（食品科学与工程专业论文）高浓度酒精发酵菌株的筛选及应用研究.pdf

中国农业大学硕士学位论文摘要 摘要 本研究通过菌株筛选，得到株产高浓度酒精的酿酒酵母x 3 3 0 ，研究不同的培养条件对其发 酵酒精能力的影响，为工业化应用提供理论和实践上的指导。研究结论如下： ( 1 ) 以酿酒酵母x 3 3 0 为材料，研究各种因子( 糖浓度、氮源，无机盐、p h 值、温度、接种量) 对其发酵酒精能力的影响。结果表明，各种氮源对发酵酒精能力的影响不同，由高到低的顺序是 酵母膏 蛋白胨 硫酸铵 尿素 氯化铵。初步找到了发酵2 5 0g l 葡萄糖，菌株所需三种主要 无机盐的临界值，分别是磷酸二氢钾2 9 l ，硫酸镁3 9 l ，氯化钙1 5 9 l 最佳初始p h 值为5 o ； 最佳发酵温度为3 0 1 2 ；最佳接种量为1 0 ( v v ) 。 ( 2 ) 就添加营养物质、渗透压保护剂和肌醇对酿酒酵母x 3 3 0 高浓度发酵时生产酒精能力的影 响进行了初步研究。结果表明，与渗透压相比，营养缺乏对酿酒酵母高浓度发酵时酒精产量可能 起着更为关键和重要的作用。发酵培养基中各营养元素对酒精发酵的影响不同，由高到低的顺序 是酵母抽提物 蛋白胨 硫酸镁 维生素c ：磷酸二氢钾 氯化钙= 硫酸铵。渗透压保护剂( 甘 氨酸和脯氨酸) 能有效提高菌体发酵酒精能力当甘氨酸添加浓度为2 0m m o l l 或脯氨酸添加浓 度为1 0 m m o l l 时，发酵终点酒精浓度最高，但甘氨酸的促进作用强于脯氨酸。肌醇可以提高发 酵速度和菌体的发酵能力。 关键词酿酒酵母，高浓度酒精发酵，发酵条件，营养缺乏，渗透压保护剂 中国农业大学硕士学位论文 摘要 i 置曼曼曼曼曼曼曼曼璺e 曼曼置置曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇鼍曼量暑曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇 a b s t r a c t a c c o r d i n g t of o u rm o s t w i d e l ye m p l o y e dm e t h o d s ，as t r a i n o fe t h a n o l - t o l e r a n ty e a s t , s o c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ex 3 3 0 w a s r e e n e d t h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc u l t u r ec o n d i t i o n s e t h a n o l f e r m e n t a b i l i t yo f s e e r e v i s i a ex 3 3 0w a ss t u d i e d t h et h e s i sc a r r i e dt h r o u g hs u c hs t u d ya st h ef o l l o w s ： ( 1 ) t h ei m p a c t so fi n g r e d i e n t s ( n i t r o g e ns u u r c ( , ，i n o r g a n i cs a l t , p h ，t e l n p e r a t u r e ，a n ds e e d v o l u m e ) 0 ne t h a n o lf e r m e n t a b i l i t yo f & c e r e v i s i a ex 3 3 0 w e l ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t si l l u m i n a t et h a t t h ee f f e c to fn i t r o g e n5 0 u r so ne t h a n o lf e n n e a t a b i l i t yi sd i f f e r e n t , w h i c hi sy e a s te x a c t p e p t o n e a m m o n i u ms u l f a t e u r e a a m m o n i u mc h l o r i d e m o r e o v e r , t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o n so ft h e s e i n o r g a n i cs a l t w c t e g a i n e d e x p e r i m e n t a l l y , s u c h a s 2 9 l p o t a s s i u m p h o s p h a t e ，3 9 l m a g n e s i u m s u l f a t e a n d1 5 叽c a l c i u mc h l o r i d e t h eo p t i m u mi n i t i a t o r yp hi s5 0 ，t h eo p t i n 蛐t e m p e r a t u r ei s3 0 ca n d t h eo p t i m u ms e e dv o l u m ei sl o ( v v ) ( 2 ) t h e 呻a c t so f o s m o p r o t e c t a n t s , n u t r i e n tc o m p o n e n t sa n di n o s i t o l e t h a n o lf a e n t a b i l i t yo f & c e r e v i s i a ex 3 3 0w e r ei n v e s t i g a t e dw h e nh i g hg r a v i t ys y n t h e t i cm e d i u mw e r eu s e d t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tn u t r i e n tl i m i t a t i o np l a y si m p o r t a n tr o l ei nt h ee t h a n o lf e r m e n t a b i l i t yo f s c e r e v i s i a e w h e n t h en u t r i t i o n a lr e q u i r e m e n t so f & c e r e 订s i a ea r cs a t i s f i e d , i t se t h a n o lp r o d u c 吐o ni n c r e a s e s , e s p e c i a l l ya t 1 1 i g hs u g a rc o n c e n t r a t i o n s t h ee f f e c to ft h ei n d i v i d u a ln u t r i e n tc o m p o n e n ti nt h ep y n r l c d i n n l0 1 1 e t h a n o lf e r m e n t a t i o ni sd i f f e r e n t , w h i c hi sy e a s te x a c t p e p t o n e m a g n e s i u ms u l f a t e v i t a m i n c = p o t a s s i u mp h o s p h a t e c a l c i u mc h l o r i d e = 锄f l l d o n i ms u l f a t e o s m o p r o t e c t a n t s ( s u c ha s g l y c i n ea n dp r o l i n e ) a r ee f f e c t i v ei ni m p r o v i n g t h ee t h a n o lf e r m e n t a b i l i t yo f s c e r e 协i a ex 3 3 0 ，a n dt h e o p t i m u mc o n c e n w a f i o n so f2 0m m o l lg l y c i n ea n d1 0m m o f lp r o l i n ew e r eo b t a i n e de x p e r i m e n t a l l y w h i l eg l y c i n ee x e r t e das t r o n g e re n h a n c i n ge f f e c tt h a np r o l i n e i n n s i t o li se f f e c t i v ei ni m p r o v i n gt h e e t h a n o lp r o d u c t i o no f sc e r e v i s i a ex 3 3 0 k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i m a e , v e r y - h i g h - g r a v i t ye t h a n o f i cf e r m e n t a t i o n , c u l t u r ec o n d i t i o n s , n u t r i e n tl i m i t a t i o n , o s m o p r o t e c t a n t s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：菊籀迓延 时间：2 0 6 年i f 月斗日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：薜常赠火 翩魏苗锡 时间： 2 阳6 年月斗日 嚼润：母6 年f 其2 ，l 勰 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 研究意义 第一章绪论 乙醇即酒精，广泛应用于国民经济的许多部门。在食品工业中，乙醇是配置各类果酒，葡萄 酒、甘露酒，药酒和生产食用醋酸及食用香料的主要原料；乙醇也是许多化工产品不可缺少的基 础原丰1 ；和溶剂；同时它还是生产油漆和化妆品不可缺少的溶剂；在医药工业和医疗事业中，乙醇 用来配制提取医药制剂和作为消毒剂；染料生产，国防工业等其他工业部门也需要大量的乙醇。 乙醇工业和农业有着十分密切的联系。乙醇工业从农业获得原料，农业不仅需要乙醇来配置农药， 而且乙醇工业的下脚料一酒糟经过适当的处理后则是良好的饲料。乙醇工业是唯一能利用败坏 的粮食原料，并将它转化成优质产品的工业部门。乙醇生产是农业原料深度加工和综合利用的一 条重要途径 二十世纪七十年代出现的石油危机，使世界各国开始重视开发石油替代资源。燃料酒精，作 为一种可再生能源，也重新引起了人们的关注，许多国家对该产业的发展寄予厚望。如巴西和美 国等制定了相应的“绿色能源”计划，促进了对燃料酒精生产技术的开发。在当时条件下，微生物 发酵法生产酒精的生产成本较高。因而，随着石油危机的缓解，燃料酒精的开发热潮逐渐减弱 近年来，全球经济的高速发展导致资源消耗速率相应增加，加之以石油为代表的不可再生的各类 矿物质资源贮量有限，资源短缺的矛盾再一次出现在人们面前此外，矿物质资源的过度开发利 用导致生态环境的不断恶化，开始威胁着社会的可持续发展，促使人们重新寻求环境友好的可再 生资源。 发展燃料酒精这项技术在国外已十分成熟。巴西是目前世界上年产燃料酒精最多的国家，也 是世界上唯一不使用纯汽油作汽车燃料的国家，主要生产含水酒精和无水酒精。美国是世界第二 大酒精生产国，其中8 0 为燃料酒精，仅次于巴西的产量2 0 0 2 年1 2 月，美国政府能源部 ( d e p a r t m e n to f e n e r g y ) 、农业部( d e p a r t m e n to f a g r i c u l t u r e ) 、环境保护署( e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n a g e n c y ) 及国家自然科学基金( n a t i o n a ls c i e n c ef o u n d a t i o n ) 等部门联合颁布了( 2 0 3 0 年美国生 物质资源综合开发利用远景规划器o a d l l l a pf o rb i o m a s st e c h n o l o g i e si nt h eu n i t e ds t a t e s ，旨 在鼓励研究开发从可再生的生物质资源出发生产包括燃料酒精在内的各类产品的关键技术在我 国，酒精在燃料方面的应用尚未形成规模。我国石油年消费以1 3 的速度增长，而能源产量只能 满足国内需求的7 0 ，是世界仅次于美国的石油进口国，2 0 0 3 年进口原油9 1 1 2 万吨，2 0 0 4 年将 超过1 亿吨，至2 0 2 0 年要实现g d p 翻两番的目标，我们要支付巨大的“能源账单”这些因素 促使中国政府决定发展燃料酒精工业，并制定了国家“十五”燃料酒精发展专项规划【1 1 然而，在目前条件下，燃料酒精的生产成本还难于同汽油和柴油等成品油的价格相竞争，其 生产和使用在相当大的程度上依赖于政府的补贴，而高浓度酒精发酵作为解决当前实际生产的可 行方法，具有极其重要的意义。 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 2 酒精发酵的原料、菌种及发酵机理 酵母菌所能利用的底物范围非常有限。如不能利用由淀粉水解产生的大部分寡糖，包括比麦 芽三糖链更长的糊精和异麦芽糖，也不能利用纤维素、半纤维素、纤维二糖和大多数戊糖。酵母 菌不能利用各种价格低、来源广的原料，是降低酒精生产成本的一大障碍，因此。寻找可以利用 更多原料的菌株是酒精发酵研究的一个发展方向。 目前可利用的原料主要有三类：( 1 ) 糖质原料，包括甜菜、甘蔗、瓜干，糖蜜、乳清和甜高粱 等等。( 2 ) 淀粉原料，包括玉米、小麦、木薯、马铃薯等等( 3 ) 纤维素和半纤维素产品，包括甘 蔗渣、农作物废料、林产品等等。各国根据本国的实际情况选用不同的原料来进行发酵，如在巴 西主要利用甘蔗汁和废糖蜜生产酒精，而在美国则更多的是采用玉米为原料。 目前，发酵生产工业酒精的菌种主要以酵母菌为主通过糖酵解途径( e m p 途径) ，酵母菌 将葡萄糖高效转化为乙醇和二氧化碳，生产的酒精占理论产量的9 0 - - - 9 5 。酵母菌的种类很多， 包括有孢子酵母、产冬孢子的类酵母、掷孢酵母和无孢子酵母等，涵盖6 0 个属5 0 0 多个种刚在 真菌分类系统中，它们分别隶属于子囊菌纲( a s c o m y t e t e s ) 担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) 、半知菌纲 ，卿i m p e r f e c t o 。酒精工业生产上常用的酵母菌属于真菌f ( e u m y c o t a ) 、子囊菌纲( a s c o m y c e t e s ) ， 半子囊菌亚纲( h e m i a s c o m y c e t e s ) 、酵母 | ( e n d o m y c e t a l e s ) 、酵母科( s a c c h a r o m y c e t a c e a e ) ” 大多数用于酒精发酵的酵母菌都属于酵母属( s a c c h a r o m y c e t a c e ) 的酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 、卡尔斯伯酵母( s a c c h a r o m y c e sc a r l s b e r g e n s l s ) ，清酒酵母( s a c c h a r o m y c e ss a k e ) 及其变种。 其它的属，如果酒裂殖酵母( s h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 脆壁克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e s f r e g i l i s ) 、 树干毕赤酵母( p i c h i as a p i 出) 、克劳森酒香酵母( b r e t t a n o m y x e sc l a u s s e n i 0 、热带假丝酵母( c a n d i d a t r o p i c a l i s ) 和管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n ，p 删) 等也有一定的应用9 j 工业上常用的酒精发酵菌株有k 字酵母、南阳1 3 0 0 酵母、南阳1 3 0 8 酵母、拉斯2 号，拉斯 1 2 号、古巴i 和古巴等等，均属于酿酒酵母僻c e r e v i s i a e ) 。酒精生产中对酵母菌菌株的生理特 性有一定的要求阿：( 1 ) 发酵力强而且迅速，有较强的酒化酶；( 2 ) 繁殖速度快，有较强的增殖能力； ( 3 ) 耐酒精能力强，能在较高浓度的酒精发酵醪中发酵；( 4 ) 耐温性能好，能在较高温度下发酵；( 5 ) 抵抗杂菌能力强；( 6 ) 耐酸能力强；生产性能稳定，变异性小，发酵时产生泡沫小。 酒精发酵主要由酵母菌在厌氧条件下通过e ，途径将葡萄糖降解为丙酮酸，然后在丙酮酸脱 氢酶的作用下，将丙酮酸脱羧形成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的作用下生成乙醇。淀粉和纤维素等 多糖物质则需经过淀粉酶和糖化酶的转化，形成葡萄糖，再经e m p 途径生成酒精，而细菌的酒精 发酵主要是经过e d 途径形成酒精。酵母酒精生物合成途径如图1 1 所示 在酵母菌代谢生成酒精过程中，研究人员对何种条件下酵母菌能产最大量酒精以及在高浓度 酒精中酵母菌的耐受性等问题极为关注随着高浓度酒精发酵技术在生产中的广泛应用，尤其是 出于对产品质量和经济效益的考虑，更增加了人们对酵母菌在这两个方面的兴趣。目前工业生产 中用酵母菌发酵酒精的研究重点集中在两个方面：一是拓宽酵母苗可利用的底物，找到更廉价的 原料；二是选育高产酒精酵母，培育出酒精产量高并能耐受高浓度酒精的新菌株。 2 【黼鲫 蕞城 图l l 酵母菌的酒糟生物合成途径 f i g1 - 1p a t h w a yo f b i o s y n t h e s i so f a l c o h o l 由葡萄糖发酵生成酒精的总反应式为： c 出1 2 0 6 + 2 a p d + 2 h 3 p o , - + 2 c h 3 c h z o h + 2 c 0 2 + 2 a t p + 1 0 4 6 0 0 j 1 3 高浓度酒精发酵的研究进展 1 3 1 高浓度酒精发酵的定义 戥 r 所谓的高浓度酒精发酵，是以提高单位体积内发酵醪液中淀粉的含量，在适量的酿酒酵母菌 作用下，在一定的时间内力求得到最多的发酵终产物酉精。采用高浓度葡萄糖进行发酵最早 由c a s e y 等人提出，将高浓发酵定义为含大于等于1 8 9 可溶性固形物1 0 0g 发酵液( 1 8 叩l a t o ) 的发酵 - q 。传统发酵的发酵液的可溶性固形物含量为1 1 1 2 0 p ，而1 3 1 6 0 p 就被定义为高浓度发酵。 一般来说在工业化条件下，糖浓度不超过2 0 0 , 4 ( w v ) ，这是因为逐渐增加的乙醇浓度阻碍了酵母 的生长而使发酵停止现在，酿酒和燃料酒精生产企业通常采用的谷物糖化醪的可溶性固形物含 量为2 0 - 2 4 1 0 0g ，在这个范围内的可溶性固形物含量定义为正常浓度。也有人将高浓度酒精发 酵技术定义为：每l l 发酵液含3 0 0g 或更高可溶性固形物的糖化醪的发酵嗍，在理论上当发酵醪 液葡萄糖浓度达到2 8 ( w v ) 左右时就相当于1 l 发酵醪液中含可溶性固形物3 0 0 一”。还有人 将浓醪发酵( r u g ) 技术定义为“含2 7g 1 0 0g 糖化液或更高的糖化液的制备和发酵即。但是有学 者认为在工业发酵中，由于存在酵母存活率、缓慢发酵和发酵停止的问题，因而碳水化合物的浓 度超过1 8 是不可行的l l o j 。 高浓度酒精发酵过程可以提高设备利用率，降低能耗，减少环境污染。当可溶性固形物含量 从1 6g 1 0 0g 升高到3 1g 1 0 0g ，可节水5 8 5 ，同时采用v h g 发酵技术还可以在不增加工厂生产 能力的基础上增加产出【l “ 3 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 3 2 影响高浓度酒精发酵的因素 1 3 2 1 葡萄糖浓度的影响 葡萄糖是酵母菌进行酒精发酵的主要基质。当葡萄糖浓度低于1 0g l 时，其消耗速度和糖 浓度成均匀的直线关系，但是目前的酒精生产中葡萄糖浓度远远高于这一数值。但是当葡萄糖的 浓度超过一定浓度值时( 许多学者认为是1 5 0g l ) ，它对酵母菌的发酵和呼吸作用都产生抑制作 用要实现高浓度酒精发酵，必须解决高浓度葡萄糖的抑制作用。 1 3 2 2 酒精的抑制作用 酒精是酵母菌的代谢产物，它会对酵母菌产生毒害作用。随着发酵醪液中酒精浓度的增加， 乙醇可以进入到细胞膜的疏水区，降低了疏水相互作用力( 这种作用力对维持细胞膜的完整性是非 常重要的) 。另外乙醇在疏水区的存在还会降低范德华力的相互作用，增加细胞膜的运动性和疏水 区的极性，使细胞膜减弱对极性分子自由交换的疏水性障碍作用“。不同的酵母菌株它的耐酒精 能力是不同的，但是一般情况下，当发酵醪液中的酒精含量达到2 3 ( v v ) 时，酵母菌细胞不再 生长，也不产生酒精。当酒精含量低于3 89 孙，m 时，它对酵母菌的抑制作用才可忽略不计 1 3 2 3 溶解氧浓度的影响 氧气可以破坏酵母菌酒精发酵的厌氧代谢过程，从而使酵母菌采取有氧呼吸。不进行厌氧发 酵，不产或者仅产生少量酒精。1 5 1 本的福井郎指出，即使在充足氧的条件下，如果有葡萄糖存在。 酵母菌细胞也可以通过发酵途径增殖，此时酵母菌细胞是受阻抑细胞，具有呼吸能低的特点，他 认为高浓度葡萄塘的存在妨碍酵母菌细胞呼吸系的发达，并且减少“功能性”线粒体的个数，从 而使无氧呼吸的酒精发酵途径在一定水平上有所提高1 。常规的酒精发酵醪液中，溶解氧的数量 已经能够保证酵母菌对氧的需要而在高浓度酒精发酵过程中，有限量氧气的存在，可以为酵母 菌提供合成细胞的原生质膜和线粒体中的不饱和脂肪酸和类腊质，从而保护细胞膜的完整性，利 于酒精发酵 1 3 2 4 酵母菌细胞密度的限制 酒精是酵母菌生长代谢的产物，一般情况下，发酵醪液中酵母菌细胞的密度越高，单位时间、 单位容积产生的酒精就越多，效率就越高。但是在一般的间歇发酵工艺中，受发酵醪液中营养物 质的含量、酒精代谢产物浓度及酵母菌自身生理和遗传等因素的影响，醪液中的酵母菌细胞密度 会有一个极限值【1 4 a 5j 。对于高浓度酒精发酵来说，由于发酵醪液中的葡萄糖的浓度比一般的发酵 醪液中高出很多，此时加入酵母菌的数量也应该比一般的间歇发酵醪液中要多，但是考虑到生产 成本以及酵母菌个体间的相互影响，酵母菌细胞的密度应该增加到一个合理的范围内，从而防止 酵母菌因为过量增殖而消耗多余的原料糖，同时又能保证酵母菌细胞正常生理代谢所需要的糖， 实现良性发酵代谢。 1 3 2 5 温度条件 在高浓度酒精发酵中，由于葡萄糖浓度很高，溶液的渗透压增加，容易导致细胞膜破裂，而 4 - 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 此时如果发酵醪液的温度仍维持在一般发酵的最适温度，则有可能会使磷脂分子在膜内作快速的 侧向扩散或者侧向运动，频繁的在脂双层的同一层中与邻近的分子进行交换。结果膜内脂的流动 性增加，膜的完整性容易遭到破坏有些研究表明，高浓度酒精发酵的最适温度是2 7 ( 2 【i ”此 外，温度升高有利于与酵母菌竞争葡萄糖的乳酸菌的生长，从而影响发酵效率，提高生产成本 由此可见，温度是制约高浓度酒精发酵实际生产的一个关键因素 1 3 2 6 副营养物匮乏的影响 在高浓度发酵中如果各种营养物质供应充足，使酵母菌生长健壮，可以部分起到抵抗高浓度 葡萄糖所造成的渗透压的影响，使酵母菌的发酵强度处于较高的水平。但是，随着发酵时间的延 续，除了碳源供应充足外，其他的营养物质出现匮乏，从而影响酵母菌的正常新陈代谢，使其发 酵能力下降，细胞活力偏低，影响最终发酵的彻底性和达到理想的酒分1 ”9 】。因此，寻找并及 时补充这类副营养物在高浓度酒精发酵过程中也极其重要。 1 3 3 高浓度酒精发酵的科研动态 1 3 3 1 改良酵母菌 对于高浓度酒精发酵工艺来说，筛选和构建能快速产生高浓度酒精并能抗高渗透压的酵母菌 是关键的技术。至今，人们已经发展了很多种方法来筛选和构建具有这种特性的酵母菌。 从自然界中直接分离 许多研究结果表明。产高浓度酒精的酵母菌存在于某些天然样品中毛志群等 2 1 采用含有高 浓度酒精选择性培养基从自然界中得到1 1 5 株酵母，经过初筛、复筛，得到1 株高产酒精酵母 s p - 4 8 ，在料水比1 ：2 ，发酵时间7 2h 条件下，成熟醪酒分可达1 6 2 ( v v ) 。刘建军等 2 0 l 对高产 酒精酵母的选育也作了卓有成效的工作，通过从土壤、酒醅等样品中分离筛选并通过热冲击处理、 紫外线和c 0 6 0 - r 射线的物理因子照射，获得一株高产酒精酵母n h y 4 - 3 6 ，以玉米淀粉为原料， 3 2 ( 2 发酵6 0 - 6 8h ，可产酒精度1 7 5 杈v ，v ) ，并且适合边糖化边发酵工艺。 连续培养筛选 很多筛选酒精耐性酵母的方案都采用把细胞逐渐暴露于更高的酒精浓度下的方法。然而，使 用这样的方案并没有明显的增加酒精耐性。o l i v e r 等人l 最近为分离酒精耐性酵母设计了一种连 续筛选反馈控制系统。e m a n d e s 等人 2 2 1 通过改变温度等方法分离出酒精耐性株，以蔗糖为原料。 可产酒精1 6 3g 几。由于酒精抑制酵母的生长和发酵，温度增加酒精在酵母中的毒性，通过改变 温度使酒精耐性株的存活率提高了，发酵能力也提高了。b e r t o l i r d 等人0 3 】分离出可在最初浓度为 3 0 的可发酵糖中发酵的新酵母菌株，并且具有酒精耐性和温度耐性。 原生质体融合 原生质融合最近在工业酵母菌株基因修饰中受到相当的重视，该方法涉及到使用两种互补的 营养缺陷型子代菌株，经酶除去细胞壁之后，等量原生质体混合处理，移到再生培养基，筛选融 合子。通过使用原生质体融合技术，s t e w a “”1 获得了稳定的多倍体酿造菌株( 葡萄汁酵母) 和一个 - 5 - 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 被基因构建的二倍体糖化酵母的融合子，菌株1 4 0 0 ，在以葡萄糖为底物的特定培养基酒精生产能 力增加，在包括以麦芽糖和糊精为底物的全玉米浆培养基中酒精生产能力也增加了。陈国潮等人 通过原生质体融合而获得的酿酒酵母菌株h u - t y - i a 与糖化酵母菌株5 2 0 6 - 1 b 的不同核倍性融 合株。黎碧莲等人8 0 在酿酒酵母与扣囊内孢霉属间原生质体融合产物中，获得兼有两亲株遗传特 性的融合子，进行的发酵试验结果显示乙醇含量比亲株提高很多。 杂交 与原生质体融合技术一样，一个酵母菌株与另一个酵母菌株杂交，也可以改进酵母菌耐酒精 和产酒精能力。例如，有人得到的杂交菌株l s 2 6 c 可以产生1 4 1 ( v v ) 的7 - - , 醇，而亲本菌株之 一蝎产生4 6 ( v v ) z i 葬，另一亲本菌株l a i ，产生1 0 5 ( v ，v ) 乙醇。 诱变 经过紫外线和诱变剂( 如e m s ) 处理的酵母菌细胞培养在含有高浓度酒精的培养基中，也可以 选择到耐高浓度酒精的酵母菌例如，利用这种技术获得的某些酵母茵突变株可以在1 7 5 ( v v ) 乙醇培养基中生长，而它们的野生型菌株所能耐受的最高乙醇浓度仅为1 4 4 。o ( v v ) “ 稀有接合 稀有接合a 勋坤m a t i n g ) 1 2 7 1 是近年来发展起来的用于酵母杂交的新技术。呼吸缺陷型( r d ) 细胞 与营养缺陷型细胞混合培养在y p d 液体培养基中，在3 0 c 下恒温振荡培养2 - 3 天，收集并洗涤 酵母菌细胞，然后把大量的细胞( 约l o 。个细胞) 培养在乳酸乙醇基础培养基中，继续在3 0 c 培养 数天，便可以在平板上选择到两个亲本菌株的融合产物。 工业上使用的许多酵母菌株缺乏形成子囊孢子的能力，因此，获得这些酵母菌的营养缺陷型 就相当困难。但是，当它们生长在含有溴化乙锭的完全培养基中时，它们中某些细胞可被诱发形 成呼吸缺陷型。这样便有可能利用呼吸缺陷型与营养缺陷型通过稀有接合技术获得两个亲本的融 合细胞。这种融合的机理现在尚不清楚。 稀有接合的另一个优点便是可以不考虑酵母菌的倍体和接合型。但是利用这种技术获得融合 细胞的机率很低。 2 - d o g 抗性突变株的分离 许多酵母菌生长在高浓度葡萄糖培养基中时，它们的生长和发酵会受到抑制，这种现象叫做 葡萄糖l 殂遏( g l u c o s er e p r e s s i o n ) 。2 - 脱氧d 葡萄糖( 2 - d o g ) 是一种有毒的葡萄糖类似物，并且不能 被代谢。当这种化合物被吸收进入细胞后，就被酵母菌激酶转化成2 - d o g - 6 - 磷酸，2 - d o g - 6 - 磷 酸不能被进一步代谢。2 - d o g 抗性突变株可以在2 - d o g 培养基中生长，所以，这类突变株为葡 萄糖去阻遏突变株。与亲本菌株比较，这类突变株在高浓度葡萄糖培养基中能快速地利用麦芽糖， 并且在1 6 0 p 麦芽汁中发酵生产酒精的速度有了很大的改进。 热冲击处理 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 许多研究者发现经过热冲击处理( h e a ts h o c kt r e a t m e n 0 1 拘酵母菌细胞在细胞存活率，乙醇抗性 和热抗性方面都有提高。但是，其确切的作用机制尚不清楚。g a r a 等人啪铡用这种技术获得了一 株抗高浓度酒精的酵母菌3 7 ( 5 ) ，与亲本菌株比较，它具有较高的乙醇生产能力 一些研究认为热冲击处理能诱发酵母细胞合成热冲击蛋白，这些热冲击蛋白在酵母菌耐胁迫 ( 耐热、耐酒精) 中起重要作用。一些研究认为热冲击蛋白与菌体受胁迫冲击后细胞生命活动的 恢复有关 2 9 3 0 】，另一些研究认为热冲击蛋白直接参与耐胁迫机制【3 t - 3 3 。不过，却有许多事实提示 热冲击蛋白的作用机制并不是直接提高菌体的抗胁迫能力 3 4 - 3 0 - 3 ，它的主要作用可能是作为一种伴 侣协助细胞螫合和除去由胁迫刺激引起的损伤或异常折叠的蛋白质p 。”l ，从这层意义上说，热冲 击蛋白对菌体从胁迫伤害中恢复过来是必不可少的，但它可能不是诱导菌体对胁迫刺激快速产生 抗性的主要因素。上述这些旨在探索热冲击蛋白是否是直接提高菌体抗胁迫( 高温、高浓度酒 精) 能力所必需的研究表明，热冲击蛋白的作用机制是很复杂的 1 3 3 2 改进生产工艺 t h o m a s 等0 9 1 发展了一种高浓度酒精生产工艺在6 0 c 下，1 2 5 m l 耐高温a 淀粉酶与l l 小 麦粉悬液( 其中小麦粉的浓度为3 5 ) 混合，并保持5 m i n ，然后温度升到9 5 - 9 7 ( 2 ，维持6 0 r a i n ， 并同时进行搅拌，这时再加入1 2 5 m l 耐高温a - 淀粉酶，并在8 0 下继续液化3 0 m i n ，经过这样 的液化处理，所有淀粉都被液化成可溶性糖和糊精。然后加入活性干酵母在2 0 下进行发酵，最 后的发酵醪中含有1 7 1 ( v v ) 的酒精。池振明等 4 0 l 设计了一种低温蒸煮工艺用于生产高浓度酒 精；章克昌教授【4 1 1 在1 9 9 7 年的专利中描述了一种浓醪发酵酒精技术，最终酒精浓度达到 1 3 - 1 6 ，淀粉利用率9 0 以上，发酵时间5 0 h 以内；白风武等人 4 2 1 采用自絮凝酵母进行酒精连 续发酵，发酵最终酒精浓度9 6 6g 厄( 约为1 2 2 ) 江南大学毛忠贵教授1 4 3 】报道了玉米稽化清液 补料发酵工艺，最终酒精浓度可以达到1 5 以上，并实现了蒸馏废液全循环的清洁生产工艺。 此外，研究利用糖蜜、生淀粉、菊糖进行高浓度酒精发酵。 1 4 酵母菌耐酒精机制的研究概况 在酵母菌的乙醇发酵中，随着发酵液酒精浓度的升高，发酵速率逐渐下降，结果，导致底物 转化时间延长和可达终点酒精浓度降低 4 4 j ，这种现象就是酒精对乙醇发酵的抑制作用。此外，酒 精还对酵母菌的生长h ”、存活 4 6 4 7 1 和营养物质的吸收”。4 9 等方面产生抑制作用研究表明，酒 精降低酿酒酵母的最高生长温度例：在3 ( v ) 酒精作用下，最高生长温度为4 2 ，而在1 1 ( v v ) 酒精作用下，最高生长温度为2 7 ，因而，酒精加速菌体的高温致死效应i f , o ；同时，酒 精还使酿酒酵母的最低生长温度升高【卿：在2 ( v v ) 酒精作用下，最低生长温度为3 1 2 ，而在1 1 ( v v ) 酒精作用下，最低生长温度为1 3 另外，酒精还非竞争性抑制酵母菌对葡萄糖、麦芽糖 和氨基酸等营养物质的跨膜运输。酒精尚能有力诱发酿酒酵母丢失线粒体d n a 而成为呼吸缺陷型 s q ，与野生型相比，这是一种小菌落突变型，对酒精的伤害刺激更为敏感。因此，酒精作为一种 化学胁迫因子，对酵母菌生命活动的负面影响是多方面的1 5 2 - 5 4 目前认为发酵终点的酒精浓度与 酵母菌本身的耐酒精性能有关。实践证明，高产酒精酵母对高浓度的酒精均表现出很好的耐性。 - ， 中周农业大学硕士学位论文第一章绪论 在估价不同酵母的酒精耐性中，主要的困难是没有一个普遍认可的对酒精耐性的测定或定义 的方法酒精对细胞有3 个主要影响，虽然程度不同，但它抑制细胞生长仁1 “4 ，细胞存活 性“”“】和发酵2 “8 “s 2 - ” 。这样，根据哪一个参数来定义酒精耐性就依情况而定了p 冽 有多种不同的方法定义酒精耐性。最广泛使用的方法有四种【2 1 2 侧： 根据细胞在外加酒精的培养基中生长时受到的抑制来定义。研究表明”4 习，外源添加酒精 对酿酒酵母的酒精毒害作用要小于酵母发酵产的酒精对其自身的毒害作用因此，通过外源酒精 的添加来定义酒精耐受性并不能真实反映在发酵条件下酵母的酒精耐受能力。此外，细胞生长和 细胞存活性反映出的耐酒精能力要低于发酵。因此，在高产酒精菌株的筛选上不适宜用细胞生长 作为对酒精耐性的测定或定义的方法。这个方法另一主要问题是所使用的培养基会影响酒精耐 性但是，由于这个方法的简单性，适宜于大量菌株筛选以得到耐高浓度酒精的酵母菌。 在相同培养基中。把在无酒精存在时的发酵速率与高酒精浓度时的发酵速率相比。它的 优点在于把酒精耐性和发酵活性联系起来。这个方法的主要问题是外源添加酒精不能反映真实发 酵条件，而且，酒精耐性不是用酒精浓度来表示的。 把酒精耐性与发酵产生的酒精最高量进行关联。有人提出降】发酵酒精浓度与酵母菌本身 的耐酒精性能有关，而且对发酵能力的抑制是酒精耐受性最好的指示剂相同条件下，酒精产量 越高，酵母被认为酒精耐受性越高。这个方法的优点是易于测定酵母的酒精耐受性，即测定发酵 酒精的量。这个方法的主要问题是酒精对细胞生长和细胞存活性的影响被忽略。这种方法最具生 产意义，用此法与第一种方法相结合作为检验手段，可以获得优良的耐酒精高产酒精酵母。 在一定浓度的乙醇冲击下测定细胞的存活率。高浓度酒精冲击下菌体的存活率被广泛用于 评价大量酵母菌株的酒精耐受性以及反映了营养条件和培养环境对耐受性的影响。 研究酵母菌耐酒精的生理机制对于提高发酵工业的酒精产量，探索微生物抵抗不良环境的生 命机制具有重要的实际和理论意义。由于酵母菌耐酒精机制十分复杂，菌体的耐酒精性能受许多 基因控制，因此，许多具体的机制至今仍不清楚。研究表明嗍，醇对许多用于发酵的微生物和许 多其它生物体的抑制作用与醇的脂溶性直接相关，醇的碳链越长，抑制作用越强，暗示醇的作用 位点具有疏水性质，如细胞膜。目前认为，酵母菌细胞膜是酒精作用的主要目标，对细胞膜的损 伤是酒精毒害酵母菌和抑制乙醇发酵的主要方式 4 4 。2 “5 叼。大量研究表明，酵母菌细胞膜的成 分与菌体耐酒精能力密切相关p ”。蜊此外，培养条件和培养基组成对酵母菌的酒精耐性也有 影响。 1 4 1 脂肪酸与酵母菌耐酒精能力的关系 许多实验表明，细胞膜的不饱和脂肪酸与乙醇发酵微生物的耐酒精性能和产酒精水平关系密 切【1 2 4 4 - 4 7 “删。b e a v e n 等人1 4 7 把乙醇加入到酿酒酵母细胞悬液中，浓度从o s 1 5 m o l l ，结 果导致细胞膜中c 1 8 ll 脂肪酸不断增加，而c i 自。脂肪酸不断下降，这依次导致膜流动性增加。 还有一些耐酒精酵母菌细胞本身在生长过程中就可以合成较多的长链不饱和脂肪酸，从而这 些酵母菌细胞能抗较高浓度的酒精。最近，池振明等人【砷】研究了产高浓度酒精酵母菌和酒精敏感 8 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 酶母菌的细胞膜组成，发现前者在分批培养过程中能合成较多的c l s i 脂肪酸，而且在高浓度乙醇 冲击( 乙醇浓度达到1 8 ( v v ) ) 过程中，死亡的速率明显比后者慢，这说明长链不饱和脂肪酸与 酵母菌耐高浓度酒精有密切的关系。o d i n 等人1 6 1 】利用3 7 c 热冲击处理或l o ( v v ) 7 , 醇冲击 处理酿造酵母菌，发现细胞的c 1 8 1 ，和c 1 6 f1 脂肪酸增加，而c 1 。o 脂肪酸在下降，同时这些酵母 菌可产生1 1 ( v l v ) 的乙醇。 在培养基中加入适量的脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸，这些脂肪酸很容易被酵母细胞吸收并 被组入细胞质膜和线粒体膜中，结果这些酵母细胞在酒精发酵过程中耐酒精能力有很大提高在 厌氧发酵过程中，酵母菌不饱和脂肪酸和固醇合成受到抑制，这些酵母菌对乙醇的抑制效应特别 敏感。如果给这些酵母菌补充含单一不饱和键的脂肪酸，那么它们对乙醇的抗性便增加，并且能 产更高浓度的乙醇。c r i s t i n as a n t o s 等人瞄】的研究证实了这个结论 虽然许多研究强调细胞膜不饱和脂肪酸含量或膜脂肪酸不饱和度在酵母菌耐酒精中起决定 作用【1 2 ，4 5 - 4 8 “。76 q ，然而，一些研究结果并不支持这种观点【。删。a g u i l c r a 等人嘲报道酒精刺 激并没有引起生长中酵母菌细胞膜不饱和脂肪酸含量增加，酒精敏感突变株和野生型菌株在膜脂 肪酸组成方面并无差别。d e lc a s t i l l oa g i i d o 【6 7 】报道耐酒精酵母菌株l a l 细胞可以合成c 1 2 io 脂肪 酸，所以他们认为当细胞中不饱和脂肪酸合成受到抑制，膜流动性下降时，产高浓度酒精酵母细 胞中的短链脂肪酸量的增加一样可以提高膜的流动性a m e b o r g 等人瞄】采用葡萄糖限制恒化连 续培养，实现在控制比生长速率的条件下单独考察酒精对生长中的酵母菌膜脂肪酸组成的影响， 结果发现，酒精刺激引起菌体膜饱和脂肪酸( 1 8 ：o ) 含量显著增加，而膜不饱和脂肪酸( 1 8 ：1 ) 含量几乎不变，菌体耐酒精能力与膜不饱和脂肪酸含量无关，相反，与膜长链饱和脂肪酸含量存 在密切关系h i l g e - r o t m a n n 等人1 7 0 】猜想细胞含有较多饱和脂肪酸，尤其是长链饱和脂肪酸有利 于酵母菌更快地从细胞中除去乙醇。大家都知道当把酵母细胞固定在某些不溶性载体上时可以提 高酵母菌的耐酒精能力。有趣的是与游离细胞相比，固定化细胞可以合成更多的饱和脂肪酸。 最近s w a n 等人岬1 在研究酵母菌膜脂肪酸组成和膜流动性后，发现膜脂肪酸，膜流动性和酵 母菌耐酒精之间并没有明显的相互关系。这些结果说明酵母菌耐酒精的机制是很复杂的，不同的 菌株其耐酒精的生化机制是不一样的；在不同条件下，酵母菌耐酒精的机制是很不相同的。 1 4 2 磷脂与酵母耐酒精能力的关系 j j n 等人p 1 1 报道通过添加蛋白磷脂复合物可明显提高酿酒酵母乙醇发酵反应器的生产能力。 有研究报道，人工加入磷脂酰胆碱( p c ) 可以提高清酒酵母细胞生长速率，酒精发酵活力和乙醇 耐受力然而，m i s h r a 等人【”】发现富含磷脂酰丝氨酸( p s ) 的酿酒酵母细胞对乙醇具有抗性。而 富含磷脂酰乙醇胺( p e ) 和p c 的酵母细胞对乙醇的抗性却较差但是，池振明等1 7 ”最近的研究 结果表明产高浓度酒精酵母菌在酒精发酵过程中其细胞中的p c 和p e 含量在不断的下降，而磷 脂酰肌醇( p i ) 含量在整个发酵期内基本保持不变。根据这种现象，他们推测p i 可能对酵母高产 酒精和耐高浓度酒精起一定的作用。a r n e b o r g 等人 6 5 1 根据他们的研究结果也建议p i 可能在酵母 细胞适应乙醇过程中起主要的作用 9 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 4 3 麦角固醇与酵母耐酒精能力的关系 酵母细胞中的麦角固醇被认为与耐酒精能力有关系，因为麦角固醇是酵母细胞圃醇类中最主 要的一种化合物，由于它的特殊化学结构，能增加细胞膜