（食品科学专业论文）猪肺抑肽酶的分离纯化及部分性质研究.pdf

摘要摘要抑肽酶是一种非特异性、多功能蛋白酶抑制剂，广泛应用于临床。目前的提取抑肽酶的方法主要是“二步法”，这种方法存在着污染大、成本高、周期长的缺点。为此，我们以交联壳聚糖微球固定化胰蛋白酶，亲和层析纯化抑肽酶。传统的提取原料主要是牛肺、人尿、胰蛋白酶结晶母液等。但从猪肺中提取抑肽酶，还未有文献报道，我们试探性地从猪肺中提取抑肽酶。实验结果表明：1 用反相悬浮交联法制备出粒度均匀的交联壳聚糖微球，并用其固定化胰蛋白酶，制备新型固定化酶，其最佳固定化酶的条件：用终浓度为0 6 的戊二醛，在5 0 c 下，先处理交联壳聚糖微球6 h ，再置冰浴中加酶为1 2 m g g ，搅拌2 4 h ，固定化酶活性回收率达5 3 8 固定化酶的最适温度为8 0 、最适p h 为8 、表观米氏常数( 1 ( - ) 为3 1 6 m m o l l 。与壳聚糖作为固定化酶载体相比，新型固定化酶具有吸附容量大、机械强度好、粒度均匀、耐酸碱、对牛血清白蛋白非特异性吸附较弱，洗脱时无明显压床现象等优点。2 以新型固定化酶作为吸附剂亲和层析的牛肺抑肽酶比活力达到4 3 0 8 u m g ，纯化倍数为3 5 0 ，略小于s e p h a r o s e4 6 为载体固定化酶吸附剂的4 5 9 3u m g ，纯化倍数为3 7 3 。它们的提取效率相当。与s e p h a r o s e4 b 相比，以交联壳聚糖微球作为亲和层析吸附剂时，洗脱速度快，微球机械强度高，几乎没有压床现象，且能反复使用。3 用亲和层析纯化猪肺粗提液，结果表明，在用( 0 5m o l l ，p h1 5 ) 氯化钠一盐酸溶液洗脱的收集液中，检测到有抑制活性，说明猪肺中也含有胰蛋白酶抑制剂。亲和层析猪肺抑肽酶的最佳条件：固定化酶吸附剂的活力为1 5 2 6 7 u g 、经8 0 目筛的交联壳聚糖微球载体、静态吸附。4 根据电泳图可知，提取的猪肺抑肽酶为单一纯品，相对分子量为1 1 1 k d a 。p h在l u l l 范围内，处理1 2 h ，活性不变，但在p h l 2 以后活性就开始下降，当p h l 3时，活性为p h 8 0 时的8 9 7 ，而且不同p h 对猪肺抑肽酶的影响是可逆的；猪肺抑肽酶经4 0 9 0 水浴处理1 5 m i n ，活性保持不变，在1 0 0 下水浴1 5 m i n ，相对活性是未经处理的9 6 ；猪肺抑肽酶具有一般蛋白所具有的2 8 0 h m 特征吸收峰，表明猪肺抑肽酶中含芳香族氨基酸残基；猪肺抑肽酶对于胰蛋白酶的抑制类广东工业大学1 = 学硕士学位论文型应该为“竞争型”抑制。胰蛋白酶的k 值为1 9 4 1 0 。，猪肺抑肽酶抑制常数k i 值远小于l ( - ，小了2 个数量级，猪肺抑肽酶是一种对胰蛋白酶有抑制活力很强的抑制剂，是一种较好的胰蛋白酶抑制剂。关键词交联壳聚糖微球；亲和层析；抑肽酶；猪肺；理化性质a b s t r a c ta p r o t i n i nw a sak i n do f n o n - s p e c i a l 、m u l t i f u n e t i o n a lp r o t e i n a s ei n h i b i t o r ，w i l d l ya p p l i e dt oc l i n i c t h em e t h o do fe x t r a c t i n ga p r o t i n i na tp r e s e n tw a s t w os t e p sm e t h o d , w h i c hw a sc o n t a m i n a t i v e 、h i g h - c o s t 、l o n g - p e r i o d t h e n ，t h ec r o s s l i n k e dc h i t o s a nm i c r o s p h e r ew a su s e dt oi m m o b i l i z et r y p s i nt op r e p a r a t i o nt h ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a ms o r b e m ，w h i c hw a sa p p l i e dt op u r i f ya p r o t i n i _ i l t h ep r e s e n tm a t e r i a lo fp r e p a r i n ga p r o t i n i nw a sc a t t l el u n g 、h u m a nu r i n e 、t r y p s i nc r y s t a ls o h t i o n b u ti t sn or e p o r tt h a te x t r a c t i n ga p r o t i n i nf r o mp i gl u n g s ow et r yt op r e p a r ea p r o t i n i nf r o mp i gl u n g t h er e s u r ss h o w ：1 t h es y m m e t r i cc r o s s l i n k e dc h i t o s a nm i c r o s p h e r ew a sp r e p a r e dt h r o u g hi n v e r s es u s p e r s i o nc r o s s l i n k i n g ，w h i c hw a su s e dt oi m m o b i l i z et r y p s i n t h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o no fi m m o b i l i z i n gt r y p s i n ：t h ec r o s s l i n k e dc h i t o s a nm i c r o s p h e r er e a c tw i t hg l u t a r a l d e h y d ew h o s ef i n a lc o n c e n t r a t i o ni s0 6 i n5 0 0f o rs i xh o u r s , a f t e rt h e na d d i n gt r y p s i n1 2 m g g ，r e a c t i n g2 4 ha t0 5 c t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ho fi m m o b i l i z e dt r y p s i ni s8 0 。ca n d7s e p a r a t e l y t h ea p p a r e n tm i e h c a l i sc o n s t a n to fi m m o b i l i z e dt r y p s i nk mi s3 1 6 m m o l l c o m p a r e dw i t ht h ec h i t o s a n , t h ec r o s s l i n k e dc h i t o s a nm i c r o s p h e r eh o l dt h ea d v a n t a g eo fg o o ds t r e n g t hs y m m e t r i c a l g r a n u l a r i t y 、s t r o n g - a c i d r e s i s t a n c e 、l e s sn o s p e c i a la b s o r p t i o no f b s a 2 t h en e wi m m o b i l i z e dt r y p s i nw a su s e dt op u r i f yc a t t l el u n ga p r o t i n i n , a n dt h ea c t i v i t yo f a p r o t i n i nr e a c h4 3 0 8 u m g 、t h ep u r i f i c a t i o nm u l t i p l er e a c h3 5 0 t h et r y p s i ni m m o b i l i z e db ys e p h a r o s e4 bi sa l s ou s e dt op u r i f yc a t t l el u n ga p r o t i n i n , a n dt h ea c t i v i t yo fa p r o t i n i nr e a c h4 5 9 3 u m g 、t h ep u r i f i c a t i o nm u l t i p l er e a c h3 7 3 t h en e wi n u n o b i l i z e dt r y p s i n se x t r a c t i o ne f f i c i e n c yi s t i t t l el o w e rt h a ns e p h a r o s e4 b b u tc o m p a r i n gt os e p h a r o s c4 b ，t h en e wi m m o b i l i z e dt r y p s i nh a v et h ea d v a n t a g eo f h i g hs p e e de h t i n g 、g o o ds t r e n g t ha n dc a nb eu s e df o rs e v e r a lt i m e s 3 t h er e s u l to fp u r i f y i n gp i gl u n gs o l u t i o nb ya l t m i t yc h r o m a t o g r a ms h o wt h a tt h ec o l l e c t i o ns o l u t i o ne l u t i n gb y0 5m o l l ，p h1 5 n a c i - - h c ih a si n h i b i t i o na c t i v i t y i ts h o w st h a tt h ep i gl u n gc o n t a i nt r y p s i ni n h i b i t o r t h eo p t i m a lc o n d i t i o no fp u r i f y i n g1 1 1广东工业大学工学硬士学位论文p i ga p r o t i n i nb ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a m ：t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dt r y p s i ni s1 5 2 6 7 u g ，s t a t i ca b c o p t i o n 4 1 1 壕p i ga p r o t i n i ni sak i n do f s i n g l ep u r i f i e dp r o t e i na c e n r d i n gt oe l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n t n 比a c t i v i t yi si n v a r i a b l ew h e ni tw a st r e a t e da tt h ep hf r o ml t o1 1f o r1 2 h b u tt h ea c t i v i t ys t a r tt od r o pw h e np 8r e a c h12 a n dt h ea c t i v i t yi s8 9 7 c o m p a r e dt ot h ea c t i v i t ya tt h ep h 8 0w h e np hr e a c h1 3 1 1 砖e f f e c t i o no f d i f f e r e n tp ho np i ga p r o t i n i ni sr e v e r s i b l e n 砖a c t i v i t yi si n v a r i a b l ew h e ni tw a st r e a t e da tt h et e m p e r a t u r ef r o m4 0t o9 0f o r1 5 r a i n w h e ni tw a st r e a t e da t1 0 0 ( 2f o r1 5 r n i n , t h er e l a t i v ea c t i v i t yw a s9 6 c o m p a r e dt oi tw a s 砒3 0 c t h ep i ga p r o t i n i nc o n t a i n sa r o m a t i ca n l i n oa e i dr e s i d u e sa n dh a ds p e c i a la b s o p t i o na t2 8 0 h m i n h i b i t i o nk i n e t i ct e s t so f t h ei n h i b i t o rs h o wt h a tp 培a p r o t i n i ni sc o m p e t i t i v ei n h i b i t o r t h ek mo f t r y p s i ni s l 9 4 x 1 0 - 3 磁i s m o r es m a l l e r t h a n k m ，s o t h e p i g a p r o t i n i n h a ds t r o n g i n h i b i t i o nt ot r y p s i n ，k c y w o r d s ：c r o s s l i n k e dc 衄o s a nm i c r o s p h e r e ；a t f m i t ye h r o m a t o g r a m ；a p r o t i n i n ；p i gl u n g ；p h y s i c a la n dc h e m i c a ln a t u r e缩写字母索g缩写字母索引b s a牛血清白蛋白t r i s三羟甲基氨基甲烷s o s十二烷基硫酸钠k米氏常数t i胰蛋白酶抑制剂k i抑制剂常数t b t i i 苦养胰蛋白酶抑制剂一it b t i - i i苦养胰蛋白酶抑制剂一s o t i菠菜种子胰蛋白酶抑制剂c p b 体外循环手术f d p纤维蛋白降解产物p a p 纤溶酶一抗纤溶酶复合物b a p n an a - 苯甲酰一d l 一精氨酸对硝基苯胺盐酸盐v独创性声明独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或其他用途使用过的成果。与我一同工作的人员与同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明，并表示了感谢。本学位论文成果是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下取得的，论文成果归广东工业大学所有。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。指导教师签字镩竹约论文作者签字：哟确_ 才知0 7 年月j 目第一章绪论第一章绪论近些年来，伴随着生物化学、医药学的蓬勃发展，在临床上愈来愈多地应用氨基酸、多肽、蛋白质、核酸、酶及辅酶、糖类、脂类等生物体内的生化基本物质，预防、诊断和治疗多种疾病，并取得良好的效果。生化药物多从生物材料中制备，它们的化学结构与组成比较复杂，相对分子量比较大；一般不易化学合成；有的生物材料不能用其他材料代替；药理作用针对性强，不良反应小；疗效确切和营养价值高；具有某些特殊疗效，是其他药物所不能代替的一类药物。抑肽酶( a p r o t i n i n ) ，也称为胰蛋白酶抑制剂( t r y p s i ni n h i b i t o r ，t i )是一种小分子蛋白质，最早是由k u n i t z 从牛胰腺中提取的胰蛋白酶抑制剂，也是从牛肺、胰、颌下腺等组织中提取的激肽释放酶抑制剂。它对蛋白酶具有广谱抑制作用，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶、凝血酶及各种组织或血浆激肽释放酶等，t i 通过抑制激肽释放酶以及纤溶酶而达到止血的目的，能显著减少手术中及手术后病人的出血，临床研究表明其副作用小、安全性好“1 。t i 的临床用量较大，已广泛用于治疗急性胰腺炎，烧伤后的休克及产后大出血等疾病，有独特疗效。1 1 抑肽酶的化学组成和性质乜1抑肽酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，存在于动物器脏、男性尿液及一些植物中，不同来源的抑肽酶其化学组成和结构各不相同，它们的抑制机制也有所区别。从牛肺或牛胰中提取的抑肽酶，其相对分子量为6 2 0 0 ，是由5 8 个氨基酸残基组成的碱性多肽。它的一级结构和二级结构均已阐明，分子内有3 对二硫键，整个分子呈梨型，活性中心为赖氨酸，位于分子的顶端。从相对分子量看有两类，一类是相对分子量较大的：一类是分子量较小的。一级结构是一条肽链组成，晶体空间结构内容丰富，扭转的双链反平行p 一折叠，从c 末端开始有三圈螺旋，分子内核由苯丙氨酸、丙氨酸、半光氨酸、酪氨酸等氨基酸残基的侧链组成疏水微区，分子表面是一些亲水基团。溶液构象测定变性过程，发现小分子有极高的稳定性。在碱性溶液中室温放置数天，它的苯酚基还不能全部解离成醌式，主链构象在尿素的溶液中，室温下可经数天而不全广东工业大学工学硕士学位论文部松散，这说明特定空间结构不仅能在溶液中依旧保持着，还能够经受相当剧烈的处理而不破坏。估计与二硫键含量高有关。在p h l 1 和1 0 5 时，其以单体占优势，在中性p h 时以二聚体占优势。对高温、酸、碱和酶都很稳定，在稀酸中加热至此1 0 0 ，在2 5 - - 氯乙酸中加热至少8 0 c 都未见活性损失。在室温，0 1 4 t o o l 1 氯化钠中可保存1 8 个月。p h l 2 6 ，室温放置2 4 h ，活性也仍然稳定，但在p i l l 2 8 时活力开始下降。在6 0 8 0 能被嗜热蛋白酶消化，其他酶不能使其失活。抑肽酶呈白色或类白色粉末，无臭，溶于水、7 0 甲醇、7 0 7 , 醇和5 0 丙酮，有可透析性，等电点为1 0 l o 5 。1 2 蛋白酶抑制剂的作用机制蛋白酶抑制剂与靶酶的结合作用方式可分为三类嘲：第一类包括绝大多数丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制剂中的活性中心环深入到靶酶的催化位点，以类似底物或产物的方式结合。不管那种结合方式，活性中心与催化位点的结合力都是相当强的。为防止两者脱离，抑制剂的活性中心基团与酶的活性基团要形成盐键、氢键而封闭活性中心。( 如图1 所示)图1 丝氨酸蛋白酶抑制荆与酶结合的空间模型c第二类包括琉基蛋白酶抑制剂，抑制剂分子与活性中心附近的区域相结合，2第漳绪论在空间上占据了本应属于底物分子的区域，阻碍了底物分子向活性中心靠近，从而阻止靶酶的活性中心与底物的接触。( 如图2 所示)图2 巯基蛋白酶抑制剂与酶结合模型第三类，抑制剂的分子不占据靶酶的识别位点，而是与酶分子并列相伴，并在与酶的活性基团形成氢健的同时封锁酶与底物的结合部位。凝血酶抑制剂( 水蛙素h i r u d i n ) 即属于这种形式。( 如图3 所示)图3 水蛭素与凝血酶结合的空间模型1 3 国内外研究状况3广东工业大学工学硕士学位论文1 3 1 从动物器脏中提取牛肺胰蛋白酶抑制剂( 也叫抑肽酶) 的相对分子量为6 2 0 0 ，是由5 8 个氨基酸残基组成的碱性多肽。它的一级结构和二级结构均已阐明，分子内有3 对二硫键，整个分子呈梨型，活性中心为赖氨酸，位于分子的顶端。从相对分子量看有两类，一类是相对分子量较大的；类是分子量较小的。宋杨等摘将化学改性与修饰壳聚糖体，共价偶联配基牛胰蛋白酶，制成固定化酶为抑肽酶亲和吸附剂，直接对黄牛肺提取液一步层析纯化，再超滤脱盐、浓缩、去热原，冻干即抑肽酶。抑肽酶比活57 0 0 k i u m g ，收率2 2 1 0 4 k i u k g ( 牛肺) ：固定化酶单位活力2 59 5 0 k i u g ( 干) ，酶活性回收率5 5 ，非特异性吸附较小，机械强度高，可反复使用。王增禄等。1 设计胰脏多酶联产实验对胰蛋白酶抑制剂进行了探讨。制各了t r y p s i n - s e p h a r o s e4 b 亲和层析柱，采用硫酸按、三氯醋酸沉淀、离心、色谱、冷冻干燥等技术，对猪胰脏中胰蛋白酶抑制剂进行分离纯化，用l k g 胰脏制得1 5 m g 胰蛋白酶抑制剂，酶比活为2 0 8 9 t 1 u m g 蛋白。k i s h i m u r a 等”在太平洋褶柔鱼( t o d a r o d e s p a c i f i c u s ) 的肝脏中分离得到一种相对分子质量为6 3 0 0 0 的t i ，并研究了其稳定性! 氨基酸组成以及抑制作用的特点等，发现该t i 对酸、热稳定，能有效抑制胰蛋白酶的作用，并可抑制肌原纤维自身的溶解。j u n g 等“1 在鲣鱼( k a t s u w o n u s p e l a m i s ) 的卵中提取分离获得一种相对分子质量为3 9 0 0 0 的t i ，其在体内以二聚体的形式存在，在p h 4 o 1 0 0 范围内有活性，当温度高于4 0 。c 时较大程度失活：在不同金属离子如k + 、n a 、m g ”、c 矿存在时其活性增强，而c u 2 + 的存在却导致失活。1 3 2 从人尿中提取人尿胰蛋白酶抑制剂( 删t i ) 是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，表观相对分子量为6 7 k d ，等电点为2 3 。它是一种糖蛋白，含糖量高达2 0 3 0 9 6 。人尿中的抑肽酶不同于由牛肺、胰提取的抑肽酶，它对人体不产生抗原抗体反应，更适于l 临床。目前提取u t i 的方法有综合使用三氯醋酸、硫酸铵、甲醇沉淀法。1 ，使用膨润土法咖，使用d e a e 一纤维素法“”，使用固定化胰蛋白酶的方法，直至最近使用的脱乙酞壳多糖以及硅酸镁的方法。4第+ 章绪论范俊虎等3 利用纯胰蛋白酶作为配体偶联于c n b r - s e p h a r o s e 4 b 为亲和载体，在不同条件下洗脱亲和蛋白，可从粗品溶液中快速分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的两种纯产物。根据洗脱条件，可将有抑制活性的2 0 k o 和4 0 k d 蛋白质分离为两个单独组份或混合物。其中2 0 k d 组份的抑制活性回收为3 5 ，抑制比活为3 3 8 7 u mg ：4 0 k d 组份的相应值分别为5 3 和3 1 1 6 u mg 。混合物的抑制活性回收和抑制比活分别为8 9 和3 0 7 6 u mg 。孙爱龙等“”用人尿胰蛋白酶抑制剂的粗品经过超滤，离子交换层析和亲和层析三步纯化，获得人尿胰蛋白酶抑制剂的中间品，其效价由原来的l o i u m g 纯化到2 2 4 0 i u m g ，比活为2 4 5 0 i u m g 蛋白质，活性回收率为5 8 。汪炬“”等通过z n c l ：胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的方法人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽释放酶将两者有效分离，得率高、活性保留好。1 3 3 从植物中提取2 0 世纪4 0 年代人们发现植物中含有蛋白酶抑制剂，在植物贮藏器官，特别在种子中，其含量常常高达总蛋白1 0 “”。食物中植物胰蛋白酶如果没被去或抑制，它在体内能与小肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶结合，生成无活性复合物，消耗和降解胰蛋白酶，导致肠道对蛋白质消化、吸收及利用能力下降。导致胰腺肿大和体内氨基酸代谢失调等疾病。但也有报导大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗、调节胰岛素失调有一定效果“”1 。陈星等“1 ”利用固定化胰蛋白酶分离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂可得到高纯度的大豆胰蛋白酶抑制剂。研究结果表明：大豆胰蛋白酶抑制剂通过各阶段纯化后其活性从0 9 5 t i u l l 增高至3 2 5 5 t i u m l ，纯化程度提高3 2 4 6 倍，得率0 0 3 3 ；电泳结果表明：利用固定化胰蛋白酶分离纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂有单谱带，纯化效果明显。忻骅等“”从已发表的t i 基因顺序设计了引物，通过p c r 技术从大豆总d n a中扩增了t i 4 基因的编码序列，从而最终获得了t i 蛋白一级结构的资料张政等啪1 采用凝胶层析及离子交换层析等方法，从苦荞种子中分离出一组胰蛋白酶抑制剂( t b t il 、i i ) 对其性质研究表明：两个组分均对胰蛋白酶有较强的抑制作用，对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱，其中t b t i - i i 的抑制作用大于t b t i i 。两者对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用用s d s - 聚丙烯酰广东工业大学工学硕士学位论文胺凝胶电泳和s e p h a d e x g 一1 0 0 凝胶层析分别对纯化产物进行分析得出t b t i i 和t b t i 一的近似分子量分别为1 5 o k d 和1 8 o k d t b t i i 、i i 都具有较高的热稳定性。在1 0 0 处理l o m i n 后可保留8 6 左右的抑制活性t b t i 在酸性环境下较为稳定，在p h 2 0 条件下保温l h ，仍保留7 5 的抑制活性用l i n e v e a e r b u r k 作图法得知，该抑制剂属竞争性抑制类型，t b t i i i 的k i 值为3 5 9 1 0 4 m o l l ( 以b a p n a为底物) ，对胰蛋白酶的摩尔抑制比为1 ：1 4 康庄等脚以菠菜种子为材料，经脱脂、酸性溶液抽提、热变性、硫酸铵分部沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经离子交换、亲和层析和凝胶过滤，分离得到胰蛋白酶抑制剂s o t i ，纯化倍数为5 7 2 2 ，s d s p a g e 测定其分子量约为2 2 k d ，等电聚焦测定其等电点为4 0 2 ，s o t i 具有较高的热稳定性，在1 0 0 c 处理后仍然具有一定的抑制活性。1 3 4 抑肽酶的基因工程方面研究随着分子生物学的发展，用基因工程的方法来制备胰蛋白酶以成为可能。近年来，利用基因工程的方法获得不同t i 的各种突变体，对其本身及其与不同丝氨酸蛋白酶结合形成的复合物晶体结构或溶液结构进行测定，从而对胰蛋白酶以及t i 中各个部位在两者相互作用的过程中发挥的作用进行判断。商捷等池3 为实现抑肽酶的大量制备，按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成抑肽酶结构基因。克隆于p l j c l 8 的e c o ri 和p s ti 位点，转入t o p l o 大肠杆菌( r e c a 3 中，经测序证明序列正确。表达体系模拟抑肽酶的体内成熟过程，将其自身的1 3 肽p r o 序列融合于抑肽酶的n 端，并在其间插入胰蛋白酶识别位点。该融合蛋白在使用p e t - 1 1 c 载体表达时，产物以包涵体形式存在于大肠杆菌中，表达量占菌体总蛋白的3 0 以上，证明该肽段不影响抑肽酶的正确折叠，还能帮助抑肽酶包涵体进行体外折叠，提高复性得率。复性后使用胰蛋白酶切割融合蛋白，可得天然构象的活性抑肤酶。秦新民等1 从3 个豇豆品种幼嫩叶片中分离出核基因组d n a ，参照已知的几种8 0 v m a n - b i r k 型胰蛋白酶抑制剂基因序列，设计合成了2 7 b p ，且含有b a m hi 位点的寡核苷酸引物，分别以3 种豇豆核基因组d n a 为模板，p e r 扩增，均得到长度约为3 4 0 b p 的d n a 片段。产物d n a 片段经d n a 序列分析，结果表明三者的碱基序列相同，与报道的胰蛋白酶抑制剂基因相比，同源性为1 0 0 和9 9 7 。6第一章绪论吕玲玲等幽1 通过根癌农杆菌a g r o b a c t e r i r mt i u n e f a c i e r c s 介导，将豇豆胰蛋白酶抑制剂( c p t i ) 基因导人花椰菜无菌苗的下胚轴和子叶中，卡那霉素( k a n )的筛选质量浓度为1 5m g l ，抑制农杆菌生长的抗生素选用梭节青霉素( c a r b e n c i l l i n ) ，质量浓度为5 0 0m g l 对所获得的转基因植株进行p c r 扩增，结果显示大多数为阳性：p c r s o u t h e r n 及s o u t h e r n 分子检测分析，结果证明c p t i基因已被整合到花椰菜植株的基因组中转基因植株叶片的离体饲虫初步试验结果表明，对鳞翅目害虫菜青虫的生长发育有一定的抑制作用。谢明等利用水稻偏爱密码子设计引物，经p c r 扩增，从我国水稻( o r y z a s a t i v a ) 品种“中花8 号”中克隆到一个长4 0 8 b p 的基因。序列测定和分析表明，克隆到的是一个未见报道的新的水稻蛋白酶抑制剂基因，该基因编码了一个由1 3 3 个氨基酸组成。具有重复双功能结构域和以抑制胰蛋白酶为主的活性中心的包曼一伯克( b o w m a n b i r k ) 型蛋白酶抑制剂，该基因推导的氨基酸序列与大麦、小麦、豆类等的某些蛋白酶抑制剂的氨基酸序列具有较高的同源性，与该家族的水稻的一种胰蛋白酶抑制剂氨基酸全序列同源性高达7 5 。任启生等汹1 通过化学合成和p c r 结合法合成了e t i 基因，经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒p e t 3 2 a 中，并在大肠杆菌中进行诱导表达。表达蛋白分子量同理论值一致，生物活性检测表明复性后的e t i 对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用。凌敏华等田1 用p c r 方法扩增一特异探针，结合传统的筛库方法，从天花粉e d n a 基因库中筛选到含t t i 基因的克隆，经序列测定，得到了t t i 的c d n a 全序列。其读框编码区编码的是一个由6 5 个氨基酸组成的p r e p r o t t i ，p r e 与p r o分别含有2 4 个和1 4 个氨基酸。由c d n a 序列推论的氨基酸序列和已测定的氨基酸序列完全相同。应用基因工程技术可以对胰蛋白酶的结构和功能关系进行研究，这可能成为基于蛋白质空间结构合理设计药物的基础。有助于开展结构生物学的方法学研究。1 4抑肽酶的制备方法抑肽酶可从牛肺、胰等脏器中分离提取，或从牛胰提取胰蛋白酶的结晶母液、提取胰岛素的胰渣中制得。71 4 1 以牛肺为原料的提取方法技术路线：新鲜牛肺盔l 雩誊蠢卜提取液，菩霎盐析物丞l 三氢圣酸j 圭盘勤滤液撕物些霉警水( 透析)l o 以下，2 4 h硫酸铵盐析透析液垒垒鱼邈堕l 塑旦受塑 旦l 退堕垫l 脱盐液型竺! ：堕墅! 望塑沉淀物藿塑查：塑! 查垫塑)p h 7p h ll 。放置4 d冰醋酸，n a c l 。丙酮( 沉淀，干燥)p h 4 5成品无热源溶液工艺过程：1 提取，盐析将新鲜牛肺或冰冻牛肺绞碎后，用5 倍量水搅匀，2 5 m o l l 硫酸调节p h 至2 ，搅拌提取8 h ，过滤，滤渣同法再提取1 次，合并两次提取液，加硫酸铵2 7 7 9 l ，以5 m o l l 硫酸调节p h 至1 5 ，放置过夜次日吸出上清液，盐析物过滤，滤液以氢氧化钠液调p h 5 5 ，再加硫酸铵2 5 5 9 l ，搅匀后静置4 8 h ，过滤的盐析物2 去杂蛋白，盐析，溶解，盐析用9 倍水溶解盐析物，搅拌2 h 后，置冰箱过夜，过滤，滤液加入1 2 0 量的5 0 - - - 氯乙酸，迅速加热至8 0 后，即冷却至3 0 ( 2 以下，过滤滤液用5 m o l l 氢氧化钠调p h 至3 ，按6 1 0 9 l 加入硫酸铵搅拌使其溶解，静置过夜取沉淀物，用4 倍新鲜配制的p h 5 5 的0 1 m o l l 乙酸钠缓冲溶液和l 倍量的0 4 m o l l 硼酸缓冲溶液溶解，按1 0 5 0 9 l 加入硫酸镁，溶解后静置过夜，次日过滤，得盐析物3 透析，脱盐，沉淀将盐析物用4 倍量水搅拌溶解，在1 0 c 以下流动自来水透析2 4 h ，加硅藻土过滤，滤液用强碱性季铵i 型阴离子交换树脂2 0 1 ) 7 与强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂0 0 1 ) 7 ( 按2 0 1 x 7 树 1 旨：0 0 1 x 7 树脂- - 3 ：1 的比例) 搅拌吸附2 0 r a i n ，至无s o , 滤过树脂，脱盐液( p h 7 左右) 加9 9 l ( 0 9 ，6 ) 氯化钠和1 5 倍量丙酮析出沉淀，过滤，滤液再加4 倍量丙酮析出沉淀，过夜，次f 1 ，沉淀用丙酮，乙醚第一章绪论洗涤，干燥再溶于6 0 倍量8 0 甲醇溶液中，置水浴搅拌2 h ，过滤，按滤液体积的1 加3 0 0 9 l ( 3 0 0 5 ) 的氯化钠溶液，再加入5 倍量丙酮，沉淀过夜，离心，用丙酮洗涤，干燥，得沉淀物4 去热源，沉淀，干燥取沉淀物用6 0 倍量无热源水溶解，5 m o l l 氢氧化钠调节p h 至1 1 ，放置冰箱4 d ，过滤，滤液用冰醋酸调节p h 至4 5 后，加入1 量的3 0 0 9 1 氯化钠溶液和5 倍量丙酮，析出沉淀，过夜，沉淀物用丙酮、乙醚洗涤，干燥，即得成品1 4 2 以人尿为原料的提取法入尿中的抑肽酶不同于由牛肺、胰提取的抑肽酶，它对人体不产生抗原抗体反应，更适于临床。技术路线：男性人尿翟舞篓卜上清液气酸化尿液兰吸附物一2 m o l i n h 4 h c 0 3 洗脱液! 兰等善姜著等透析液型燮i 成品工艺过程：1 原料处理取新鲜男性尿1 0 0 l ( 操作全过程在o 4 下进行) ，经双层纱布过滤，用l m o l l n a 0 h 液调节p h 至8 5 ，生成白色絮状沉淀物，静置2 h ，弃去沉淀，得上清液。2 酸化取上清液，在搅拌下缓缓滴加l m o l l h c l 调p h 至4 0 ，生成细微沉淀，离心2 0 m i n ，除去沉淀得酸化尿液。3 吸附、洗脱取p o l y e r d e n 5 0 0 9 ，加入上述酸化尿液中，搅拌吸附2 h ，过滤，弃去滤液，吸附剂用常水洗涤至白色，再用2 m o l l n h 。h c 仉溶液4 l 进行洗脱，收集洗脱液。4 盐析、透析将固体( n h 4 ) ：s 0 4 加入洗脱液中，达8 0 饱和度，于4 下静置4 5 h ，离心3 0 r a i n ，收集沉淀，再将沉淀溶于适量的蒸馏水中，对磷酸盐缓冲液透析至盐除尽，得透析液。5 浓缩、冻干取透析液，浓缩，冷冻干燥，即得成品。9广东工业大学_ i = 学硕士学位论文1 4 3 从胰蛋白酶结晶母液中提取取母液滴加2 5 m o l l 硫酸调p h 至3 置于冰箱过夜，滤过，清液保持2 5 加入固体硫酸镁盐折。收集盐析物，溶于蒸馏水中加入适量硅藻土过滤，滤液加等量的5 三氯乙酸，即有白色沉淀生产，搅拌下加热至8 0 ，过滤得清液。清液用5 m o l l 氢氧化钠调p h 至8 ，保温2 5 c ，加硫酸镁至饱和，收集盐析物，再溶于蒸馏水中，滤去不溶物，滤液用硼酸缓冲液调p h 至8 ，加固体硫酸铵至4 0 饱和度，冰箱放置1 2 h ，滤去沉淀物，再补加硫酸铵达7 0 饱和度，过夜，收集盐析物。再将盐析物溶于4 倍量的p h 5 5 ，0 7 m o l l 乙酸钠缓冲溶液中，滤去不溶物，滤液用硼酸缓冲液调p h 5 5 ，然后加入盐析物质5 倍的p h 5 5 ，0 i m o l l乙酸钠缓冲液，保温2 5 。加入硫酸镁至饱和，过夜，过滤收取盐析物。再溶于1 0 倍量蒸馏水中，装入透析袋，透析至无硫酸根为止，滤去沉淀。透析液用5 m o l l 氢氧化钠调p h 至i ，冰箱放置4 8 h 后，用i m o l l 盐酸调p h 5 5 ，按无菌操作用餐号垂熔漏斗过滤，滤液冻干，即得成品。1 5 抑肽酶的应用抑肽酶( a p r o t i n i n ) 是一类丝氨酸蛋白酶抑制剂，其主要作用是：( 1 ) 抑制循环中纤溶酶，能显著减少术后出血：( 2 ) 阻止血小板激活，保护糖蛋白i i b i i l a 受体及止血功能：( 3 ) 抑制中性白细胞激活和脱颗粒，具有抗炎作用，能减轻全身炎症反应综合征( s i r s ) ：( 4 ) 抑制激肽释放酶的激肽形成和血管活性效应，防止缺血再灌注损伤：( 5 ) 减少补体激活，抑制c 。f l 和c ；a 产生。这些药理学的作用使它不仅广泛用于体外循环( c p b ) 心脏手术，而且在非心脏手术中也得到广泛应用。1 5 1 在体外循环心脏手术中的应用术中及术后出血是体外循环手术中一个重要并发症，长时间体外循环是导致心脏直视手术后渗血过多或出血的主要原因。抑肽酶是一种丝氨酸蛋白抑制剂，它能有效地抑制体外循环所致机体产生的“炎性反应”，抑制多种蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、血管舒缓素，激肽及补体系统汹”1 。同时，它能保护血小板免受激活损耗和血小板的粘附及聚集功能。抑肽酶也是一种强有力的纤溶抑制剂，可防止纤溶激活，与保护血小板的作用相辅相成，在维护体外循环期间正常的凝血机制起到重要的作用。抑肽酶在心脏手术中的作用有”：( 1 ) 减少出血量和输血1 0第一章绪论量心脏外科手术中，体外循环转流能破坏血小板及凝血功能。抑肽酶作为一种蛋白酶抑制剂，有良好的抑制纤溶系统及保护血小板功能，可减少术后出血及库血用量，减少出血和输血所引发的一系列并发症。黄瑞健等。”报道，在心脏直视手术时均于麻醉诱导后一次性静注5 1 0 5 k i u k g 抑肽酶，结果术后出血量和输血量均少于对照组( p o 0 5 ) 。在小儿心脏手术中如何使用抑肽酶，f i t a 等3 研究提示在麻醉诱导和c p b 先给予抑肽酶2 4 0m g 砰然后持续输注5 6 m g m - 2 h ，直至手术结束。结果发现大剂量抑肽酶能有效控制出血，减少输血量，使血浆中纤维蛋白降解产物( f d p ) 和纤溶酶一抗纤溶酶复合物( p a p ) 下降，使血小板聚集功能改善。h o h n 等研究认为。”，如果术中采用大剂量抑肽酶和血液回收，心脏手术就无需再进行急性等容血液稀释( a n h ) ，因为实验表明a n h 并不能降低择期心脏手术同种输血的危险。l a n d i s 等啪1 报道于c p b 中抑肽酶一次性按5 万7 万k i u k g加入预充液中能明显保护血小板功能，减少术后出血量。抑肽酶按小剂量给药的研究结果显示，小剂量应用抑肽酶，从然其血药浓度相对较低，一般在1 0 0 k i u m l 2 0 0 k i u i i l l 之间，但也具有抗纤溶作用，可明显减少围术期失血量，在保护血小板功能方面( g p i i b i i i a 和血小板激活物6 m p - 1 4 0 等含量) 与大剂量法相比较无明显差异。上述观点可能也是临床应用小剂量抑肽酶的理论依据。s a n t a m a r i a 等1 报道，c p b 中用抑肽酶2 0 0 万k i u 有效，该剂量可能是此药的最小有效剂量。( 2 ) 对肺损伤的保护束余生等对2 4 例心脏直视手术患者随机分为两组各1 2 例，试验组给予抑肽酶处理。结果，试验组与对照组比较，术后左、右心房血液中，血小板及粒细胞计数有显著差异( p o 0 5 ) ：内皮素、血栓素、呼吸指数，在术后试验组较对照组显著降低( p o 0 5 ) 。结论认为，心脏直视手术致肺损伤，与血小板及中性粒细胞在肺内聚集，内皮素、血栓素等在其病理过程中起关键作用。抑肽酶能通过干预这些因素，而达到保护肺功能的目的。( 3 ) 对心肌的保护效果夏杰华等“o 对6 0 例心脏瓣膜置换手术的病人，于麻醉诱导后，心肺转流前静滴抑肽酶l 1 0 6 k i u ，体外循环预液中加入2 1 0 6 k i u ，另1x1 0 6 k i u 在转机后静滴至术毕。结果，自动复跳率、复跳后低血压发生率及术后2 4h 低血压发生率，均优于对照组。结论认为，体外循环心脏直视手术中，使用大剂量抑肽酶能加强心肌的保护效果。广东工业大学工学硕士学位论文( 4 ) 减少体外循环心脏直视手术所致的机体炎性反应张光等1 对2 8 例主动脉瓣狭窄i i 度行首次心脏瓣膜置换手术的病人随机分为抑肽酶组和对照组，在术前、手术开始后1 0m i n 、术后6 0m i n 各采外周静脉血，测定白细胞总数及分类计数。结果显示，两组病人在术后白细胞总数及中性粒细胞数明显增加，但抑肽酶组的测定值明显低于对照组( p 0 0 5 ) ，可以认为，抑肽酶可减轻手术所致的机体炎性反应。c p b 相关的炎性反应涉及白细胞激活和白细胞一内皮细胞的相互作用。l 一选择素是白细胞表面表达的粘附因子，它参与白细胞一内皮细胞粘附级联的启动。当白细胞激活时，l - 选择素便从白细胞表面经蛋白水解脱落，是白细胞激活的标志物。a s i m a k o p o u l o 等“”将自愿者静脉血与抑肽酶进行孵化，抑肽酶的浓度分别是2 0 0 、8 0 0 、1 6 0 0 k i u m l ，并用化学趋化剂( f m l p ) 或血小板活化因子( p a f ) 刺激。用单克隆抗体标记，y 用流式细胞仪测定l - 选择素在中性粒细胞表面的表达，结果显示抑肽酶能抑制l 一选择素的表达，而且与剂量有关。a s i m a k o p o u l o s 等“”又在体外研究发现，抑肽酶能抑制t n fa 刺激引发的细胞间粘附因子一i ( i c a m 1 ) 和血管细胞粘附因子一l ( v c a m ) 表达，阻止白细胞通过血管内皮转移，因此，认为内皮细胞是抑肽酶作用的特殊靶器官，这可能是c p b 中抑肽酶发挥抗炎作用的重要机制。t a s s a n i 等“”发现使用大剂量抑肽酶和不用抑肽酶在c p b 4 小时后其血中il - 6 的浓度均达到最高峰，但抑肽酶组明显低于对照组，其结论是大剂量抑肽酶可明显降低c p b 相关的炎性反应。1 5 2 髋关节手术中的应用髋关节病变常见于股骨头坏死或股骨颈严重骨折，需作病灶清除术或全髋关节置换术，手术切口较大，组织损伤较重，术中渗血多，止血困难，刘洁容“”将1 2 0 例髋关节手术病人，随机分为两组，6 0 例为实验组，手术切皮前1 5 分钟开始滴入抑肽酶，用5 葡萄糖2 5 0m l 加抑肽酶5 0 万k i u ，术前滴入3 0 万k i u ，术中持续滴注0 5 万k i u ( k g h ) 结果发现实验组比对照组减少出血量5 5 ，并使2 3 的病人避免了输血，由于术中出血少