（食品科学专业论文）乳酸菌发酵乳抑制血管紧张素转化酶活性的研究.pdf

摘要 摘要 肾素血管紧张素系统和激肽一激肽释放酶系统是两个重要的血压调控系统，血管 紧张素转化酶( a c e ) 在其中起着重要调节作用。a c e 抑制剂可有效地抑制a c e 的 活性，从而保持生物体的血压稳定。目前用于治疗高血压的一线药物都是合成抑制剂， 都有一定副作用。食源a c e 抑制肽降压效果虽然不及人工合成的a c e 抑制肽，但安 全性高，对血压正常者无降压作用，成为目前的研究热点。利用乳酸菌在生长过程中 对蛋白质的代谢，使得乳酸菌发酵乳具备a c e 抑制活性，可达到安全降血压的目的。 论文比较了6 个属内1 8 种共计6 1 株常见发酵乳酸菌发酵脱脂乳后a c e 抑制率 的大小，结果表明不同乳酸菌个体间的a c e 抑制活力差异很大，乳杆菌属的a c e 抑 制活力最强，其次是双歧杆菌属，链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属和片球菌属的 a c e 抑制活力很低。乳酸菌a c e 抑制活力与其产酸能力正相关性较弱( s p e a r m a n 等级相关系数r s = 0 4 2 2 ，p 0 0 5 ) ，与其蛋白水解活力正相关性显著( s p e a r m a n 等级相 关系数r s = 0 8 2 7 ，p 0 0 1 ) 。通过对两株产a c e 抑制活力高的l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s 6 0 2 4 和三h e l v e t i c u st 1 6 的研究发现，a c e 抑制活力高的乳酸菌的共同特点是在乳中 生长良好，而且产酸能力和蛋白水解能力都很强。 论文对a c e 抑制活力最高的l h e l v e t i c u s6 0 2 4 的生长发酵特性，以及这些特性对 a c e 抑制活力的影响进行了研究。结果表明l h e l v e t i c u s6 0 2 4 的最适增殖培养基为： 以牛奶蛋白胨作为m r s 培养基中的氮源，同时添加0 5 的半胱氨酸盐酸盐，其最 适生长温度在3 9 ，最适初始生长p h 为6 5 - - 7 0 ；在最适生长条件下，3 h 进入对 数生长期，1 4 h 进入稳定期，达到稳定期后活菌数可达到9 5 1 0 8 c f u m l 。l h e l v e t i c u s 6 0 2 4 发酵脱脂乳的速度和发酵后熟期后酸化作用对a c e 抑制活力影响不大。但是复 原乳的乳粉含量对a c e 抑制活力有影响，在4 8 范围内a c e 抑制率较高，3 7 下发酵1 2 h 可达到7 4 6 。通过截留分子量5 0 0 0d a 的超滤除去大分子蛋白后，通过 s e p h a d e xg 1 5 凝胶色谱分离到一个活性高的组分峰，该组分峰的i c 5 0 = 4 5 2 1 2g m l ， 并能很好地抵抗胃肠道内蛋白酶的消化。 最后对l h e l v e t i c u s6 0 2 4 进行了应用研究。为合理地评价发酵乳产品的质量，对 8 种市售搅拌型酸乳样品进行感官评定，采用混合赋权法计算出酸乳三个感官指标色 泽、风味和质构的权重分别是0 2 5 4 、0 4 0 2 和0 3 4 4 。再结合l h e l v e t i c u s6 0 2 4 和直投 式发酵剂混合发酵乳的三项客观指标脱水收缩敏感性、持水力和表观粘度的测定值， 初步建立一个较为合理的可量化评定发酸乳质量的评价体系。利用这一评价体系，通 过证交实验优化出了具有a c e 抑制活性发酵乳的最佳制备条件为：接种量4 ，菌种 配比( 直投式发酵剂：6 0 2 4 ，v v ) 1 ：2 ，加糖量9 ，变性淀粉添加量为4 ，该发酵 乳a c e 抑制率可以达到4 8 2 。 关键词：乳酸菌，a c e 抑制活力，发酵乳，瑞士乳杆菌 a b s t r a c t a b s t r a c t a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ，e c3 4 15 1 ) p l a y s ad u a lr o l ei nt h e r e g u l a t i o n o fh y p e r t e n s i o ni nt h es y s t e mo fr e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m ( r a s ) a n d k i n i n k a l l i k r e i ns y s t e m ( k k s ) i tc a nc a t a l y z et h ep r o d u c t i o no ft h ev a s o c o n s t r i c t o r a n g i o t e n s i ni i a n di n a c t i v a t et h ev a s o d i l a t o rb r a d y k i n i n b yi n h i b i t i n gt h e s ep r o c e s s e s ， a c ei n h i b i t o r sh a v ea n t i h y p e r t e n s i v ee f f e c t s p e p t i d e sd e r i v e df r o mm i l kp r o t e i n sc a n h a v ea c e i n h i b i t i n gp r o p e r t i e sa n dm a yt h u sb eu s e da sa n t i h y p e r t e n s i v ec o m p o n e n t s b y t h e i rp r o t e o l y t i ca c t i v i t yi ng r o w i n gi nm i l k ，l a c t i ca c i db a c t e r i ac a nr e l e a s et h ea c e i n h i b i t o r yp e p t i d e st or e a c ht h ea n t i h y p e r t e n s i v eg o a l i n i t i a l l y , t h ea n g i o t e n s i n i - c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r ya c t i v i t yo ff e r m e n t e d m i l kb y61s t r a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i aw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c e i n h i b i t o r ya c t i v i t i e sw e r eo b v i o u s l yd i f f e r e n ta m o n g t h e61l a b s ，a n db a c t o b a c i l l u s a c e i n h i b i t o r ya c t i v i t i e sw e r em u c hh i g h e rt h a nt h eb i f i d o b a c t e r i u m s a n dc o c c u s t h e a c i d p r o d u c t i v i t yo f l a bh a dn oc o r r e l a t i o nw i t ha c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y ( s p e a r m a n s r a n kc o e l a t i o nr s = o 4 2 2 ，p 9 0m m h g 。高血压按病因分类可分为原发性高血压和继发性高血压两大 类。所谓原发性高血压，是一类病因尚不完全清楚的、以体循环动脉血压升高为主要 临床表现的一种独立性疾病，这种高血压占总高血压患者的9 5 以上，是危害人体健 康的疾病之一。继发性高血压又可称为症状性高血压，这种高血压发病的病因比较明 确，是由一些已知的原因引起的。这种高血压在临床上比较少见，约占总高血压患者 的5 左右。 虽然对高血压的发病机理的研究已愈百年，但是由于其病因十分复杂，对高血压 的发病机制至今仍未有确切的认识。目前认为遗传因素、膳食调配不当、神经调节紊 乱、内分泌失调、外界环境影响及某些脏器的病变等都与高血压的发生、发展密切相 关。高血压的发病机理学说众多，其中较有代表性的有：精神神经源学说、内分泌学 说、肾源学说、遗传学说、过多摄钠学说、胰岛素学说等，已知许多系统与血压的维 持有密切的关系，其中重要的有中枢神经系统、肾上腺系统、肾素一血管紧张素系统、 血管舒缓激肽激肽前列腺系统等，这些系统受内外环境的影响而变化，从而参与机 体血压的调控，多种致病因素都有可能影响以上各系统而使血压升高。 1 1 2 血管紧张素转化酶 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ，e c3 4 1 5 1 ) 是含有z n 2 + 辅基的羧二肽酶，是一种膜结合酶，由单一6 k 链组成，分子量为1 2 9 1 0 5 1 3 6 1 0 5 ， 翌堕奎兰婴：生堂竺丝苎 沉降系数7 9 s ，等电点为4 7 5 ，含大量的低聚糖，能被氯离子激活并具有较宽的底物 特异性【3 7 】。a c e 最适p h 值随底物的不同而变化并受氯离子的影响，在氯离子存在 下，对于长肽底物如血管紧张素i ( a n g i o t e n s i ni ) 或缓激肽( b r a d y k i n i n ) ，a c e 最适 p h 为7 5 ；对于三肽底物如z p h e h i s - l e u 、h i p - h i s - l e u 或h i p g l y - g l y 的最适p h 为 8。 1 1 3 血管紧张素转化酶对血压的调节作用 肾素血管紧张素系统( r e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m ，r a s ) 和激肽激肽释放酶系 统( k i n i n k a l l i k r e i ns y s t e m ，k k s ) 是生物体调控血压的两个十分重要的系统，a c e 在其中起着重要作用( 图1 1 ) 。在r a s 中，a c e 酶起限速酶的作用，它可把无活性形 式的血管紧张素i ( a n gi ，十肽) 水解成有活性的血管紧张素i i ( a n gi i ，八肽) ，同 时钝化具有舒张血管作用的九肽舒缓激肽( b r a d y k i n i n ，b k ) ，从而使机体血压升高 【8 j 。a n gi i 具有很强的升高血压的作用，能直接兴奋血管平滑肌( 特别是皮肤、肾脏 和其它内脏的血管) ，使之产生强力收缩，提高外周阻力，从而使机体的血压升高。 另一方面，a n gi i 还可在不同的水平上兴奋交感神经，并抑制迷走神经，增强交感神 经末梢释放去钾肾上腺素，并促进其再摄取，使血管平滑肌进一步收缩，导致机体血 压的升高。而k k s 是人体内的一个降血压系统，激肽是_ 族具有促进血管舒张与降 血压作用的活性肽，是激肽释放酶作用于底物血清或淋巴液中的非活性前体物质 激肽原得到的。在血液中，激肽释放酶水解所得的产物是b k ，具有舒张血管及降血 压作用。当b k 被a c e 酶作用后，a c e 酶会从b k 的c 末端切下一个二肽( p h e a r g ) 下来，变成一个没有活性的七肽，从而失去降血压作用1 8 】。 r a s 和k k s 系统在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正 常血压十分重要。r a s 产生具有升压作用的a n gi i ，k k s 产生具有降血压作用的舒 缓激肽。r a s 与k k s 的平衡失调被认为是高血压发病的重要原因之一。由于a c e 在r a s 和k k s 系统中对血压调节起重要作用，抑制a c e 活性对降血压有积极的影 响，所以在研发治疗高血压的药物的过程中，a c e 抑制剂成为重要抗高血压药物筛 选的靶标。 1 2 高血压病的治疗 高血压的治疗经过半个多世纪的发展，经历了许多变革。从治疗方法上，经历了 从p e e r 和s m i t h w i c k 等应用手术切除交感神经的手术治疗以及k e m p n e r 等应用稻米 和果汁进行治疗的饮食疗法，到s m i r k 用甲溴胺药物治疗的发展历程；从治疗策略上 看，也经历了单一药物治疗到联合用药，从阶梯治疗法到高度个体化的历程。可以说 高血压的治疗在方法上、治疗药物上以及观念上都取得了巨大的突破。8 0 年代以前 的降血压药物有镇静药、生物碱利血平、可定乐等，他们的降压时间短且不稳定或是 有不良反应目前已很少使用。根据已知的高血压的发病原因化学合成抗高血压药物。 目前，w h o i s h 推荐的一线抗高血压药物为利尿剂、p 受体阻断剂、血管紧张素转 2 兰二垩笙堕 换酶抑制剂( a c e i ) 、钙通道阻滞剂( c a a ) 、a 受体阻断剂、血管紧张素( a n g ) 受 体拮抗剂等六大类。不同的药有不同的特点，也有一定的副作用【9 10 1 。特别是a c e 抑制剂( a c e i ) 是当今降血压药物发展最快的一种。a c e i 对各期高血压患者都有效， 不影响交感神经对血管平滑肌的调节作用，也不引起心率加快，合成a c e i 主要不良 反应为易引起急性肾功能损害，贫血及粒细胞减少症，血管神经性水肿，肝脏毒性， 头痛、恶心、疲乏皮疹、蛋白尿、白细胞减少等【 13 l 。 因此，寻找天然的、安全的降血压药物引起了研究者们的极大兴趣。最新的研究 表明，在我们的日常膳食中，有多种生物活性因子对高血压有预防或治疗作用。由于 这些生物活性因子可以通过日常摄取的食物中获得，安全性高，渐渐成为高血压药物 替代品的首选。食品中生物活性因子的研究已经成为广大科研工作者研究的新热点。 肾素血管紧张素系统( r a s 系统)激肽释放酶激肽系统( k k s 系统) 血管紧张素酶( 肾素) 一激肽释放酶 ：血管紧张素i舒缓激肽一前列腺煮释放 ( 无活性)( 活性) 占 l l i ) 陬司( 黜晶 血管紧张素i i l j 失活片段 l 薪弋 呒活 占( j口 蚴叮醐芦悃 9 翟品、l li 抑制a c e 血管阻力 器鼍蒙笋【j占 血管阻力水的重吸收 l il l jv 匹亘司匝巫妇匝巫回 图1 1 血管紧张素转化酶对血压的调节作用 f i g 1 - 1t h er e g u l a t i o na c t i o no fa n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m eo nt h eb l o o dp r e s s u r e 1 3a c e 抑制肽 食物蛋白除了可以为机体提供氨基酸和能量的营养功能外，还是生物活性肽的重 要来源。一般来说，这些肽在母体蛋白序列中并不具有生物活性，经过体内( 胃肠道 3 。坚堕奎兰堡主兰垡丝奎 消化) 或体外( 食品加工过程) 的酶解可使其活性肽段释放出来，在生物体内起到了 重要的生理功能。在生物活性肽研究过程中，由于a c e 抑制肽( 具有降血压功能的 也称降血压肽) 对原发性高血压大白鼠( s h r ) 和高血压患者具有降血压作用但对j 下 常血压者无影响，所以a c e 抑制肽格外受到研究者们的关注，成为生物活性肽领域 的研究热点。 1 3 1a c e 抑制肽的结构与其活性关系 1 9 6 5 年f e r r e i r a 从巴西蝮蛇( b a t h r o p si a r a r a c a ) 蛇毒罩分离出多肽物质，能增强 舒缓激肽的舒张血管作用，称为“缓激肽增强肽( b r a d y k i n i n p o t e n t i a t i n gp e p t i d e ) ”【2 】， 后来发现此类肽也能抑制a c e 而具有降血压活性【l4 1 。1 9 7 1 年o n d e t t i 等人工合成了 壬肽抗压素，是第一个应用于临床的a c e 抑制剂5 1 。人们最初从蛇毒发现的a c e 抑制肽长度一般为5 1 3 个氨基酸，大多数c 端为a l a p r o 和p r o p r o ，其中 p y r - t r p p r o a r g - p r o g i n i l e p r o p r o 对高血压动物的降血压效应最强，并曾经用于体 外注射治疗高血压【l 刚，自从该肽及其降压作用发现以来，人们就以该肽作为模型药物 不断进行新的降压药物的设计，研究和生产出许多临床使用非常有效的a c e 抑制剂， 如现仍广泛使用的卡托普利。后来o n d e t t i 等人又根据a c e 底物的化学结构推测设计 出a c e 活性部位模型，并根据此模型合成了一系列口服有效的化学结构简单的小分 子a c e 抑制剂i l7 1 。 c u s h m a n 实验室根据竞争性抑制剂与a c e 活性的结合位点提出了模型假说【l 引， 该模型后来一直被许多研究者用来解释降压肽的作用机理。图1 2 所示就是该假设模 型。 硝瀚 摊_ 刖 l ：二二：竺= 个善。孝l l j 印誓n卤，一、聿 l m 卜c 焉捧皋卜墨。帏强稚钧 。岛蔓k i h 蓦墨抑翻棚 k 熹卜建，哪莹。莹。 图1 - 2 降压肽的作用机理假设模型 f 培l - 2t h eh y p o t h e s i sm o d e lo fa n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e se f f e c tm e c h a n i s m 模型中的六角缺i s i 是羧肽酶的活性点，表示酶的疏水袋。a c e 的环形缺口表示底 物和竞争性抑制剂的取代基r 1 和r 2 与a c e 作用的活性点，x h 表示a c e 活性点 的氢键。 第一覃绪论 该模型认为a c e 与羧肽酶a 的结构相似。a c e 活性点有一个正电荷( 类似于羧 肽酶a 的a r g 1 4 5 ) 可能与底物肽的c 端羧基结合。与正电荷相距一个二肽残基的距 离处有一个z n 2 + ( 与羧肽酶中相距一个氨基酸残基的距离相对) ，可能对肽键的断裂有 作用。a c e 对c 端的疏水性氨基酸没有专一性，因此在活性点不像羧肽酶有一个疏 水袋。但是它有2 个环形缺口，可能对肽底物的两端氨基酸残基( r 1 和l 也) 有亲和力。 另外，a c e 还可能以氢键与底物术端不断裂的肽键结合。 肽的疏水性也是影响其活性的重要因素。高亲水性无法使肽难接近a c e 活性部 位而导致弱或无活性【5 】。a c e 抑制肽的活性强度也受c 端p r o 残基临近氨基酸的影响， 对于高活性的肽，临近氨基酸应该是疏水性氨基酸。然而，这些肽的结构与活性关系 研究都是基于氨摹酸序列分析进行的，许多肽并不符合这些研究结果，确切的构效关 系模型至今仍未建立。 1 3 2a c e 抑制肽的制备方法 a c e 抑制肽的制备方法主要有四种【2 ，1 4 j ：( 1 ) 化学合成法，采用液相或固相化学 合成法制取任意需要的活性肽，但成本高、副反应物及残留化合物多等不利因素。( 2 ) 酶法生产，酶法降解蛋白质制备a c e 抑制肽是目前最主要的生产方式，包括直接酶解 和利用微生物发酵间接酶解两类。这种成本低，产品安全性高，无副作用。蛋白酶法 虽然水解效率高，但原料蛋白利用率有限，造成了一定程度的浪费，并且产物很难被 纯化出来。( 3 ) 直接提取天然a c e 抑制肽，不需体外水解而直接提取a c e 抑制肽。( 4 ) d n a 重组技术制取a c e 抑制肽，重组d n a 技术合成法多用来生产长肽和蛋白质，对 于a c e 抑制肽大部分是短肽，所以限制了此法的应用。 1 3 2 1 合成a c e 抑制剂 现有的合成a c e i 的化学结构有三类l l 圳，( 1 ) 含有与锌离子结合的毓基，如卡托 普利、阿拉普利、左芬普利等；( 2 ) 含有与z n 2 + 结合的羧基，如赖诺普利；( 3 ) 含有 与z n 2 + 结合的次磷酸基，如福辛普利。它们的共同机理都是与a c e 的活性部位z n 2 + 结合，使a c e 失活。许多a c e 抑制剂为前体药，如依那普利等含有c o o c 2 h 5 ，必 须在体内转化为羧基c o o h ，成为依那普利才能起到作用。大量研究发现，a c e 抑制 剂的基本药理作用及其作用机制主要包括以下六个方面：( 1 ) 阻止血管紧张素i i 的 生成；( 2 ) 保存缓激肽的活性：缓激肽_ n o 途径；( 3 ) 抑制局部组织r a s 2 1 l ；( 4 ) 保护血管内皮细胞与抗动脉粥样硬化作用【2 2 】；( 5 ) 抗心肌缺血与心肌保护作用【2 3 】；( 6 ) 对血流动学的作用【2 。合成a c e 抑制剂最大缺点就是副作用大。 1 3 2 2 蛋白酶水解制备食源a c e 抑制肽 降血压肽是一类a c e i ，通过抑制a c e 活性而起到降血压的作用。1 9 7 9 年，o s h i m a 等首次报道了来源于食品蛋白质的降血压肽【2 4 】，研究人员利用胶原蛋白酶水解明胶， 获得了九条具有a c e 抑制作用的小肽，其中六条具有显著的a c e 酶抑制作用，并且 5 江南人学硕j j 学位论文 其c 一木端都具有a l a h y p ( h y p - h y d r o x y p r o l i n e ，羟脯氨酸) 结构【2 5 】。随后，m a r u y a m a 等在酪蛋白的水解物中分离到一条具有a c e 酶抑制活性的小肽，命名为c e i l 2 ( p h e p h e v a l a l a p r o p h e p r o g l u v a l p h e g l y l y s ) ，其i c 5 0 ( 在a c e 酶抑制活性的 测定条件下，能抑制a c e 酶5 0 活性所需要的该小肽的浓度，下同) 为7 7i t m o l l t 2 6 j 。 后来，他们又在酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分离到了两条a c e 抑制活性更强的小肽， 分别为c e il s 7 和c e l 5 。其中，c e l 5 ( p h e p h e v a l a l a p r o ) 来源于c e i l 2 ，其i c 5 0 为6 0p m o l l ；而c e i l 3 7 则来源于0 c 酪蛋白，其i c 5 0 为1 5p m o l l 。动物实验表明， 尽管c e i l 7 和c e l 5 的i c 5 0 值比c e i l 2 小，但在相同的浓度下，则只有c e i l 2 具有增 强b k ( 舒缓激肽) 活性的功能【27 1 。另据报道，同本学者s u e t s u n a 等利用来源于米曲 霉的一种名为d e n a z y m ea p 酶水解沙丁鱼【2 8 3 0 1 ，得到了两条分子量大小为10 0 0 - - 2 0 0 0 的小肽，该小肽具有较强的a c e 酶抑制活性，经体外实验测定，i c 5 0 分别为3 9 7 m g 10 0m l 和9 0 1m g 1 0 0m l 。随后，在另一个实验中，s u e t s u n a 用胃蛋白酶水解沙 丁鱼得到的a c e 酶抑制活性更强的小肽，i c 5 0 仅为2 7 1m g 1 0 0 m l 。动物实验表明， 经静脉注射该小肽后，自发性高血压大鼠s h r ( s p o n t n a n t l yh y p e r t e n s i v er a t s ) 的血 压显著降低；并从沙丁鱼的胃蛋白酶的水解物中分离到了一条具有更高a c e 酶抑制 活性的八肽，i c 5 0 仅为9p g m l ，动物实验结果表明，无论口服或静脉注射均有降压 作用【3 i 】。 ： 据近年来国内外报道，大量的a c e 抑制肽从不同食物蛋白酶水解物中被分离鉴 定出来，这些食物蛋白除了上述提到的酪蛋白和沙丁鱼蛋白，还包括乳清蛋白【3 2 、3 引， 鸡蛋蛋白1 3 4 1 ，胶原蛋白盼3 6 1 ，小麦蛋白【3 7 】，大豆蛋白1 5 ，3 8 4 ，酒糟蛋白【4 2 】，蜂王浆， 金枪鱼【4 4 4 5 1 ，玉米蛋白【4 6 4 7 1 ，菠菜，大蒜以及小红豆蛋白例等。由此可知，食 物蛋白中存在着大量的具有不同分子特性的a c e 抑制肽片段。 1 3 2 3d n a 重组技术制备a c e 抑制肽 吕桂善等人用具有降血压作用的来源于酪蛋白的一段多肽氨基酸序列c e l l 2 ，人 工合成了一段双链d n a 分子，经酶切后与表达载体p q e l 6 连接，转化进入到大肠 杆菌e c d ，fj m l0 9 和e c d 以d h 5 a 中，从中筛选出阳性重组克隆，并进行诱导表达， 经s d s p a g e 电泳分析和w e s t e mb l o t t i n g 蛋白质印迹检测表明，该抗高血压小肽 c e i l 2 ( 与d h f r 融合后) 在e c o hj m l 0 9 中得到了成功表达。但是吕桂善等人也 提出了该方法存在诸多限制条件，比如说宿主存在特异性，表达产物的分离纯化困难 刍型5 卜5 2 】 1 丁-o 1 3 3a c e 抑制肽的分类 为区分a c e 底物及其真正的a c e 抑制肽，在检测肽的a c e 抑制活性前通常降 肽与a c e 共同孵育而由此将a c e 抑制肽分为三类【5 3 j ：( 1 ) 抑制剂类型，这类肽与 a c e 孵育后其i c 5 0 值不变，也即a c e 不能将这种肽水解，它的活性保持不变，如 i l e t y r 和i l e l y s t r p ；( 2 ) 前体药抑制剂类型，这类肽被a c e 或胃肠道消化酶水解 6 后转化成为真正的a c e 抑制剂，如l e u l y s p r o a s n m e t ( i c 5 0 = 2 4 0 l am o t l ) 被a c e 水解后生成了活性更强的l e u l y s p r o ( i c 5 0 = 0 3 2 l am o l l ) ：( 3 ) 底物类型，这类肽被 a c e 水解成活性更低或无活性的肽片段，如p h e l y s g l y - a r g - t y r - t y r - p r o ( i c 5 0 = 0 5 5 um o l l ) 被a c e 水解成p h e - l y s - g l y 、a r g t y r 和t y r - p r o ，其i c 5 0 升至3 4l im o l l 。 1 3 4a c e 抑制肽的体内吸收特性 大量的动物及临床实验证明，许多体外具有a c e 抑制活性的食物蛋白酶解物及 其肽口服液口服或静脉注射后具有降血压活性，并能抑制组织a c e 活性。但是也有 例外情况， m a r u y a m a 等研究表明，f i s i - 酪蛋白f ( 1 0 4 - - 1 0 9 ) 片段在体外具有极强的 a c e 酶抑制活性，在s h r 体内却没有降血压作用，这可能是该肽在体内被降解了的 缘故【5 4 5 5 1 。a c e 抑制肽的体外抑制活性不完全与体内降血压效果成正相关关系。a c e 抑制肽能否顺利到达目的组织而不被降解，是a c e 抑制肽能够发挥降血压作用的关 键。m a s u d a 等在l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u s 发酵的酸牛乳灌喂的s h r 的主动脉中检测到 了i p p 和v p p 的存在，而在对照组中却没有发现，作者推测，这可能是因为该小肽 的羧基末端是p r o 残基，对体内消化酶的降解具有极强的抵抗作用，从而以完整的形 式直接被肠道吸收，最后运输到了目的组织中1 5 引。m u l l a l l y 等对牛乳d 乳球蛋白水解 获得的具有a c e 酶抑制活性的七肽f ( 1 4 2 1 4 8 ) 进行研究发现，用胃蛋白酶和胰糜蛋 白酶消化1 小时后没有发生降解( 尽管该肽中具有胰糜蛋白酶的酶切位点) ，作者认 为，这可能是因为小肽片段太小，不利于蛋白酶的水解1 5 川。事实上，许多a c e 抑制 肽能够抵抗胃肠消化酶的水解，尤其是小肽很容易以完整的形式在肠道中通过肽转运 载体吸收【5 8 】。另外，c 末端为p r o p r o 的三肽还能够抵抗p r o 特异性肽酶的水解【5 9 1 。 因此可以推测，口服强a c e 抑制活性的二肽和三肽尤其是含有p r o 的短肽较容易以 完整的形式被吸收至血液循环系统从而发挥降血压作用。然而，也有一些体外抑制活 性弱的a c e 抑制肽口服或静脉注射后显示出了强降血压活- 生1 3 3 , 4 6 , 6 0 】。 总之，a c e 抑制肽要想在体内具有抗高血压作用，必须以完整的形式被肠道吸 收。对于小肽的吸收，一般而言，短肽要比长肽更容易吸收些，因此，短肽的降血压 效果通常要比长肽的效果好。关于小肽在人体肠道的吸收机制，一些学者作了全面而 深入的阐述 6 i 6 2 j 。 1 4 乳酸茵与a c e 抑制肽 既然通过外源蛋白酶水解食品蛋白可以释放其中的活性肽，那么利用微生物蛋白 酶水解其培养基质中的蛋白释放生物活性肽也是可行的。乳酸菌是公认的“益生菌”， 可以给人们健康带来益处，它们可以通过胞外蛋白酶的水解作用，将食品蛋白中的 a c e 活性肽释放出来，因此乳酸菌发酵食品就可能具有潜在的降血压活性。 1 4 1 乳酸茼降血压研究进展 1 9 9 0 年f u r u s h i r o 等人发现，l a c t o b a c i l l u sc a s e i 的细胞自溶物的提取物( l e x ) 对 7 垩堕尘堂堡! ：兰篁笙奎 s h r 有强的降血压作用，口服1 0m g k g ( b w ) 6 h 后，收缩压下降1 4m m h g 。虽然低 剂量口服无效，但长期使用降压作用明显。l e x 降压作用的特点是停药后降压作用可 保持一定时间，而且对正常鼠无作用。l e x 的作用主要依赖于多糖、蛋白质和核酸等 水溶性高分子质量的物质【6 引，从此拉开了乳酸菌降血压机制研究的序幕。上世纪九 十年代初期，两位日本学者y a m a m o t on 和n a k a m u r ay 对乳酸菌降血压机制进行了 深入研究。y a m a m o t on 在1 9 9 3 年从l h e l v e t i c u sc p 7 9 0 ( 分离自同本c a l p i s 发酵剂) 的细胞壁提取物中分离纯化出一种胞壁蛋白酶，这种蛋白酶可以水解0 【一酪蛋白和p 酪蛋白但不能水解k - 酪蛋白【6 4 1 。1 9 9 4 年，y a m a m o t on 用这种酶水解酪蛋白后发现， 魄】酪蛋白和b 酪蛋白的水解产物都具有a c e 抑制活性，并且纯化出来的很多条肽都 具有a c e 抑制活性，活性最高的是一条来自于p 酪蛋白的2 7 肽，其i c 5 0 = 4 “m ； 用l h e l v e t i c u sc p 7 9 0 发酵制成的酸奶饲喂s h r ( 5m l k g 体重) 后，4 - 一8 小时内， s h r 的收缩压可降低2 0m m h g 以上【6 引。1 9 9 5 年，n a k a m u r a 等人用c a l p i s 发酵剂生 产的酸奶饲喂s h r4 8 小时内，s h r 的收缩压可降低1 7 7m m h g 以上，并用四步 反相液相色谱从酸奶乳清中分离纯化出两条具有a c e 抑制活性的三肽：i p p 和v p p ， 其i c 5 0 分别是9i _ t m o l l 和5l x m o l l1 6 6 j ，n a k a m u r a 用这两条肽饲喂s h r 证实i p p 和 v p p 具有极强的降低血压作用，并研究了饲喂量和s h r 动脉压变化的关系6 7 1 。 ：表卜1 不同乳酸菌的发酵乳对a c e 的抑制作用与其对s h r 的降压作用1 7 5 1 t a b 1 - 1a c e i n h i b i t o r ya b i l i t i e sa n da n t i h y p e n e n s i v ee f f e c to fd i f f e r e n tl a c t i ca c i db a c t e r i af e r m e n t e d m i l k l 7 5 1 x 土s d ( n = 5 ) ；宰p 0 0 5 。p 0 0 1 8 第一常绪论 进入二十一世纪，利用乳酸菌发酵来降血压得到了迅猛发展。2 0 0 0 年k a w a s e 等 人发现利用l c a s e it m c 0 4 0 9 和s t r e p t o c o c c u st h e r m o h i l u s t m c l 5 4 3 发酵牛乳不仅有降 低血胆固醇的作用，还有显著的降血压作用【6 引。2 0 0 0 年g o b b e t t i 采用三d e l b r u e c k j i s u b s p b u l g a r i c u ss s l 和l 1 a c t & s u b s p c r e m o r i sf t 4 混合发酵后，从h - c n 获得多个 a c e i 肽，其中f ( 4 7 5 2 ) 与a r g i i 有5 个相同的氨基酸残基组成，利用化合物与a r g i i 部分同源性，可以竞争a r gi i 受体【6 9 】。2 0 0 5 年f l a m b a r d 用办p 加e t i c u sd s m l 4 9 9 7 和 三1 a c t i si g 2 2 7 混合发酵，得到o 2 5 5 0m g m l 的半抑制活性【7 0 j 。2 0 0 6 年m u g u e r z a 等人研究了几株e n t e r o c o c c u sf a e c a l i s 发酵乳牛乳的降血压活性，动物实验证实s h r 的收缩压可降低3 0m m h g 以上【7 1 1 。乳酸菌除了发酵牛乳外，发酵其它乳制品和豆制 品也可以产生具有降血压物质的a c e 抑制肽，比如说山羊奶、猪奶、水牛奶、人奶 7 2 、7 3 】和豆奶【7 4 1 。己通过体内外验证的发酵产物具有a c e 抑制活性的一些乳酸菌菌株 如表1 1 。 乳酸菌发酵生成的a c e 抑制肽具有以下的优点：( 1 ) 无副作用，安全性高。食源抗 高血压肽只对高血压患者起降压作用，对血压正常者无降压作用；( 2 ) 抗高血压肽分子 量低于1 0 0 0 d a ，易于人体吸收；( 3 ) 发酵采用的菌种为益生菌，对人体有安全性，并 可以调节肠道的菌群平衡，有预防和治疗腹泻等多重功效；( 4 ) 可较好地消除人体对蛋 白成分的过敏现象，即消除了过敏原又提高了利用率；( 5 ) 降血压肽无需分离纯化出 来，可以直接被人体食用。 1 4 2 乳酸菌降血压类产品 乳酸菌发酵制品的功能性一直是一个研究热点，但是乳酸菌发酵乳的降血压功能 在近几年才引起研究者的关注，而且乳酸菌发酵乳降血压功能的临床研究十分缺少。 h a m 等通过双盲实验证明，中度高血压患者自愿者每同服用9 5m l 的发酵乳饮料 c a l p i s ，服用4 周和8 周后，收缩压分别降低1 2 5 3 2 2 6 8p a 和1 8 7 9 8 4 0 2p a ，第8 周 舒张压下降9 1 9 9 2 1 8p a ，而服用酸化牛乳的对照组血压值没有变化。两组自愿者的 心律、体重、血清h d l 和甘油三酯等生理指标无差异。自愿者在停止服用c a l p i s 后， 血压值能保持4 周不上升【7 酬。许多学者对富含三肽i p p 和v p p 的酸乳进行多次高血 压人群试验，受试人群未服用高血压药物，结果表明该种酸乳可以适度改善的高血压 患者的血压【7 7 , 7 8 1 。 目f j i ，已经上市的乳酸菌发酵产物降血压类产品有日本c a p l i s 公司用l h e l v e t i c u s c p 7 9 0 和& t h e r m o p h i l u s 混菌发酵的酸乳，芬兰v a l i o 公司用l h e l v e t i c u sl b k 1 6 h 发酵的e v o l u s 酸奶，但是这两种产品目前都没有投放到中国市场，国内也没有相似 产品上市。 1 4 3 现阶段研究中存在的问题 虽然有一些体外和动物体内实验都证实了乳酸菌发酵制品具有抗高血压效果，但 是目前的研究仍然存在着一些问题： 9 江南大学硕上学位论文 1 对于“乳酸菌”这一大类的菌的a c e 抑制活力研究不够广泛，针对瑞士乳杆 菌研究较多，对其它属、种乳酸菌的抗高血压作用研究相对较少，乳酸菌a c e 抑制 活力在属种间的分布规律尚无研究报道。 2 对于具有a c e 抑制作用的乳酸菌的筛选目前没有简捷快速的模型，通常以体 外a c e 抑制率的测定为唯一手段，这种方法成本高、操作难度大、费时费力。 3 对乳酸菌蛋白酶系统的研究还不够透彻，因此对乳酸菌蛋白酶作用乳蛋白释 放a c e 抑制肽的机理和条件研究得不够深入。 1 5 立题意义及主要研究内容 目前用于治疗高血压的重要一线药物都是合成抑制剂，都有一些副作用。随着人 们对自身健康意识的不断增强，人们己不仅仅满足于药物的治疗效果，对药品安全性 也越加关注了。食物蛋白源的a c e 抑制肽降压效果虽然不及人工合成的a c e 抑制肽， 但是它们安全性高，只对高血压患者起到降压效果，对血压正常者不起降压作用，降 压作用平稳而温和。同时a c e 抑制肽还有多功能性和易吸收的特点，所以开发具有 降血压功能的功能性食品有非常广阔的前景。 乳酸菌在食品中的应用有着悠久的历史，早在公元前3 世纪我们的祖先就用它来 制作泡菜和腌菜。国外科研工作也发现了益生乳酸菌具有a c e 抑制作用，而且在芬 兰和日本市场上已经有了相关的具有a c e 抑制活性的乳酸菌发酵制品，但在国内这 方面的研究很少，更没有这类产品问世。所以还需要大量的理论研究工作为丌发具有 降血压作用的乳酸菌制品做铺垫。 基于以上认识，本文的研究内容主要分为五个部分： 1 以各种常见的发酵乳酸菌为研究对象，测定它们发酵脱脂牛乳后a c e 抑制率 的大小，摸索出乳酸菌a c e 抑制活力在属种问的分布规律，筛选出一株a c e 抑制活 力高的乳酸菌。 2 研究各菌株的蛋白水解活力、产酸能力与a c e 抑制活力之间的联系，为优化 体外筛选抗a c e 抑制活力的乳酸菌模型提供依据。 3 选择一株a c e 抑制活性最高的乳酸菌l h e l v e t i c u s6 0 2 4 ，研究它的生长发酵 特性与其a c e 抑制活力的关系，通过模拟胃肠道消化来验证l h e l v e t i c u s6 0 2 4 发酵乳 中a c e 抑制肽的抗消化能力，为丌发功能性乳酸菌发酵制品提供理论依据。 4 综合主、客观两方面因素，建立一套合理的评价发酵乳制品的指标体系。 5 对l h e l v e t i c u s6 0 2 4 进行了应用方面的研究。利用三办p e t i c u s6 0 2 4 与直投式 发酵剂混菌发酵制备发酵乳，使其感官特性易于接受，同时具备a c e 抑制活性。 1 0 第二章不同乳酸菌发酵乳a c e 抑制活力的比较 2 1 前言 第二章不同乳酸菌发酵乳a c e 抑制活力的比较 研究表明，乳蛋白中蕴含很多活性肽段，这些肽以非活性的稳定状态存在于蛋白分 子中，可以通过体内或者体外的酶水解作用将这些功能肽释放出来，包括类吗啡肽 ( o p i o i dp e p t i d e s ) 、抗血栓肽( a n t i t h r o m b o t i cp e p t i d e s ) 、酪蛋白磷酸肽( c a s e i n h o s p h o p e p t i d e s ) 、免疫调节肽( i m m u n o m o d u l a t i n ge p t i d e s ) 、抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) 以及血管紧张素转化酶抑制肽( a c ei h i b i t o r yp e p t i d e s ，简称a c e 抑制肽等) 7 9 8 0 1 。自 从y a m a m o t on 等人1 8 l j 发现发酵酸乳对自发性高血压大