据微生物生长代谢中产生的相关产物或现象米对实验结果进行分析和判 定。 免疫学方法：各种免疫学方法的基本过程是相同的，由于食品中的病原菌数量一般比 较低，且有些成分可以干扰实验结果，所以首先要进行病原菌的选择性富集培养，然后再对 富集物进行免疫检测和分析。前者通常需要1 8 - 2 4 h ，甚至更睦时间，而免疫检测过程则仅需 4 j l d , 时，甚至几分钟。因此减少检测时间更重要的是减少样品的富集时间，如可以采川免疫 磁珠分离方法或免疫膜富集技术，实际应川中常常是将免疫富集技术与免疫学方法或其他方 法如分子生物学方法结合起来使用。当然，免疫学方法也有许多需要改进的方面，主要包括 交叉反应比较严重、假附性多、灵敏度偏低。目前对于金葡菌的测定主要进行了肠毒索的测 定，方法目前以r p l a 利r p h a 酶联免疫吸附试验为主，也有用亲和索一生物索乳胶凝集的方 法和放射免疫试验，但都有一定的局限性。同时也有针对凝同酶的免疫检测方法，但随着凝 阎酶阴性菌致病作用的日益凸现，这些方法显然无法满足检测要求。现在也有许多试剂盒， 如以l a 及e l i s a 反应为基础的s t a p h y l o s l i d e 、a u r e u st e s t 等。 分子生物学方法：主要包括核酸探针( n u c l e a ra c i dp r o b e ) 和聚合酶链反应 ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 的检测技术，该技术以其敏感、特异、简便、快速的特点成 为世人嘱目的生物技术革命的新产物，业已逐步应川于食源性病原茁的检测。核酸探针以法 国生物梅里埃公司的g e n p r o b e 系统为代表，采用杂交保护分析法( 1 i p a ) 研制成金葡菌检 验和鉴定试剂盒，其原理为：检测茁的细胞经溶解后，释放出目标r r n a ，目标r r n a 在6 0 。c 与标记物( a c r i d i n i u me s t e r ，a e ) 探针杂交，形成有标记物的杂种d n a ，在选择性试剂的作 用下，游离探针的化学发光标记物融化，杂种d n a 的化学发光标记物受到保护。加入检测 试剂( h 2 0 2 o h ) ，化学发光分子被氧化水化发出强光。朋发光计量仪检测光强度( 王晶， 2 0 0 2 ) 。由于s a u r e u s 可在灭活前产生耐热的毒素，p c r 检测时可以针对活菌、受损菌及死 菌，而传统的培养法只能检测到活菌，对因加热或其他因素导致的受损菌则无法鉴别，因此 p c r 法在这方面更具优越性，可以更有效的表明产毒素潜力( g a b r i e l an a ，2 0 0 3 ) 。此 外，还有一些新的技术如基因：蕃片，可以利川1 6 s r n a 种属特异性在4 5 h 内检测到2 3 5 c f u m l 金葡菌( 翟俊辉，2 0 0 3 ) ：温尚昆将金葡菌p x1d n a 提取并酶切后，与p u c l 8 质粒连接并 转化构建基因文库，p c r 扩增基因文库产物制备芯片( 温尚昆，2 0 0 5 ) 。 1 5 毒素基因的分子生物学检测 由于金衙菌的致病性主要与其产生的各种毒素有关，因此关于各种毒素的基因检测一直 以来都是研究的热点。针对不同毒素的产生基因主要包括： ( 1 ) 肠毒索基因：肠毒索是金葡菌产生的一种耐热的外毒素，是其主要致病因素，有报告 表明近5 0 的金葡菌菌株在实验室条什下能产生肠毒素，并且一个菌株能产生两种或两种以 上的肠毒索，现已鉴定出的肠毒素有a 、b 、c i c 3 、d 、e 、g 、h 、i 、j 1 1 种。一般米说， 食物中毒时毒素a 、d 型常见，b 、c 型次之，涉及到e 毒素的发生率最低，各肠毒素毒力 不一，a 型毒索毒力较强，d 型较弱( 江汉湖，2 0 0 2 ) 。对肠毒素的检测方法主要包括经典 的免疫学实验、动物实验等，当然也有一些其他的现代方法，如向四海等人通过表面等离子 体技术检测了肠毒素b ( 向四海，2 0 0 3 ) 。鉴于传统方法的低灵敏性、低专一性，目前的检 测手段已越米越趋向于分子生物学方法，针对特异性产毒素基因，如传统的s e a 、s e b 、s e c 、 s e d 基因及新发现的肠毒素基因s e i 、s e j 等进行p c r 及探针检测，这也是当前分子生物学 用于检测致病性金葡菌最常用的手段。多数产肠毒素的基因位于染色体上，且一般至少有两 东北农业大学工学顶：l 学位论文 个基因位点；少数由质粒控制，且通常与耐药性基因处于相同质粒中，如s e d 基因位于2 7 6 k b 的质粒p i b 4 8 5 上，用e b 消除p i b 4 8 5 时，菌株的耐甲氧西林性状随之消失：s e b 基因亦与 青霉索抗性质粒相关，8 0 的青霉索抗性菌株可产生s e b ( 杨正时，2 0 0 3 ) 。针对肠毒素不同 基因的p c r 检测已有大量报道，不再赘述。 ( 2 ) 毒性休克综合征毒素一1 ( t o x i cs h o c ks y n d r o m et o x i nl ，t s s t 1 ) ：由噬菌体i 群 金黄色葡萄球菌产生的一类蛋白质，可引起机体多个器官系统的功能紊乱或毒性休克综合征 ( t s s ) 。最早发现于1 9 8 7 年，称为肠毒素f 或热源性外毒素( p e c ) ，后统称为t s s t - i ， 该毒素在美国的病死率为1 3 。编码t s s t 1 的基因位于染色体上( 杨正时，2 0 0 3 ) ，t s s t - 1 的蛋白质密码序列氏度为5 8 5 个碱基对( 1 9 4 个氨基酸) ，据此推测其分子量为2 2 0 4 9 。b e c k e r k 等人在对4 2 9 株分离金葡菌进行的p c r - d e i a ( p c r d n ae n z y m e i m m u n o a s s a y s ) 检测中， 发现有约2 0 的菌株可扩增出t s s t - l 基因( b e c k e rk ，2 0 0 3 ) ( 3 ) 表皮剥落毒素( e x f o l i a t i v et o x i n ，e t ) ：由噬菌体1 1 型金葡菌产生的一种外毒素， 分为a 、b 两型，可引起人的葡萄球菌性烫伤样皮肤综合症( s t a p h y l o c o c c u ss c a l d e d s k i n s y n d r o m e ，s s s s ) ，常见于新生儿，病死率2 0 。其中e t a 为染色体编码，e t b 基因则位 于2 7 x1 0 6 d a 的质粒上( 杨正时，2 0 0 3 ) 。b e c k e rk 等人在对4 2 9 株分离金葡菌进行的 p c r d e i a ( p c r d n ae n z y m ei m m u n o a s s a y s ) 检测中，成功扩增山e ；基因，同时表明只有 少数菌株具有产该毒素能力( b e c k e rk 2 0 0 3 ) ；h a y a k a w ay 等人对乳房炎金葡菌分离株的e t a 基因及其调控基因( a c c e s s o r y g e n er e g u l a t o r , a g r ) 进行了p c r 扩增，发现其与人源分离株e t a 基因仅在o r f 上游区存在三个硷基的差异；此外，尽管在3 2 个位点存在差异，人源分离株 e t a o r f 上游1 2 0 b p 处的o r f ( j - 4 ) 也在乳源菌株中被发现，表现出了一定的保守性 ( h a y a k a w ay 2 0 0 1 ) 。 1 6 金葡菌特异性鉴别基因及研究进展 以p c r 技术为主体的现代生物技术手段在金葡菌检测方面的应用，除了主要针对金葡菌 致病性基因外，近年米很多学者逐渐探索了一些有很强种束特异性的鉴别基因，主要包括： ( 1 ) 耐热核酸酶基因( h e a ts t a b l e i u c l e a s e ，n u c ) 耐热核酸酶( t h e r m o s t a b l e n u c l e a s e ，f t n a s e ) 是金葡茁的特异性酶，通过检测t n a s e 酶活 性以鉴定金葡菌通常有较好的专一性和准确性，但也存在一些非金葡菌株可检测到该酶活性 的例子，其原因尚不清楚，可能是由于其可产生与t n a s e 活性相似的酶( o d dg b r a k s t a d ，1 9 9 2 ) 。编码酶蛋白的n u c 基因已全部定序。通过h u g 基因的特异扩增来检测 金葡菌已被证实具有非常好的特异性，避免了检测酶活时出现的假| j | ! | 性现象，有很好的应用 前景，扬州大学比较医学中心高正琴，邢华等人以鼠感染金葡菌为对象，通过扩增h u e 基因可以 在4 h 内检测到最低3 p g d n a 或5 个金葡菌，并由此制备了特异性探针，检测灵敏度达 1 p g d n a ，符合率为1 0 0 ( 高正琴，2 0 0 3 ) ；中国医科大学田静等人以n u c 基因和表面纤 维蛋白原结合蛋白c l f a 基因为目的基因，对5 2 株金葡菌及3 l 株非金葡菌进行了p c r 扩增， 证实了h u g 基因对金葡苗的特异性并在1 07 c f u m l 时可检测，同时进行的人为污染消毒牛奶样 6 0 i 言 品实验表明，牛奶中金葡菌菌量l o c f u m l 时该方法可通过增苗6 8 h 后检山( 田静，2 0 0 4 ) ( 2 ) s t a p h o p a i n a b ：s a p h o p a i n s 是一种与葡萄球菌致病性相关的、外分泌型! 仁胱氨酸蛋白水 解酶，包括a 和b 两种，分别由基因s c