（农产品加工及贮藏工程专业论文）番木瓜中木瓜蛋白酶的提取工艺研究.pdf

j 嬲嬲炒 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 万硪 日期：痧7 睥多月吕e l 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果， 知识产权归属海南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名： 日期：矿叼卫年易月吕日 导师签名：1 版么慰、 日期叫。年多月孑日 o 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论 文全文数据库发布章程，同意将本人的学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据 库中全文发布，并可按“章程 中规定享受相关权益。匾童途塞握童后进唇：旦圭生i 旦二生；旦三生筮查。 论文作者签名：刀赫 日期：秽d 年占月8 日 曰 q ，1】 j 月 幺，护 ：一 材殍 世肋r 名 7 签艮稚期 d y t l剥日 摘要 番木瓜( c a r i c ap a p a y a ) ，又名石瓜、万寿果、木瓜、乳瓜，原产于热带美洲及非洲， 后来引种到我国。木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜的根、 茎、叶和果实内，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白水解和 合成能力，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，不仅可以用来改善植物蛋白的营养价值或功 能性质，而且广泛应用于食品行业。本文将通过三种提取方法的比较研究，确定各提取 工艺的最佳参数以期获得具有理想酶活的木瓜蛋白粗酶，并研究亲和双水相法较传统工 艺提取木瓜蛋白酶的优劣性。 本课题首先探索了乙醇法提取番木瓜中木瓜蛋白酶的最适提取条件，实验结果表 明，在此提取工艺中，当l c y s 和e d t a 添加量分别为o 0 4m o l l 和0 0 0 2m o l l 时，其 对木瓜蛋白酶活性起到最佳保护作用，乙醇添浓度为6 5 ，体系p h 6 0 时能使酶活性达 到8 3 7 2 万单位m g 。 本课题还研究了用超滤法提取番木瓜中木瓜蛋白酶的最适提取条件，实验结果表 明，在此提取工艺中，l c y s 和e d t a 添加量分别为o 0 4m o l l 和0 0 0 2m o l l 时对木瓜 蛋白酶活性能起到最佳保护作用，操作压力、温度及时间分别为0 1 7 5 m p a 、6 0 及5r a i n 时能使酶活性达到9 3 9 8 万单位m g 。 此外，本课题还系统的研究了亲和双水相法提取番木瓜中木瓜粗蛋白酶的最适提取 条件，结果表明，不同分子量的聚乙二醇( p e g ) 在双水相成相浓度范围内对木瓜蛋白酶 活性影响不大；当相对p e g 分子量为6 0 0 ，磷酸盐浓度为1 6 ，体系p h 6 0 时能使酶活 性达到1 0 3 7 6 万单位m g 的最佳活性。同时，通过实验也考察了外加盐n a c l 、k b r 和 c a c l 2 对双水相形成区域的影响，在选定的实验条件下，进一步优化了双水相体系以期 获得较高酶活性回收率，结果表明，当p e g 平均分子量为6 0 0 ，浓度2 0 ，磷酸盐浓度 1 6 ，p h6 0 时，在室温条件下，木瓜蛋白酶分配系数达到3 2 6 ，酶活性回收率可高达 9 2 4 。 通过研究比较了三种提取工艺的同时也验证试验了反应时间与温度在酶活性测定 过程中对木瓜蛋白酶活性的影响，结果表明：木瓜蛋白酶在在3 0 - - 9 0 之间均有一定活 力，且在8 0 时木瓜蛋白酶活性达到最高，说明该酶对温度不敏感且具有耐高温的特性。 4 0 条件下，2 0r a i n 为最适反应时间。 本课题首次将传统工艺与双水相萃取法提取木瓜粗蛋白酶工艺的条件进行了研究 比较。统计结果表明：三种方法中，双水相法所提取的酶活性最高，有机溶剂一乙醇提 取法所提取的酶活性最差。同时，在提取过程中发现，有机溶剂提取蛋白酶过程中其溶 剂加料点不易掌握，过点易破坏蛋白质的氢键从而易引起变性失活。超滤法提取较有机 i 溶剂提取温和不易发生相变、失活等现象，但易在膜表面产生浓差极化现象，从而影响 提取效率和提取效果。双水相法提取番木瓜中粗蛋白酶，其操作过程相对较易掌握，分 相快且操作条件温和易于放大和进行连续性操作，同时双水相体系对蛋白质分子也有一 定的稳定作用，但双水相体系两相中影响分配行为的因素也比较复杂，其规律还有待进 一步研究。综上所述，双水相法较两种传统的提取方法相比，能显示出很强的优越性。 本项目获得海南省自然科学基金( 8 0 6 7 7 ) 和海南省教育厅高等学校研究项目 ( h j 2 0 0 6 5 6 ) 资助。 关键词：木瓜蛋白酶；提取；乙醇；超滤；双水相体系；酶活性 a b s t r a c t c a r i c ap a p a y ai sa l s ok n o w na sr o c km e l o n , p a w p a w , p a p a y a , a n dy o u n gm e l o n i tw a s n a t i v et oa f r i c aa n dt r o p i c a la m e r i c a , t h e ni tw a si n t r o d u c e dt oc h i n a p a p a i ni sak i n do f s h p r o t e a s e ，i tw i d e l ye x i s t si np a p a y ar o o t s ，s t e m s ，l e a v e sa n df r u i t s ，t h em i l ko fi m m a t u r e f r u i ti st h em o s ta b u n d a n t t h ep a p a i nh a ss t r o n gp r o t e i nh y d r o l y s i sa n ds y n t h e s i sa b i l i t y , a n d c o u l db em i l kc u r d , l i p o l y t i ca n db a c t e r i o l y t i c ，i ti sn o to n l yu s e dt oi m p r o v et h en u t r i t i o n a l v a l u eo rt h ef u n c t i o nn a t u r eo fp l a n tp r o t e i n s ，b u ta l s ow i d e l ya p p l i c a t e di nf o o da r e a i no r d e r t og e tt h eb e s tp r o c e s sc o n d i t i o nt oo b t a i nt h ei d e a le n z y m ea b o u tp a p a i n , i tu s e dt h r e ek i n d so f e x t r a c t i o nm e t h o d sf o re o m p a r a t i o n a n dt h e nt h es u p e r i o r i t ya n di n f e r i o r i t yw a sa l s o d i s c u s s e db e t w e e nt h ea q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o na n dt h et r a d i t i o n a lp r o c e s se x t r a c t i o n f i r s to fa l l ，t h i st o p i ct r i e dt of i n do u tt h em o s ts u i t a b l ee x t r a c t i o nc o n d i t i o nb yu s i n g e t h a n o lt oe x t r a c tp a p a i no fp a p a y a t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nt h ec o n t e n to f t h ev o l u m eo fl c y sa n d e d t aw a sr e s p e c t i v e l y0 0 4 m o l | la n d0 , 0 0 2 m o l | l 。i tp l a y e da o p t i m u mp r o t e c t i v ee f f e c t s t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o l6 5 a n dt h ep h6 0 c o u l de n a b l e e n z y m ea c t i v i t ya c h i e v e d8 3 7 2 1 0 5 u m g s e c o n d l y , t h i st o p i ca l s ot r i e dt of m do u tt h em o s ts u i t a b l ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n 丽t h u l t r a f i l t r a t i o nt oe x t r a c tp a p a i nf o r mp a p a y a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nt h ec o n t e n to ft h e v o l u m eo fl - c y sa n de d t aw a sr e s p e c t i v e l yo 0 4 m o l | la n do 0 0 2 m o l | l ，i tp l a y e da o p t i m u mp r o t e c t i v ee f f e c t s n ee n z y m ea c t i v i t yc o u l da c h i e v e d9 3 9 8 x10 u m gu n d e rt h e c o n d i t i o no ft h eo p e r a t ep r e s s u r e0 17 5 m p a 、t e m p e r a t u r e6 0 1 2a n de x p e r i m e n tt i m e5 m i n m o r e o v e r , w es y s t e m a t i c a l l ys t u d yt h em o s ts u i t a b l ee x t r a c t i o nc o n d i t i o nw i 吐la q u e o u s t w o p h a s ee x t r a c t i o nt o e x t r a c tp a p a i nf o r mp a p a y a t h er e s u l t ss h o w e dt h a td i f f e r e n t m o l e c u l a ro fp o l y e t h y l e n eg l y c o l ( p e g ) h a dl i t t l ee f f e c tt op a p a i na c t i v i t yi nc o n c e n t r a t i o n r a n g eo fa q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n w h e nt h em o l e c u l a ro f p e g6 0 0 ，t h ee n z y m ea c t i v i t y o fp a p a i nc o u l da c h i e v e d10 37 6xl0 5 u m gu n d e rt h ec o n d i t i o no ft h ec o n c e n t r a t i o no fp e g 2 0 ，p h o s p h a t e16 ，t h ep h o fa q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o ns y s t e m6 0 a tt h es a m et i m e ，w ea l s oi n v e s t i g a t e dt h ei m p a c tb ym e t a li o n s ，s u c ha sn a c l 、k ba n d c a ci2i na q u e o u st w o p h a s ee x t r a c t i o ns y s t e m t h e no p t i m i z e dt h ea q u e o u st w o - p h a s e e x t r a c t i o nt oo b t a i nh i g h e ra c t i v i t yr e c o v e r yt h a ta ts e l e c t e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tw h e np e gm o l e c u l a r6 0 0 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fp h o s p h a t e16 a n dt h e p ho fs y s t e m6 0 ，t h ep a r t i t i o nc o e f f i c i e n tko fs y s t e mc o u l da t t a i n e dt o3 2 6a n dt h ey i e l do f p a p a i nc o u l dr e a c h e d9 2 4 a tr o o mt e m p e r a t u r e w h i l ec o m p a r e dt ot h r e ed i f f e r e n te x t r a c t i o nc r a ftf r o mp a m i n , t h er e a c t i o nt i m ea n d t e m p e r a t u r ew a st e s t e dt oh a v ee f f e c t s 、析me n z y m ea c t i v i t yo fp a p a i n t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ee n z y m ea c t i v i t yo fp a p a i nc o u l do b t a i nw h e nt e m p e r a t u r ei n3 0 - - 。9 0 cr a n g e ，a n da t g o tt h eh i g h e s tv a l u e8 0 c i tc e r t i f i e dt h a tp a p a i ni n s e n s i t i v i t yw i t hh i 曲t e m p e r a t u r e u n d e r t h et e m p e r a t u r e4 0 ( 3 ，t h em o s ts u i t a b l er e a c t i o nt i m ew a s2 0 r n i n f o rt h e 触t i m e ，t h i sp a p e rc o m p a r e dt h et r a d i t i o n a lp r o c e s s 谢n lt h ea q u e o u s t w o p h a s ee x t r a c t i o nm e t h o do ne x t r a c t i o no fp a p a i no fp a p a p a y t h es t a t i s t i c a lr e s u l t s i n d i c a t e dt h a ti nt h r e em e t h o d s ，t h ee n z y m ea c t i v i t yw a st h eh i g h e s ti nt h ea q u e o u st w o - p h a s e e x t r a c t i o na n dt h ew o r s e s ti no r g a n i cs o l v e n t - e t h a n o le x t r a c t i o np r o c e s s w h i l ei nt h e e x t r a c t i o np r o c e s so fe t h a n o l ，i tw a sd i f f i c u l tt og r a s pt h ep o i n to fs o l v e n tf e e d i n g ，e x c e s s i v e a d d i n gw i l ld e s t r o y e dt h eh y d r o g e nb o n do fp r o t e i n , a n de a s yt oc a u s ed e n a t u r e da n d d e a c t i v a t i o n i tw a sm o r et e m p e r a t eb e t w e e nu l t r a f i l t r a t i o ne x t r a c t i o na n do r g a n i cs o l v e n t e x t r a c t i o n , a n dm o r ed i f f e rt oo c c u rc h a n g e so np h e n o m e n aa n dd e a c t i v a t i o n ，b u ti tc o u l d p r o d u c ec o n c e n t r a t i o np o l a r i z a t i o np h e n o m e n o ni nt h em e m b r a n es u r f a c e ，t h u st h ee x t r a c t i o n e f f i c i e n c ya n de f f e c t i o nw e r ei n f l u e n c e d t h ep r o c e s so fa q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o nw a s r e l a t i v e l ye a s yt o e x t r a c t e dp a p a i nf r o mp a p a y a , a n dt h ep h a s es p l i t t i n gq u i c k l ya n dt h e o p e r a t i n gc o n d i t i o nt e m p e r a t e ，s oi tc o u l de a s i l ye n l a r g e da n dc o n t i n u o u so p e r a t e d a n dt h e a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o ns y s t e mc o u l dm a k ep r o t e i nm e m b e rm o r es t e a d e r b u tt h e f a c t o r si nt h ea q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o ns y s t e mw h i c hw a sa f f e c t e dt h ea s s i g n m e n t b e h a v i o rw e r eq u i t ec o m p l e x ，a n df u r t h e rs t u d ya r ei nn e e d 丽mt h er u l e i ns u m m a r y ，t h e a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o nw a sb e t t e rt h a nt r a d i t i o ne x t r a c t i o nm e t h o d s t h ep r o j e c ti ss u b s i d i z e db yt h es c i e n c ea n dt e c h n o l o g yf u n do fh a i n a np r o v i n c e ( n 0 8 0 6 7 7 ) a n dt h es c i e n t i f i cr e s e a r c hf u n do fe d u c a t i o n d e p a r t m e n t ，h a i n a n p r o v i n c e ( h j 2 0 0 6 5 6 ) k e y w o r d ：p a p a i n ；e x t r a c t i o n ；e t h a n o l ；u l t r a f i l t r a t i o n ；a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o ns y s t e m ； b i o a c t i v i t y ； i v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 前言1 1 1 木瓜蛋白酶的研究概况1 1 2 木瓜蛋白酶的结构组成及性质。1 1 3 木瓜蛋白酶的应用研究概况2 1 3 1 肉类加工2 1 3 2 啤酒澄清2 1 3 3 饲料添加2 1 3 4 医学药用。3 1 3 5 化工产品。3 1 4 木瓜蛋白酶的提取方法研究4 1 4 1 传统工艺提取木瓜蛋白酶4 1 4 2 双水相萃取法提取木瓜蛋白酶5 1 5 本项目的主要研究内容及意义。8 2 乙醇提取木瓜蛋白酶的工艺研究9 2 1 材料与方法。9 2 1 1 实验材料9 2 1 2 实验试剂及生产单位9 2 1 3 实验仪器9 2 1 4 乙醇提取木瓜蛋白酶的工艺流程。9 2 1 5 操作步聚。l o 2 1 6 数据处理1 0 2 2 结果与分析1 0 2 2 1 酶活保护剂添加量对木瓜蛋白酶活性的影响1 0 2 2 2p h 对木瓜蛋白酶活性的影响1l 2 2 3 乙醇浓度对木瓜蛋白酶活性的影响1 2 v 2 2 4 正交实验考察乙醇提取木瓜蛋白酶的最佳工艺条件1 3 2 3 小结1 4 3 超滤法提取木瓜蛋白酶的工艺研究1 5 3 1 材料与方法1 5 3 1 1 实验材料l5 3 1 2 主要实验试剂及生产单位15 3 1 3 实验仪器15 3 1 4 超滤法提取木瓜蛋白酶的工艺流程1 5 3 1 5 实验步聚1 6 3 1 6 数据处理1 6 3 2 结果与分析1 6 3 2 1 预处理过程中酶活保护剂添加量对木瓜蛋白酶活性的影响1 6 3 2 2 预处理过程中p h 对木瓜蛋白酶活性的影响1 7 3 2 3 正交实验考察超滤法中木瓜蛋白酶预处理的最佳工艺条件1 8 3 2 4 正交试验结果与分析。18 3 2 5 操作压力对膜通量及木瓜蛋白酶活性的影响1 9 3 2 6 操作温度对膜通量及木瓜蛋白酶活性的影响2 0 3 2 7 操作时间对膜通量及木瓜蛋白酶活性的影响2 0 3 2 8 正交实验考察超滤法中各因素对木瓜蛋白酶活性的影响2 1 3 2 9 正交试验结果与分析2 1 3 3 小结一2 2 4 双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的工艺研究2 3 4 1 材料与方法2 3 4 1 1 实验材料2 3 4 1 2 实验试剂2 3 4 1 3 实验仪器2 3 4 1 4 双水相法提取木瓜蛋白酶的工艺流程2 3 4 1 5 操作步聚2 4 4 1 6 数据处理。2 4 4 2 结果与分析2 4 4 2 1 不同成相因素对木瓜蛋白酶的影响考察2 4 4 2 2 木瓜蛋白粗酶在p e g 磷酸盐双水相体系中的分配行为研究2 6 4 3 j 、结。31 5t 检验法分析3 2 6 木瓜蛋白酶活性测定3 3 6 1 材料与方法3 3 6 1 1 实验材料3 3 6 1 2 主要实验试剂及生产单位3 3 6 1 3 主要实验仪器3 3 6 1 4 紫外分光光度法测定木瓜蛋白酶活性3 3 6 2 结果与分析3 4 6 2 1 温度对木瓜蛋白酶活性的影响3 4 6 2 2 时间对木瓜蛋白酶酶活性的影响。3 5 6 2 3 金属离子对木瓜蛋白酶酶活性的影响3 6 6 3 小结。3 6 7 结论与展望3 7 7 1 结论。3 7 7 2 展望。3 7 参考文献3 9 致谢4 3 v i i 止工 1 刖 置 1 1 木瓜蛋白酶的研究概况 木瓜蛋白酶( e c 3 4 2 2 2 ) 广泛存在于番木瓜未成熟果实的乳汁中，它是由2 1 2 个氨基 酸残基组成的蛋白质单链，具有耐高温、活性强、稳定性好、蛋白质水解能力强等特征 1 1 1 。近年来，研究发现含有木瓜酶的药物，有抗癌、利胆、止痛、助消化等功效，还能 治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口等。木瓜酶可水解动植物蛋白，制成嫩肉粉、 饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、保健食品、酱油酿造发酵剂等。将木瓜蛋 白酶加入到含有蛋白质和油脂的化妆品中，具有独特的养颜美容、促进血液循环等功效， 可制成香皂、肥皂、洗涤剂、洗衣粉、洗手液等。用于饲料添加剂，可开发蛋白源，有 助于牲畜消化，加速生长，还可以作为蔬菜水果等高级复合肥料的添加剂。利用木瓜酶 制成脱毛剂来鞣制皮革，这种皮革毛孔细腻，皮纹光亮。在纺织工业还可用于处理羊毛、 蚕蛹脱胶、蚕丝精炼，得出的纺织品能达到手感柔软、舒适、抗收缩、抗张强度等效果 【2 】。 木瓜蛋白酶为纯天然产物，其开发前景越来越受到人们的重视，近年来木瓜蛋白酶 的分离提取方法及其应用又有了较大的进展，有些行业对木瓜蛋白酶的纯度、酶活力和 应用性的要求也越来越高，传统的木瓜蛋白酶分离方法已经不能满足社会的需求，因此， 研究木瓜蛋白酶的新型提取方法将具有广阔的应用前景。海南具有丰富的番木瓜资源， 本项目的研究具有鲜明的热带农产品资源利用与开发研究特色，不仅充分利用了海南丰 富的木瓜资源，同时，对增加其附加值也具有一定义意，进而对海南省农业农村发展也 起到了一定的促进作用。 1 2 木瓜蛋白酶的结构组成及性质 木瓜蛋白酶如同其它酶一样本质是蛋白质。自1 9 3 7 年b a l l s 等人制备出结晶状木瓜蛋 白酶后，时隔三十余年才由s m i t h 等人完成了木瓜蛋白酶分子结构的全部测定工作。结 果表明，木瓜蛋白酶分子是由2 1 2 个氨基酸残基组成的一条肽链，其2 5 位的半胱氨酸残 基与1 5 8 位的组氨酸残基正处于活性部位。分子中另外六个半胱氨酸残基形成了三对二 硫桥它们都不在活性部位。番木瓜浆汁的四种蛋白酶的活性中心都含有巯基，虽然巯基 容易被氧化而失去活性，但它们对环境条件却有很大的适应性。如在中性环境中一般的 酶溶液在6 0 7 0 c 时活性急剧下降，木瓜蛋白酶在p h 低于4 且温度上升时会迅速不可逆的 失活，但其它三种蛋白酶成份却十分稳定甚至在p h 2 的条件下继续存活。木瓜酶制剂由 于上述比较宽的温度和p h 适应性使它在工业上得到广泛的应用f 3 】。 木瓜蛋白酶与其它酶的一个显著的不同点在于它在8 m 尿素中仍保持完全的活性。 木瓜蛋白酶在有机溶剂中相对稳定，如在甲醇( o 5 0 ) 、7 , - - 醇( 0 - - 4 0 ) 、二氧六环( 0 - - 3 0 ) 1 等溶液中它的结构基本上不发生变化。木瓜蛋白酶分子上的许多基团都可以在一定条件 下发生化学反应。活性巯基可以与许多专一性试剂进行烷基化反应主。两个木瓜蛋白酶 分子中的活性巯基( - s i - i ) 被汞试剂作用后形成一s h g s 一桥，它又可被巯基激活剂复 原，这就是木瓜蛋白酶的可逆性抑制现象。如果活性巯基被激烈氧化成亚磺酸基，则酶 活不能复原这种抑制是不可逆的。木瓜蛋白酶的可逆性抑制在实践中应用很广。丝氨酸 蛋白酶的专一性抑制剂d f p 试剂可与木瓜蛋白酶分子中第1 2 3 位的酪氨酸残基发生反 应，但这种修饰并不会使木瓜蛋白酶的活性发生变化。木瓜蛋白酶的a 一氨基的一氨基 都可经化学修饰而保持其活性分子中多量酪氨酸残基也可经修饰而不降低活性。这样木 瓜蛋白酶分子便可通过这些残基的氨基与酚基与许多水不溶性物质相结合形成具有活 性的固定化木瓜蛋白酶，这是当前酶制剂工业发展的一个重要方向，从上述内容可以看 到，木瓜蛋白酶所具有的性质是与其分子结构密切关联的1 3 1 。 木瓜蛋白酶具有比较广泛的专一性，在对底物的分解测定中其主要切点是精氨酸和 赖氨酸残基的羧端。 1 3 木瓜蛋白酶的应用研究概况 1 3 1 肉类加工 在肉类j j n - r 中木瓜蛋白酶是最好的肉类嫩化剂，这是因为木瓜蛋白酶与其他蛋白酶 相比其热稳定性较高。一般蛋白酶在较低温度时即失活，而肉类结缔组织中胶原蛋白和 弹性蛋白在6 0 以上开始变性并变得容易被木瓜蛋白酶降解，且7 0 左右断裂最多。 木瓜蛋白酶对肉类在4 0 7 0 。c 温度范围内有最强的活性，而嫩化作用主要发生在当肉类 被烧煮温度逐渐升高而酶还没有完全失活这个阶段。所以在肉类嫩化中使用最多的是木 瓜蛋白酶【4 1 。 1 3 2 啤酒澄清 将木瓜蛋白酶用于对冷冻贮存过程中，木瓜蛋白酶能水解啤酒内蛋白质，部分水解 形成的复合物产生更多的多肽或氨基酸，保证啤酒在冷冻过程中的高清澈度，同时改善 啤酒口感及原有多肽和氨基酸的组成和比例有效地改良啤酒品质。据报道，对冷冻贮存 过程中的啤酒加入浓度为o 0 8m g 1 0 0m l 的木瓜蛋白酶时澄清效果最佳，其能提高游离 氨基酸含量，也可使浑浊度降低6 8 7 5 ，对游离氨基酸m 、v a l 和a r g 的增加分别为 8 2 倍、0 2 倍和1 1 倍1 5 l 。 1 3 3 饲料添加 木瓜蛋白酶添加到饲料中能促进蛋白质的吸收和利用，据报道，木瓜蛋白酶添加到 生长猪日粮中可增加生长猪的食欲，使其皮肤红润被毛光滑猪群生长整齐。另外南海水 2 产研究所还将木瓜蛋白酶应用于虾饲料中，实验结果表明，在虾饲料中添加木瓜蛋白酶 对虾的生长有促进效果可提高产量5 n 。说明在虾饲料中添加木瓜蛋白酶具有一定的效 果。 1 3 4 医学药用 木瓜蛋白酶在医药上的重要性越来越受到人们的重视。木瓜蛋白酶在医药上除了可 以帮助消化消除消化紊乱以及作为驱虫剂以外，还有以下的一些用途，木瓜蛋白酶可以 清除挫伤、切断伤、烫伤等各种皮肤表面的溃疡而对健康组织无影响。在冈比亚这些缺 乏药物的地方人们利用木瓜果肉中含的酶来治疗, j , j l 烧伤可以有效的除去腐烂组织而 防止烧伤皮肤的感染。仇凯1 7 】等研究了用木瓜蛋白酶制备抗人肝癌单克隆抗体f ( a b ) 2 及 f a b 片段其方法是用激活的木瓜蛋白酶分别在偏酸性和偏碱性条件下消化不同时间得到 f ( a b ) 2 和f a b 片段经实验可知用木瓜蛋白酶制备f ( a b ) 2 及f a b 片段操作简单实用性强且 其产率及活性均优于胃蛋白酶。此外木瓜蛋白酶还可以促进中药成分的有效煎出用于辅 助r h 血型的鉴定用于关节炎实验模型的建立还可用于肿瘤的辅助治疗将木瓜蛋白酶中 分离纯化得到的c h y o m o p a p a i n 可以用于治疗腰椎间盘突出症。 1 3 5 化工产品 叶启腾等1 8 】用木瓜蛋白酶配合以多元醇作保护剂、保湿剂制成含酶牙膏和含酶护肤 化妆品，利用该酶对死皮强烈清除分解而不伤及正常皮肤的特性达到使用者皮肤鲜嫩柔 和。若在护肤用品中加入以木瓜蛋白酶水解过的明胶、皮胶等，因为这类富含脯氨酶、 羟脯氨酸的蛋白质分解到平均相对分子量2 0 0 0 以下，使小分子多肽营养能直接通过皮 肤吸收而达到养颜的目的。特别是用木瓜蛋白酶制成的木瓜酶香皂是目前国内市场上非 常畅销的一种减肥香皂，它能增强和改善皮肤表皮细胞的新陈代谢，使皮肤具有良好的 弹性。同时由于木瓜蛋白酶只溶解丝胶，而对纤维蛋白全无作用所以能令丝织物等滑爽 柔软。 木瓜蛋白酶的用途很多在各个行业的应用也越来越受到重视，尤其在食品工业、医 药上尤显示其重要性，因此，对木瓜蛋白酶分离纯化技术进行深入研究提取高质量的木 瓜蛋白酶具有重要的实用价值。且人们还在不断发现开发其新途径，相信不久的将来它 将会更好地发挥作用造福于人。亲和双水相萃取技术分离提取的木瓜蛋白酶不仅产率 高、活性高、适应于绝大多数行业，特别是医药上的使用，而且分离过程经济、简单， 设备投资费用少，是值得探讨的一个全新的分离木瓜蛋白酶的新技术。 1 4 木瓜蛋白酶的提取方法研究 1 4 1 传统工艺提取木瓜蛋白酶 提取木瓜蛋白酶的传统方法主要有：超滤法、盐析法、有机溶剂法、亲和层析法等。 1 4 1 1 超滤法提取木瓜蛋白酶 膜是具有选择性分离功能的材料。利用膜的选择性分离实现料液不同组分的分离、 纯化、浓缩的过程称作膜分离。它与传统过滤的不同之处在于膜可以在分子范围内进行 分离，并且这是一种物理过程，不会发生相的变化也不需添加助剂。超滤在操作过程中 无相变化，不会改变产品的性能和活性，也不用添加任何化学药剂无需热处理，特别适 用于热敏性物质，对热不稳定性产品是安全的。超滤设备和工艺较其它分离方法简单耗 能低，滤膜可以反复多次使用，同时还具有处理量大，处理时间短，样品残留小，产品 收率高等优点。唐晓珍1 9 等研制的利用超滤技术提取生姜蛋白酶的新工艺( 海口立升饮料 公司提供的l s l 型科研超滤机) 产品品质好、纯度高、成本低。赵玉萍i l o l 等用无锡星达 膜技术发展公司提供的聚醚砜( p e s ) 为膜材料的超滤装置提纯溶菌酶( 截留分子量为 3 0 0 0 0 、操作压力为0 3 5 m p a 、温度为1 5 c ) 超滤进行1 5r a i n 后进行清洗，酶得率6 3 ， 纯度9 8 5 ，酶活1 6 8 3 1u m g 。超滤技术虽然广泛地应用于蛋白质的分离纯化但也有一 定的局限性，如果要分离的两种产品的分子量相差不到5 倍则无法用超滤进行分离，同 时，利用超滤也不能直接得到干粉制剂对于蛋白质溶液一般只能得到1 0 5 0 的浓度。 1 4 1 2 盐析法提取木瓜蛋白酶 盐析沉淀法是许多蛋白酶初步纯化阶段又一经常采用的方法。其原理为中性无机盐 离子在较低浓度时会增加蛋白质的溶解度，但当盐浓度增加到一定的程度时盐离子与蛋 白质表面具有相反电荷的离子基团结合使排斥力减弱而凝聚，同时，蛋白质表面的水化 膜被破坏而引起蛋白质的沉淀。盐析中常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸 钠、磷酸钾、氯化钾等。在酶的分离纯化中常用的是硫酸铵。原永洁【l l 】等用分段盐析法 分离酵母醇脱氢酶时，可以使纯化倍数得到更大的提高。由于高离子浓度对酶的活性有 很大的影响故盐析后需脱盐。盐析法的最大优点是作用比较温和，不易引起酶变性失活。 其缺点为沉淀物含有大量盐析剂，而且制品含有硫酸铵恶臭气味，不脱盐无法符合食品 级酶的要求。在实际应用中同有机溶剂沉淀一样往往不会只用单一饱和度的盐沉淀而是 采用k s 分段盐析的方法，即逐渐增加盐的离子浓度，逐一沉淀蛋白质的方法。 1 4 1 3 有机溶剂法提取木瓜蛋白酶 有机溶剂沉淀法具有分辨率高的特点，即一种蛋白质或其他溶质可以只在一个比较 窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。是蛋白酶初步纯化的常用方法。其原理为有机溶剂的加 4 入降低了溶液的介电常数，增加了蛋白质粒子间的作用力使粒子间静电引力增大而聚集 和沉淀。在有机溶剂沉淀法中所选用的溶剂必须是能与水相溶并且不与酶发生任何作用 的有机溶剂常用的有丙酮和乙醇。溶剂沉淀后不需要专门的方法去除沉淀剂，只需通过 自然挥发除去，必要时采用真空抽滤脱除。有机溶剂法的优点是分辨率高，溶剂易除去， 适于食品级和医药级酶或蛋白质提纯。程立忠1 1 2 l 等对不同用量丙酮对b 甘露聚糖酶提取 的影响的研究结果证明，丙酮沉淀法是非常有效实用的，相对于工业上普遍采用的盐析 法，丙酮很容易去除，不会带来过多的外来杂质，所得酶制剂适用范围广，工艺操作也 比较简单，控制一定的丙酮用量( 1 ：1 0 - 1 ：1 6 ) 可以得到高酶活力的固体酶制剂干粉， 其纯度和提取率都可以达到应用的要求。缺点是有机溶剂会破坏蛋白质的氢键易引起变 性失活，所以要特别注意