（生态学专业论文）极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选.pdf

极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 摘要 海洋沉积物是营养较为丰富的微生物栖息地，蕴涵着丰富独特的海洋微生物 资源，特别是以能产生多样的次级代谢产物而著称的放线菌。研究海洋沉积放线 菌，不但可以发现新的放线菌资源，同时也可以发现新型活性产物，如抗病毒、 抗肿瘤的新抗生素、海洋生物毒素、酶类、抗心血管病化合物、酶类抑制剂、生 物功能材料等在医药、食品、化工、环保及其它各行业上具有重要价值的活性物 质。 本研究对两极地区8 份海洋沉积物进行放线菌的分离培养，通过1 6 sr d i n a 对 分离菌株进行鉴定，并对分离鉴定得到的放线菌株进行生态条件的研究和次生代 谢基因及抗菌活性的筛选。 通过稀释平板法和a r d r a 及1 6 sr d i n a 序列测定技术，从极地海洋8 份沉积 样品中共分离到2 2 个灿m r a 分型的8 5 株放线茵，分别属于赖氏菌属( k 必d 门妇) 、 盐细菌属( 勋砌f 6 口c 地厂f 册z ) 、节杆菌属( 彳删衲6 口c 纪，) 、红球菌属( r 办d 如c d c c 嬲) 、 气微菌属( 4 e 加所伽6 f 研z ) 和冰冻小杆菌属( 乃辔d ，f 6 口c 船厂f 甜肌) 等6 个属。其中 来自南极普里兹湾潮间带的z s 3 1 4 与最近菌株序列相似度低于9 7 ，可能为微杆 菌科( m i c r o b a c t e r i a c e a e ) 冰冻小杆菌属( 丹堙d ，f 6 口c 把，f 聊1 ) 属的一个新种。 各沉积物中放线菌多样性有所不同，其中从南极海洋沉积物中分离到的放线 菌以赖氏菌和红球菌为主，而北极海洋沉积放线菌中赖氏菌和盐细菌比较多。而 各沉积物中放线菌分离情况也有很大差别，分离自南极中山站海区潮间带样品z s 3 的放线菌株，无论是在数量还是多样性上，都是最多的，共分离到4 个属的3 8 株 放线菌，其放线菌分离率高达6 3 3 3 ，而从北极新奥尔松地区的沉积样品k s 6 中 放线菌分离情况最差，只分离到2 株放线菌，放线菌分离率只有2 0 。 采用不同培养基对沉积物进行放线菌分离培养的研究中发现，i s p 3 培养基、 第l 页 i s p 5 培养基和无机盐琼脂培养基，分离培养获得的菌落数目、种类都较多，经鉴 定后获得的放线菌株数量也较多，放线菌分离率比较高( 均大于6 0 ) ，是较为理 想的海洋沉积放线菌培养基。 所有测试放线菌株在海水培养基中的生长情况均优于去离子水培养基，最大 耐盐度达1 0 。其中盐细菌属的s 3 0 3 、s 3 0 4 、s 3 1 8 、s 3 2 6 、s 3 3 1 在不添加n a c l 的培养基中无法生长，表现出对盐的需求，是严格意义上的海洋放线菌。所有测 试菌株在o 均能生长，其中大多数最适生长温度在1 5 2 5 之间，为耐冷菌。最 适p h 在7 8 之间，在p h 4 下均不生长，多数在p h l o 下可以生长，为耐碱性菌株。 对放线菌株进行i 型、i i 型p k s ( 多聚酮合酶) 基因和n r p s ( 非核糖体肽合 成酶) 基因进行扩增，共筛选到7 2 株具有p k s 和或n i 冲s 基因的菌株。其中具 有i 型p k s 基因的放线菌株有1 1 株，具有i i 型p k s 基因的菌株有2 4 株，具有 n i 冲s 基因的菌株有6 8 株。有2 5 株阳性菌株同时含有两种基因，而从3 株红球菌 z s 3 5 0 、z s 3 5 2 、z s 3 6 0 中能扩增得到全部三种基因，这些菌株极有可能能产生具 有价值的代谢产物。以枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌 为指示菌对放线菌株进行抗菌活性筛选，结果未筛选到活性菌株，有必要优化实 验方法和条件对其活性进行进一步研究。 关键词：极地，海洋沉积物，放线菌，1 6 sr d n a ，抗菌活性 第1 l 页 i s o l a t ：i o na n d s c r e e n i n go fa c t i n o b a c t e r i af r o mp o l a r m a r i n es e d i m e n t s a b s t r a c t m 撕n es e d i m e n t sa r en u t r i e n t 莉c hm i c r o b i a lh a b i t a t sc o n t a j 血n ga b u l l d a l l tu l l i q u e m 撕n ei n j c r o o 瑁疵s m s ，e x p e c i a l l ya c t i n o b a u c t e r i aw i l i c ha r ef 锄o u sf o rt l l e i ra b i l i t i e st o p r o d u c ea l lk i n d so fc o m p o l u l d sw i t 量lb i o a c t i v i t i e s i nm i ss m d y ，a c t i n o b a c t e r i a ls 嘶i 1 1 sw e r ei s 0 1 a t e d 舶me i g h ts e d i m e n t so fp o l a r m a r i n ea n di d e n t i f i e db yt l l e 觚a l y s i so f 虹r aa n d16 sr d i n as e q u e n c e s t h e r e s e a r c ho fe c o l o g i c a lc o n d i t i o n sf o ra l li s o l a t e sh a sb e e nc a r r i e do u t ，a s 、e l la s s e c o n d a 叫m e t a b o l i t eg e n e 锄p l i f i c a t i o na 1 1 da i l t i b a c t e r i a la c t i v i t ) rs c r e e i l i n g u s i n gs p r e a d - p l a t et e c h i l i q u ea 1 1 d 1 e 觚a l y s i so f 创m r aa 1 1 d l6 sr d l 呵a s e q u e n c e s ，8 5a c t i n o b a c t e r i a ls t r a i n sw e r ei s o l a t e da i l di i l d e m i f i e da n dw e r es h o w nt 0 r 印r e s e n t s 把a j n sf b m6 g e n e r a ：三p 必d 刀拯、 姚易口c 如f z 牌、么，珐阳妣厂、 r 办d 如c d 螂、彳p 厂d 朋f c 厂d 6 f “聊a n d 乃t 妒，西口c 研豇删1 1 1a d d i t i o n ，t h ei s o l a c e sz s 3 14 f 如mt h ep r y d zb a 舅a n t a i t i c aw a ss u g g e s t e da san o v e l 乃堙汤口c 幼f 船? w i t h 也e 1 1 i g h e s t16 sr c i n as i m i l 撕t ) rl e s st 1 1 a i l9 7 t ot l l ec l o s e s ts t r a i n d i v e r s i t ya i l dq u a n t 时o fa c t i n o b a c t e r i a ls 仃a i l l si s 0 1 a t e d 丘o md i 疵r e n ts e d i m e n t s w e r ed i f r e r e m 三p 必d 刀砌a 1 1 dr 办d 如c c 淞w e r ep r e d o m i n a n ti 1 1a c t i i l o b a c t e d a ls 仃a i n s i s o l a t e df 如ma n t a r c t i cm 撕n es e d i m e n t s ，w k l e p f 居d 胛肠a n d s a z 加汤口c 纪厂f 甜所丘o m a r c t i cm 撕n es e d i m e m s 3 8a c t i n o b a c t 甜a 1s 仃a i n s 行o m4g e n e r ai s 0 1 a t e d 仔o mz s 3 c o l l e c t e d 舶ma n t a r c t i cz h o n g s h a ns t a t i o n ，a 1 1 dt 1 1 ei s 0 1 a t i o nr a t ew a su pt o6 3 3 3 h o 、耽v e r ，q u a l l t i t ) ，a n di s o l a t i o nr a t eo fa c t i o n o b a c t e r i a ls 仃a i n sf r o mk s 6c o l l e c t e df b m t 1 1 ea r c t i cr e g i o nw a s 也ew o r s t ，o n l y2a c t i n o b a c t 甜2 l ls t r a i n si s o l a t e da n di s o l a t i o nr a t e w a s0 n l y2 0 i nt l l es t l l d yo fi s o l a t i o no fa c t i n o b a c t e r i a ls t r a i n s 州md i 仃e r e n tc u l t u r em e d i u m ， t h er e s u l t ss h o w nt h a ti s p 3 ，i s p 5a n dm i n e r a la g a rm e d i u mw e r em o r es u i t a b l et o i s 0 1 a t em a r i n ea c t i n o b a c t e r i a ，b e c a u s e t h eq u a n t i t 斌，k i n d so f g e n e r aa 1 1 di s 0 1 a t i o nr a t e s 第l i i 页 o f 。a c t i n o b a c t e r i a ls n a i n s 士b mt h e s em e d l u mw e r eh i 曲 a 1 l t e s t e ds 乜阻i n sg r e wb e n e ro nm e d i ap r e p a r e dw i 也t l l en 删s e a 、a t e rt l l a no n m o s ep r e p a r e dw i t l lt 1 1 ed e i o n i z e dw a t e ra 1 1 d 孕e a t e s ts a l tc o n c e 舳r a t i o nw a s1o i i l a d d i t i o n ，f i v es t r a j n sh a db e e ns h o w nt oh a v ea 1 1o b l i g a t eg r o w mr e q u i r e m e n tf o rs a l t ， c o n f i n 】1 i n gt l l e s es 订a i 璐a sb o l l af i d em a r i n eo r g a n i s m s a nt e s t e ds t r a i n sc o u l dg r o wa t o a 1 1 dm o s to ft 1 1 e mw e r ep s y c h r 0 协) p h i cw h i c hg r e wb e t t e ra tt l l et e m p e r a t l l r e b e 帆e e n1 5 2 5 t 1 1 eo p t i m 啪p hw a s7 - 8 ，a n ds 仃a i n sc o u l dn o tg r o wa tp h 4b u t m o s to f t l l 锄c o u l dg r o wa tp h l o a m p l i f i c a t i o no fp k si ，i ia n dn r p s 寥n es l l 0 、w dt h a t1 ls t r a i n sc o n t a i n e d 锣p ei p k s g e n e ，2 5s t r a i n sc o n t a i n e dt ) ，p ei ip k sg e n e ，6 8s t 商n sc o n t a i n e dn i 冲sg e n e ，a j l d 2 5 咖i n sc o n t a i n e dt 、v 0g e n e ss i m u l t a l l e o u s l y i na d d i t i o n ，t h r e er 办。如c d c c 淞( z s 3 5 0 ， z s 3 5 2 ，z s 3 6 0 ) c o n t a i n e da l lt 1 1 et h r e eg e n e s t h e s ep o s i t i v es t r 缸1 i 1 ( e l yt op r o d u c e v a l u a b l ei 】= 1 e t a b o l i t e s h o w e v e r ，u s i n g 脚曩) ，幻c o c c “s 口z 嚣z s ，上沽c 办，配| 2 纽c d z f ，2 勋c f 刀“s s 甜6 川旭c r 口胛幽妇口场f c 口珊a si n d i c a t o r st ot e s tt 1 1 ea 1 1 t i m i c r o b i a la b i l i 够o ft h e a c t i n o b a c t e r i a ls 仃a i n s n oa c t i v es n a i n sw e r eo b t a i n e d k e y w o r d s ：p o l 瓯m 撕n es e d i m e n t s ，a c t i n o b a c t e r i a ，16 sr d n a ，a 1 1 t i m i c r o b i a l a c t i v i t i e s 第1 v 页 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 逵! 麴逡直墓丝益要挂型主明的：奎拦卫窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 秘慷 翩擀积， 签字日期彳年岁月矽日 签字日期 3 1 何月尹 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 l j l 一 刖吾 1 对极地海洋沉积放线菌研究的意义 今天，世界范围内的制药工业( 特别是在美国和日本) 继续把微生物作为寻找、 开发新药物产品最有用的资源。在世晃医药产品中，由微生物制备的产品起着举 足轻重的作用，但大家越来越意识到是否应该继续用常规的方法来研发药物。在 过去半个多世纪里，从陆地微生物中探查、筛选药物的工作一直没有停止过，几 乎对地球上所有地区的土壤微生物进行过筛选，人们已从众多生理活性方面检测 上百万的微生物菌株，这些微生物曾经是产生新颖化合物的丰富资源，它们中的 许多活性物质已经被开发利用，但由于目前陆地资源的不断开发，发现新代谢产 物的可能性日趋减少，不可能以过去的速度研发。通过区域性调查表明，近年来 发现的有活性物质中9 5 以上的被鉴定是过去已经发现过的；另一方面，由于抗 药性问题越来越严重，过去几十年曾一度被控制住的一些疾病又卷土重来，开始 迅速蔓延。因此，通过有效途径寻找新的抗菌药物被认为是今后若干年的紧迫任 务。自然界里，微生物的种类和数量是随着环境不同而明显改变的，尽管从微生 物次级代谢产物中发现新抗生素的黄金时代似乎己经过去，但微生物仍是产生生 物活性物质取之不竭的源泉( 陈代杰，1 9 9 9 ) 。近几年来，人们越来越关注到另一个 极有前景的药物新来源，这就是海洋微生物。 对于海洋微生物的定义，一般认为分离白海洋环境，其正常生长需要海水、 并可在寡营养、低温条件下生长的微生物可视为严格的海洋微生物，然而有些分 离自海洋的微生物的生长不一定需要海水，并可产生不同于陆生微生物的代谢物 ( 如溴代化合物抗生素) 或拥有某些特殊的生理性质( 如盐耐受性、液化琼脂等) ，也 被视为海洋微生物( o k a m i y ，1 9 8 6 ) 。尽管推测海洋中的许多微生物是由陆生环境 河水、污水、雨水或尘埃而来，但特殊的海洋环境赋予这些微生物以新的特性( 刘 志鸿，1 9 9 9 ) 。海洋环境十分独特，具有高压、低营养、低温( 特别是深海) 、特殊 的光照和局部的高温、高盐等等所谓生命的极限环境；海洋生物之间密切的生态 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 关系，可能使海洋微生物产生不同于陆地来源微生物的特殊产物，其化学结构丰 富多样、新颖。这些特殊产物大都具有陆生生物所不具有的很强的生理活性，具 有广阔的药用前景。 放线菌作为一类具有重要经济价值的微生物资源，不仅可以产生抗生素、酶 制剂和免疫调节剂等多种生物活性物质，而且在诸如芳烃类大分子化合物的降解 循环中也起着非常重要的作用，因而得到了微生物学家的普遍关注和广泛研究。 放线菌在自然界的分布极为广泛，存在于各种不同的自然生态环境里，其种 类繁多、代谢功能各异，是一类有着广泛实际用途的生物资源。放线菌所产生的 抗生素能有效地防治人类和牲畜的传染性疾病，特别是细菌性的病害以及农作物 的某些病害。陆生放线菌产生的抗生素占天然来源抗生素的三分之二以上，其中 包括许多己为人们所共知的在医药上有重要作用的抗生素( o k 锄i y ，1 9 8 8 ) ，因而 成为近代抗生素等制药工业的最重要的微生物资源之一。由于海洋环境的特殊性， 赋予生活在海洋中的放线菌在生理性状和遗传背景上以特殊性，据不完全统计， 自二十世纪七十年代东京微生物化学研究所从海洋放线菌c h a i l l i as p 分离到抗生 素s s 2 2 8 y 以来，从海洋放线菌中发现的结构新颖的具有强的生理活性的物质已 达1 0 0 多个( 林永成，2 0 0 3 ) 。这些研究结果更让我们有理由相信从海洋环境中分离 的放线菌可能有着陆生放线菌同样的价值，成为抗生素等制药工业的又一重要微 生物资源。表1 1 总结了近年来在海洋放线茵中发现的新型抗生素及其应用价值 ( 刘妍，2 0 0 5 ) 。 2 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 表1 1 海洋放线菌来源的生物活性物质 t a b l e l 1b i o a c t i v es u b s t a n c e sd e d v e df o mm a r i n ea c t i i l o b a c t e r i a 海洋放线菌活性物质作用 m 诂r d ”“ 螂_ p 。r 4l - 1 3 一a q 肥。0 9 2d e p s i p e p t i d e 咖o n l i 腿 抗g + ，抗肿瘤细胞- 抑制r n a 合成 m a r 舱i l a t eo f c d n 砌y 髓忙 8 p b 5 m 锄y d n 抗g ，抗疟霉虫 c t f n 口市q d 口m3 pi昏00208 抗g + ，抗肿瘤细媳 & r c 口仇) i c f is p n 量- 8 0u m u c h i m y c ；璐a 蛐db 抗c 凹d j 纽4 f 6 如口瑚 s t ”o m 弦f f “t 铆f m 口r 妇涮，i s t a m y d n 3抗细菌 5 l 陀p l o m ，c 亡3 ( s t f a i n # c n 卜3 ) l u i s o l 3aa n db 抗细菌 靠c 尚m 锄o j 户。旭s p d i a 硭p i n o m i d n抗细菌 m a r i n ea c t i n o m y c e t e ( m s t m a l 9 0 )l o m e a i i l i d eaa n db 抗细藩 & r f 户t o 研，c # jg 一 “is s 2 2 0丑p a s m o m y c i n sa c抗g + & r f o m j ，c 。5j 如粥f 曲s a 1 7 5 8 t i t e m i d d i n 抗u 2 l o 鼠性涝巴白盘病和m c 癌绷跑 s l r f o 研y f f jsp 1 7 3 i n s e c t i c i d a l 幻嘲抽t ； 杀虫 am a r i 豫& r r 户l o m j l f hs 仃a 油 c y c f o m a d na抗病毒药镑 & r c p f 口m ，c f 血( 埽d i a t eb 6 0 0 7 )c a p o l a c t e s抗癌细胞 毫m 矗r i n e5 t 仡i no fv 扫r l c o j “户o m a b 弘s o m i c i nc抗g + s 纪户 一w 钟f 抖l4 删 s f 以口研y f f l 4 耻 仉t 一c i f 础n j 瑚c r o c y c l i cl a c t 锄抗肿瘤细胞 c l f 斗口n 珥d “，口s p i s o i a t em 0 4 sc h a n d r a n a n i m y c i na ，b n dc抗细商 m a r i n es f 撑户f o 研，“，s “i s o l a t e 9 2 l h i m a l o m y d na 皇n db抗细茵 & r c p 嗍班t lsp t t a t eb 8 6 5 2五m y c m抗细商 af 弛r n es 船p l o 口u c f 押i l a t eb 7 0 6 4 c h l c o m y c i nb抗细菌 m 缸，o ”o s 加r 4l - 2 5 一e s 2 s 0 8眦c r o l 讨e ，i & 9 6 2 1 2对细胞p 3 8 8 有细胞毒性 u m d e n t i f i e dm a f i n e & 户f o m ) 州踔 5 。1 0 d i h y d r o p h e n c o m 蛐nm n h y i 尊t e r抗e f f 和b 5 幽f f i 堕苎q ! 旦坚之1 2 翌拦篮1 2 垂! ! ! ：1 2 d q 堡z 生q 2 垃绝酋 海洋沉积物是海洋历史的记录，在漫长的地质年代里，由陆地河流和大气输 入海洋的物质以及人类活动中落入海底的东西，包括软泥沙、灰尘、动植物的遗 骸、宇宙尘埃等统称为海洋沉积物。它既不同于淡水沉积物、土壤等陆地环境， 又与海水水体环境相对独立，沉积物中的微生物往往具有适应其特殊环境的形态 学、生理学上的特异性( 戴欣等，2 0 0 1 ) 。两极地区是地球上地理环境很特殊的区 域，由于极地独特的地理及气侯特征，形成了一个干燥、酷寒、强辐射、高盐度 的自然环境，极地海洋具有与温带、热带海洋不同的特点生活。在极地海洋沉积 物中的微生物，它们在相应生态系统的物质和能量转化及生物地球化学循环过程 中也起着特殊而极其重要的作用。极地海洋沉积物中的放线菌也必然具备了相应 独特的分子生物学机制和生理生化特性，可产生在其它环境下所不能产生的新型 生物活性物质和先导化合物( 如酶、抗生素等) ( 陈皓文，高爱国，2 0 0 5 ) 。因此， 对极地海洋沉积物中的放线菌分离培养、鉴定、抗菌活性等方面的研究，对进一 步了解、开发和利用该地区放线菌资源具有重要的作用。 2 海洋放线茵的研究概况 上世纪5 0 年代，报道的能被培养的海洋微生物不到5 ，这使得大家普遍认 为不能通过简单的方法培养海洋微生物；加上海洋微生物和医学微生物之间一直 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 缺乏紧密的联系，同时在海洋中寻找新药也具有一定的风险性，使得海洋微生物 资源开发停滞不前。经过多年研究，海洋微生物能被成功地培养( d a v i d s o n ，1 9 9 5 ； f e i l i e 也1 9 9 3 ；o k 锄i ，1 9 9 3 ) ；海洋微生物的多样性也可以被科学研究所利用， 新的项目在世界各地正不断出现。美国和日本对海洋沉积物及附着在海洋无脊椎 动物的微生物进行了大量研究，使得报道新颖产物和具有生物活性代谢物的论文 大幅度增长。海洋细菌和真菌是现在生物医药研究的热门，令人们感兴趣的新颖 代谢物的报道屡见不鲜。来自于海洋沉积物的细菌，在含盐的条件下生长并产生 新的抑菌和抗肿瘤化合物( p a t l l i r a n a ，1 9 9 2 ；t r i s e h m a l l ，1 9 9 4 ) 。类似地，从海洋 植物表面和无脊椎动物体内分离的真菌和细菌也产生具有药用前景的生物活性物 质，尤其是海洋真菌，似乎变成了研究的焦点( b e l o f s l ( ) ，1 9 9 8 ； c h e n g ，1 9 9 4 ； k a k e y a ，1 9 9 5 ；n u m a t a ，1 9 9 2 ；1 冰a h a s l l i ，1 9 9 5 ) 。深海和热泉环境作为海洋独 特的资源正越来越被对微生物感兴趣的人们所关注，在深海环境微生物的研究中 发现了专性嗜压微生物的存在，此类微生物的生长需要高达6 0 0 个大气压 ( y a y a l l o s ，1 9 9 5 ) ，这些高度适应的海洋微生物显示了巨大的未开发的生物药物资 源，来自于深海的细菌能产生一类特殊化合物，抑制大肠癌细胞的生长，阻止艾 滋病病毒h 的复制就是很好的例证。已报导的海洋微生物所产生的活性物质种 类主要包括抗生素、抗病毒和抗肿瘤化合物、海洋生物毒素、酶、抗心血管病化 合物、酶类抑制剂、生物功能材料等。 深海沉积物是营养较为丰富的微生物栖息地，占地球表面积的6 3 5 ( g r a y ， 2 0 0 2 ) 。最新研究表明，海底沉积物中的物种多样性要远大于海岸沉积物，几乎可 与热带雨林相媲美( p o o r e ，1 9 9 3 ) 。近年来，不断有人从世界各地的海洋沉积物中 分离出特殊的放线菌，其中一部分具有重要的医用价值。 j e n s e n 等( 1 9 9 1 ) 在巴哈马的1 5 个海岛近海沉积物中分离到2 8 9 个放线菌菌落， 其中2 8 3 个属于游动放线菌和链霉菌这两个属，并通过分析，建立了这两个属的 放线菌数目与采样深度之间的模型：即随着深度的增加，链霉菌的数目迅速下降而 游动放线菌的数目有所增加。见吉郎等( 1 9 9 5 ) 从日本t e n j i n 岛的近海区泥样中分离 到一株放线菌，气生菌丝呈浅蓝色，在p r i d h a n g o t t 1 i e b s 基础培养基里能利用葡 萄糖和肌醇作为唯一碳源。这个分离物已被鉴定为链霉菌的一个新种，曾尝试从 靠近该岛的沿海陆地去分离这种链霉菌都失败了，暗示该菌株的栖息地是岛屿特 4 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 异的。s a b 巧等( 2 0 0 4 ) 从埃及a b u q i r 湾的海底沉积物中分离到一株具有浅褐到亮黄 色气生菌丝、棕色基质茵丝的放线菌菌株s n g 4 9 1 ，经鉴定属于d c 砌唧西属的 个新的种。m i n c e r 等( 2 0 0 2 ) 从3 个不同的海洋沉积物系统中都分离到了m a r l 这种对多种病原菌显示出抗菌作用的新放线菌类群，并证明了该放线茵在海洋中 分布广泛。m a g a e y 等( 2 0 0 4 ) 用一种独特的选择性培养方法从新几内亚的所罗门 海海底沉积物中分离到了2 种新的放线菌，它们都属于朋z c 加朋d 聆d 印d ，口c 阳p 属， 并且对多种病原菌、肿瘤细胞和牛痘病毒的复制都具有抑制作用。 综上所述，面对日益枯竭的陆地资源，海洋是一个尚未真正开发的宝库，对 海洋微生物的深入研究和开发利用将为人类带来深远的影响。而海洋沉积放线菌 在海洋微生物中又有着其独特的地位，对海洋沉积放线茵的研究必将为抗生素等 制药工业开辟一条新的广阔途径。研究海洋沉积放线菌，不但可以发现新的放线 菌资源，同时也可以发现新型活性产物，如抗病毒、抗肿瘤的新抗生素、海洋生 物毒素、酶类、抗心血管病化合物、酶类抑制剂、生物功能材料等在医药、食品、 化工、环保及其它各行业上具有重要价值的活性物质。 3 放线菌研究方法与研究现状 3 1 海洋放线菌的分离培养 3 1 1 培养基的选择 到目前为止，人们对于海洋放线菌代谢活动和营养要求的了解的还远远不够。 在对可培养放线菌的研究中发现，选择性培养基的使用是非常重要的。张海涛等 ( 2 0 0 6 ) 利用8 种不同的培养基对海洋沉积物进行研究，结果以甘油为碳源，精氨酸 为氮源的m 2 培养基分离出7 个属中的6 个属，有意思的是，另外两个分离效果较 好的培养基m 4 、m 7 也都是以精氨酸为氮源的，有的培养基只分离出1 个属，有 的没有分离出任何菌株，显示了放线菌对培养基成分的依赖。 早期对马里亚纳海沟中海底沉积物的研究( p a t h o m 心e e ，2 0 0 6 ) 没有发现海洋 放线菌的存在，但是对位置很相近的海底沉积物的研究应用了2 0 种不同的选择性 培养基，从其中的4 种培养基中得到了可培养的海洋放线菌，5 0 的放线菌是从棉 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 子糖一组氨酸琼脂( r a m n o s e - h i s t i d i n ea g 岫培养基中分离出来的。 目前有研究表明营养简单的培养基成分更适宜分离出放线菌，使用营养简单 的培养基并延长培养时间可以得到很多的菌株，包括稀有的放线菌( j a l l s e n ，2 0 0 2 ) 。 在对关岛海底沉积物进行分离时，j e n s e n 等加入了海泥和海砂的洗脱液作为营养 源，获得了特别高比例的( 8 2 。9 1 ) 的海洋特有放线菌，他们还发现加入0 4 酵 母粉、l 淀粉和0 2 的蛋白胨的培养基分离出的海洋特有放线菌最少，而只加入 o 0 1 的酵母粉或蛋白胨的培养基和较低浓度的碳源分离出了较多的海洋放线菌， 这提示我们，利用低营养的培养基和加入海洋环境中的天然营养成分可以分离海 洋特有的放线菌。 3 1 2 样品处理方法 在对关岛附近的海洋沉积物的研究中，j e n s e n 等( 2 0 0 5 ) 使用了7 种方法处理沉 积物样品，发现将样品干燥过夜并压碎后用无菌的泡沫块直接在培养基平板上涂 压获得了最多种类的海洋放线菌，将干燥的样品稀释后进行热处理也筛选到了很 多新的海洋放线菌。他们筛选出的海洋放线菌有5 8 是需要海水进行生长的，并 且很多海洋放线菌是第一次发现的新属。 m a l d o n a d o 等( 2 0 0 5 ) 首次报道了海洋沉积物中不仅仅只有早期研究所显示的小 单胞菌属( 施c 阳历d 甩d 印d r 回、红球菌属( r 乃d 咖c d c c 埘和链霉菌属( 跏印幻缈p d 3 个 属，还存在着丰富的放线菌多样性，其研究中强调了样品处理方法的重要性。土 壤颗粒与放线菌的菌丝及孢子很好的分散，是获得多样性更高的放线菌的关键。 海洋放线菌分离时所使用的传统方法是将沉积物样品置于缓冲液中在摇床上摇动 一段时间以分散海泥样品，而m a l d o n a d o 等的研究表明，分散差速离心 ( d i s p e r s i o n a n dd i 虢r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o n ，d d c ) 方法是有效的处理海泥样品的方 法。d d c 法( h o p k i n s ，1 9 9 1 ) 利用胆酸钠作为弱的表面活性剂，还使用了适度的超 声处理，使土壤微粒更好地分散开，d d c 法处理海泥样品所得到的可培养放线菌 数量比用传统稀释涂布法多得多，是一种值得推广的样品处理方法( 王宏梅，2 0 0 7 ) 。 我国学者也成功的利用d d c 进行过土壤放线菌的分离，王黎明( 2 0 0 3 ) 在对大连地 区的海洋放线菌进行分离时也发现，用d d c 法处理样品比传统的稀释涂布法能获 得更多的分离菌株。 6 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 3 1 3 通过环境d n a 的分析设计选择培养基 通过对环境样品中提取的d n a 进行16 sr d n a 分析，可以得知微生物群落的 生物多样性，而且可以设计选择培养基。m a l d o n a d o 等( 2 0 0 5 ) 首次提出可以通过对 海洋环境d n a 的分析预见可能存在的物种，并设计特异的培养基进行分离。通过 不同科、属的兼并引物( s t a c h ，2 0 0 3 ) 对海底沉积物中提取的d n a 样品进行p c r 扩增，并设计了r h 、s m 3 、g 之s 、h a 、s c n 和m 36 种培养基，成功分离了 t h e m o m o n o s p o r a c e a e 科的么c ，加d ，z 口幽朋属和s t i e p t o s p o m g i a c e a e 科的 & 唧胁印d 阳馏f 删属两个新的属的菌株。设计有效的引物扩增新的海洋放线菌种属 对指导分离工作具有重要的意义。 3 1 4 未培养( u 1 1 c u l t u r a b l e ) 的海洋放线菌的培养 目前通过传统的培养方法分离到的微生物还只占很小的比例，如海水中的微 生物可培养的仅为o 0 0 1 如1 ，还存在着大量的放线菌资源未被开发( a m a l l i l ， 1 9 9 5 ) 。微生物不可培养的原因很多，比如分离培养基中采用的营养物质浓度过高、 营养物质种类或渗透压不合适、缺少生长因子、以及培养条件( 如温度、湿度等) 不合适等。另外生长及代谢缓慢的物种，由于不能与生长较快的物种竞争而未被 分离，或者因为无法形成肉眼可见的菌落而被忽略( 郭斌，2 0 0 6 ；叶姜瑜，2 0 0 6 ； 岳秀娟，2 0 0 6 ) 。 宏基因组技术可直接利用海洋环境中的基因资源而避开培养的限制，为海洋 环境微生物资源的开发、利用和产物的大规模生产提供了新的途径( l ix ，2 0 0 5 ) 。 然而，受到宿主选择、d n a 大片段包装等技术条件的限制，这种技术利用的只是 微生物基因组中很小的一部分基因资源。近年来发展起来的新的培养手段和策略 已经成功培养出了很多未曾被培养的微生物( f e r r 撕，2 0 0 5 ；c o n n o n ，2 0 0 2 ； k a e b e r l e i n ，2 0 0 2 ) 。可以预见，这些新的培养方法将使我们获得更加多样的海洋放 线茵。 3 2 放线菌的分类及鉴定 3 2 1 放线菌在微生物中的分类地位 对放线菌的认识是1 8 7 7 年哈尔兹从牛的颈肿病中发现放线菌以后开始的，最 7 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 初的命名来源于其菌丝呈放射状。2 0 世纪4 0 年代以前，仅报道了含义不很明确的 四五个属，并且主要是集中在对人和动物有致病性的放线菌属鲥”d 叼圮p ，p d 、诺 卡氏菌属( - d 耐勋) 和被认为是细菌的分枝杆菌似6 口c f p 厂f z ，朋) 。那时，大部分科 学工作者都把放线菌当做真菌。到2 0 世纪6 0 年代放线菌被确认是原核生物，与 细菌的关系极为密切，甚至可以包括在广义的细菌中( 刘志恒，2 0 0 4 ) 。目前，在白 杰氏系统细菌学手册( 阎逊初，1 9 9 2 ) 第四卷中，放线菌属于原核生物界，厚壁菌 门，放线菌纲，放线菌目( a c t i n o m y c e t a l e ) 。近年来，由于微生物生理生化学的迅 速发展，特别是分子生物学的渗透，微生物分类学出现由描述科学向试验科学转 化的强烈趋势，而现代技术在放线菌分类上的应用，加速了这一趋势并逐渐打破 了原来经典的描述分类，建立了如化学分类( c h 锄o t a x o n o l o g y ) ，数值分类( n 啪e r i c a l t a ) 【o n o l o g y ) ，分子分类( m o l e c u l a rt a ) 【o n o l o g y ) ，甚至多相分类( p 0 1 y p h a s et a x o n o m y ) 等新的标准，有力地推进了分类学的发展。 3 2 2 放线菌的经典分类 早期的放线菌分类是以形态特征和培养特征为主，以生理及生化特征为辅的， 这一时期的专著主要有1 9 6 1 年s a w a k s m a i l 和19 7 0 年n a 1 i i l l i k 0 0 关于放线 菌相关问题以及1 9 7 2 年国际链霉菌计划中的最后一批发表的研究结果 ( g o o d f e l l o w ，19 8 4 ；l e c h e v e a l i e r ，19 8 0 ；m i n n i l ( i n ，19 7 8 ) ，以及中科院微生物所 放线菌分类组的链霉菌鉴定手册。分类依据主要是： 3 2 2 1 形态特征 主要包括基内菌丝的是否断裂及发育程度，有无气生菌丝和孢子、孢囊、菌 核以及其它结构，此外还有孢子、孢子链、孢囊的大小、形状和数目等( d i e c z ，1 9 6 8 ) 。 3 2 2 2 培养特征 放线菌分类中基内菌丝和气生菌丝的颜色一向受到重视，中科院微生物所7 0 年代初编著的链霉菌鉴定手册一书中主要就是根据这二者分群的。6 0 年代后 期到7 0 年代初发表的国际链霉菌计划( i s p ) 试验结果也是以气生菌丝的颜色为主， 基内菌丝和可溶性色素的颜色为辅。新增加的色素对酸碱度是否敏感的特征，也 具有鉴别价值( 阮继生，1 9 9 0 ) 。 3 2 2 3 生化特征 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 如明胶液化、淀粉水解、纤维素分解或在其上生长、牛奶凝固和胨化、硝酸 盐还原等。在链霉菌属各个种的鉴定中，开始重视其是否能够在有机培养基内产 生黑色素。国际链霉菌计划规定用酪氨酸琼脂测定是否产生酪氨酸酶，用胰胨酵 母精培养液测定是否产生类黑色素，用蛋白陈酵母精铁琼脂测定是否产生硫化氢， 但这三者的反应时常并非总是一致的( 张继忠，1 9 9 0 ) 。另外，对于各种碳源的利用 逐渐成为了必不可少的测定项目。 3 2 2 4 生态条件 主要是腐生与寄生、好气与嫌气、中温与嗜热( 少数嗜低温) 以及对酸碱度( p h ) 的要求等。绝大部分放线菌都是腐生、好气、中温的，几种链霉菌能够寄生在植 物上，而弗兰克氏菌必须与高等植物共生。 3 2 3 放线菌的化学分类 因为不同放线菌其形态会在一定条件下表现出相似性，或者同一放线菌的形 态由于培养条件的不同会发生变化，而且传统的分类不能完全揭示微生物之间的 进化关系( p r e o b m 吐e n s k a y a ，1 9 6 8 ) 。基于以上理由，l e c h e v a l i e r 等学者从6 0 年代 开始，进行了放线菌化学分类的研究，提出了化学与形态特征相结合划分属的观 点，并于1 9 7 1 年发表主要依据细胞化学指征的分类系统，将放线菌分为9 个胞壁 类型和4 个糖型，提出一套细胞化学分类方法( g o o d f e l l o w ，1 9 8 4 ) ，其中有： 3 2 3 1 胞壁化学组分 放线茵的细胞壁是由多糖、肽聚糖胞壁酸等高分子物质组成，肽聚糖四肽键 上的第三位常含有特异的氨基酸，不同属、种放线菌的肽聚糖中该位置的氨基酸 种类也不同。 3 2 3 2 醌类 醌是细胞原生质膜的组成部分，在氧化磷酸化和电子传递中起重要作用。放 线菌的醌有泛醌( 辅酶q ) 和甲基萘醌，甲基萘醌的侧链由不同长度的异戊烯基单位 构成，不同的属的异戊烯基单位的长度及氢饱和度也是不同的( h 锄a o ，1 9 6 5 ； m i 衄i k i n ，1 9 8 5 ；g o o d f e l l o w ，1 9 8 1 ) 。 3 2 3 3 磷酸类酯 磷酸类酯是位于放线菌细胞膜上的极性类酯，不同属的放线菌其磷酸类酯的 9 极地海洋沉积放线菌分离培养与筛选 组成不同。 3 2 3 4 枝菌酸 枝菌酸及其它酯类是细胞膜的重要组成部分。从分子结构上看，枝菌酸属于 0 【侧链p 羟基脂肪酸，根据碳骨架上碳原子数的不同，可以鉴别棒状杆菌属、诺卡 氏菌属、分枝杆菌属( m i 衄憾n ，1 9 7 8 ) 。 3 2 3 5 脂肪酸 脂肪酸常以酯的形式存在于脂多糖、磷脂蛋白、磷壁酸酯中，各属的放线菌 中脂肪酸