（材料学专业论文）氮源和磷源对spsc01时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本文在应用激光聚焦反射式颗粒测量系统( f o c u s e db e a mr e f l e c t a n c em e a s u r e m e l i t s y s t e m ，f b r m ) 在线检测和定量表征自絮凝酵母颗粒粒径分布的基础上，模拟工业发酵 条件，考察了培养基中磷酸盐添加量对s p s c 0 1 絮凝性能的影响。研究结果表明，玉米 糖化液培养基中磷酸盐添加量分别为0 、o 1 5 和3gl 。条件下，自絮凝颗粒酵母s p s c 0 1 均表现出一定程度的时程解絮现象，通过实验数据拟合，获得的s p s c 0 1 时程解絮的关 联方程分别为： d ，：2 2 1 5 f 害，_ 丫”，。一o s s m l ( 不添加磷酸盐的糖化液培养基) p 。5 7 。1 0 。2 。 ( 添加0 1 5g1 1 磷酸挠的糖化液培养基) e 。5 。”2 ( 添加3g1 。1 磷酸盐的糖化液培养基) 并预测s p s c 0 1 解絮的半衰期分别为8 2 天、4 4 天和4 6 天。 不同磷酸赫添加量条件下s p s c 0 1 时程解絮过程的有效因子t l s 和t 1 p 都接近1 0 ，表 明s p s c 0 1 时程解絮对发酵过程中糖消耗和滔精生成速率没有显著影晌。比较发酵罐内 生物量浓度与从发酵罐中溢流出来的发酵液中生物量浓度，表明平均8 0 以上的酵母细 胞都能在发酵罐内实现固定化。综合考虑磷源对酵母s p s c 0 1 解絮时程特征、细胞固定 化、乙醇发酵过程副产酵母自沉降分离性能及乙醇发酵性能的影响，推荐工业发酵培养 基中磷浓度应为o 2 5gl 一，对玉米糖化液，其外源磷酸盐添加量为0 1 5gl o 芷右。 通过添加不同无机n 浓度合成培养基的摇瓶实验，考察了无机n 对s p s c 0 1 絮凝能 力的影响。实验结果表明，培养基中添加0 - 2 8g l “无机n 可以满足酵母生长和絮凝的需 求，对工业培养基的调配有一定指导作用。更高的氮浓度对酵母生长表现出抑制效应， 但对酵母絮凝的不利影响并不显著，更低的氮浓度导致酵母絮凝能力的显著下降。 关键词：s p s c 0 1 ；时程解絮；磷源和氮源；乙醇发酵 、l、l； 羔m 羔舢 7 0 o 7 3 o q | = d d 氮源和磷源对s p s c 0 1 时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究 i m p a c to fna n dpo r lt h et i m e - - c o u r s eo fs p s c o 1 d e f l o c c u l a t i n ga n d e t h a n o lf e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c e s a b s tt a c t t h ef o c u s e dl a s e r b e a m r e f l e c t a n c em e a s u r e m e n t ( f b r m ) w a su s e di nt h eo n l i n e m o n i t o r i n go fy e a s tf l o c s i z e d i s t r i b u t i o nu n d e rc o n t n u o u se t h a n o lf e r m e n t a t i o n t h e t i m e r c o u r s eo ft h ef l o c c u l a t i n g d e - f l o c c u l a t i n go fa l li n d u s t r i a ls e l f - f l o c c u l a t i n gy e a s ts t r a i n s p s c 0l ，af u s a n tf r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ea n ds c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e w a s q u a n t i t a t i v e l yi n v e s t i g a t e df o rt h r e ei n d u s t r i a lm e d i as u p p l e m e n t e dw i t h0 ，0 15 ，3gi 。 p h o s p h a t e ，r e s p e c t i v e l y t h ed e f l o c c u l a t i n g o fy e a s tf l o c sw a so b s e r v e da se t h a n o l f e r m e n t a t i o ng o i n gt h r o u g h2 0 - 5 0d a y s a ne x p o n e n t i a lf u n c t i o nm o d e lw a sc o r r e l a t e dt o s i m u l a t et h i st i m e - c o u r s ed e f l o c c u l a t i n g 弘z ：邕) 。”矿”5 m 1 ( w i t h o u t e x t r ap h o s p h a t es u 阳，e m n ， p 一1 5 7 “n f o 15g1 1p h o s p h a t e s u p p l e m e n t e d ) e 一15 一2 2 f 3g1 1 p h o s p h a t es u p p l e m e n t e d ) t h eh a l g l i f eo fy e a s tf l o ed e f l o c c u l a t i n gw a sp r e d i c t e dt ob e8 2 ，4 4 ，4 6d a y s e f f e c t i v e f a c t o r s ，q sa n dl i p ，w e r ef u r t h e rc a l c u l a t e d ，a n di tw a sf o u n dt h a tb o t hr l sa n dq pw e r ec l o s et o 1 0 ，w h i c hi n d i c a t e st h ed e f l o c c u l a t i n go fs p s c 0 1d o e sn o te x e r ts i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo n g l u c o s eu p t a k ea n de t h a n o lf o r m a t i o n f u r t h e r m o r e ，t h ee f f e c to fd e f l o c c u l m i n go fs p s c 0 1o ny e a s tc e l li m m o b i l i z a t i o nw a s e v a l u a t e db yc o m p a r i n gt h eb i o m a s sc o n c e n t r a t i o ns u s p e n d e di nt h ee f f l u e n to v e r f l o w e df r o m f e r m e n t o rw i t ht h a tw i t h i nf e r m e n t o r t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si l l u s t r a t e dm o r et h a n8 0 y e a s tc e l l sw e r er e t a i n e da n di m m o b i l i z e dw i t h i nf e r m e n t e ra l t h o u g ht h em e a no fy e a s tf l o c s d e c r e a s e dt oa b o u t8 0p mf r o mi n i t i a l l ya b o u t1 3 0g r n t a k i n gi n t oa c c o u n ta l la b o v e - e f f e c t s a n de c o n o m i cb e n e f i t ，t h ec o n c e n t r a t i o no fp h o s p h o m si nt h em e d i u mi sr e c o m m e n d e dt ob e a b o u to 2 5gl i nt o t a l ，a n d0 15g1 1p h o s p h a t en e e d st ob es u p p l e m e n t e df o rt w o s t a g e e n z y m a t i ch y d r o l y s a t eo ft o mp o w d e ru s e df o re t h a n o lp r o d u c t i o ni ni n d u s t r y 拍 、ll、， 一m z 一啪 7 0 0 7 f f f f z z 大连理i 。大学硕士学位论文 f i n a l l y ，t h ei n f l u e n c eo fi n o r g a n i cn i t r o g e ni nd e f i n e dm e d i ao nf l o c c u l a t i n ga n dg r o w t h o fs p s c 0 1w a ss t u d i e db yf l a s kb a t c hf e r m e n t a t i o n s t h ee x p e r i m e n t a ld a t as h o w e dt h a to 2 8 g1 1n i t r o g e ns u p p l e m e n t a t i o nc o u l ds a t i s f yt h e b a s i cr e q u i r e m e n tf o rb o t hg r o w t ha n d f l o c c u l a t i n go f s p s c o i ，w h i c hp r o v i d e sag u i d e l i n ef o rf o r m u l a t i n gi n d u s t r i a lm e d i u m k e yw o r d s ：s p s c 0 1 ；t i m e - c o u r s e ；d e f l o c c u l a t i n g ；p h o s p h o r u sa n dn i t r o g e ns o u r c e ； e t h a n o lf e r m e n t a t i o n 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：。楚匙日期：鲨( - 7 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 作者签名 导师签名 棠椽 堑! 虱盎 革fr 11 大连理r 大学硕士学位论文 引言 石油资源的严重短缺、石油消费的快速增长及石油基产品，特别是机动车尾气排放 导致生态环境的不断恶化，严重影响社会和经济的可持续发展，这一问题在经济高速发 展的中国尤其突出。2 0 0 5 年，我国石油进口量达到1 3 6 亿吨，占国内石油全部消费量 的4 2 9 ，国际市场石油价格持续高价位，目前每桶原油价格在7 0 美元上下，使中国 蒙受了巨额经济损失。与此同时，中石油和中石化两大国有石油公司对中国未来油气资 源勘测和预测的分析表明，到2 0 2 0 年，我国石油产量可以维持在目前1 8 亿吨的水平， 而石油需求将达到6 0 亿吨，对进口石油的依赖程度将达到7 0 ，国家能源安全和经济 发展将受到严重影响。 以生物质资源为原料，发酵法生产的燃料乙醇，是可再生清洁能源，在国外已经有 几十年大规模使用的历史。我国政府在“十五”期间开始发展燃料乙醇产业，在吉林、 安徽、河南和黑龙江四省区试点建设了几套大型燃料乙醇生产装置。然而，现阶段以玉 米、小麦、薯类等淀粉质原料生产燃料乙醇，其成本还无法同汽油和柴油等成品油价格 相竞争，燃料乙醇生产在相当大程度上依赖国家财政的直接补贴，2 0 0 5 年，国家对燃料 乙醇生产的实际补贴高达1 8 5 0 元吨。因此，从开发燃料乙醇生产的原创性技术或重大 技术革新入手，最大限度降低现阶段燃料乙醇生产成本，对这一可再生清洁能源产业的 规模化健康发展，具有十分重要的意义。 在选育乙醇发酵性能优良且具有自絮凝特征酵母菌株基础上研究开发的自絮凝颗 粒酵母乙醇发酵新技术，2 0 0 3 年开始在国家燃料乙醇试点工程项目承担单位安徽丰原生 物化学股份有限公司( 丰原生化) 建立万吨级规模工业性试验装置，2 0 0 4 年投入运行， 装置实际运行的工艺技术指标和经济指标，均超过包括吉林燃料乙醇有限责任公司引进 奥地利v o g e l b u s c h 公司技术在内的国内外现有乙醇发酵技术的水平。目前，这一新 工艺技术已经在丰原生化承担的2 0 万吨年国家大型燃料乙醇装置建设中应用并从2 0 0 5 年底稳定运行至今。 虽然这一新的乙醇发酵技术已经在逐级放大取得数据和积累经验基础上，建立了2 0 万吨年燃料乙醇装置，无载体固定化酵母细胞反应器放大到了1 5 0 0 m 3 的容积规模，但 决定这一工程技术稳定性和可靠性的最重要因素s p s c o l 絮凝的时程特征及影响絮 凝时程特征的因素还没有被系统的考察过，工业装置运行存在潜在风险。在万吨级规模 中试装置运行中，曾观察到运行至3 0 天左右时，s p s c 0 1 酵母细胞出现解絮，但通过添 加营养盐，酵母的絮凝又逐渐恢复。 氮源和磷源对s p s c o i 时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究 本人所在课题组利用激光聚焦反射式测量系统开发出了能够用于大小不规则、形状 不均一、非刚性自絮凝细胞颗粒的在线检测的技术，建立了乙醇连续发酵过程中自絮凝 颗粒酵母s p s c 0 1 絮凝颗粒粒径分布的在线检测和定量表征方法，这些前期工作，为自 絮凝颗粒酵母s p s c 0 1 絮凝特性及其影响因素，以及相应的絮凝调控手段的研究奠定了 基础。 大连理：i i 大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 乙醇发酵工艺技术现状 1 11 传统乙醇发酵技术及国内外燃料乙醇产业现状 乙醇发酵的历史十分悠久，目前已经发展成为发酵工业领域规模最大的产业之一。 乙醇不仅可以直接或与汽油、柴油等成品油配混后作为燃料使用，而且一步脱水可以生 成乙烯，在石浊资源短缺，_ 丌发石油替代资源的社会需求日益迫切的今天，是可再生生 物质资源与现代石油化学工业联接的关键节点。 传统的乙醇发酵工艺一般使用游离酵母细胞( f r e ey e a s tc e l l s ) ，采用间歇( b a t c h ) 或连 续( c o n t i n u o u s ) 操作的模式，将糖质原料或液化糖化处理后的淀粉质原料发酵生成乙醇和 c 0 2 。问歇发酵的设备生产强度很低，达到一定生产规模所需发酵罐的总容积规模较大， 一般适宜于小规模乙醇发酵装置。连续发酵的特点是原料连续输入发酵罐，反应产物则 连续输出，一般情况下系统处于稳态或拟稳态，物料组成及工艺参数不随时涮变化或在 小范围内波动，大型乙醇发酵装置通常采用连续操作模式。由于乙醇发酵在动力学上呈 典型的产物抑制，为了获得尽可能高的发酵终点乙醇浓度，工业生产上通常采用多级发 酵罐串联的工艺方案，以减轻产物抑制效应。 目前乙醇发酵的原料主要是糖质原料和淀粉质原料。巴西2 0 0 4 年燃料乙醇产量达 到1 2 0 0 万吨，居世界第一位，生产原料为甘蔗，甘蔗加工量占全国甘蔗总产量的5 0 左右，不仅有效地规避了国际市场石油涨价的风险，而且极大促进了甘蔗种植业的发展； 美国以玉米为原料生产燃料乙醇，在国际市场石油价格上涨及政府鼓励性政策的双重推 动一f ，2 0 0 4 年燃料乙醇的产量也超过了1 0 0 0 万吨( 3 4 亿加仑) ，居世界第二位，与2 0 0 0 年全美燃料乙醇产量约4 7 0 万吨( 1 6 亿加仑) 相比，五年时阃内燃料乙醇产量增加了一 倍以上，是当前世界上燃料乙醇产业发展最快的国家。我国燃料乙醇产业现阶段的原料 定位是淀粉质原料，包括东北地区的玉米、中原地区的陈化小麦、长江中下游地区的早 籼稻等。 根据加工过程对原料前处理程度，乙醇发酵分为带渣发酵和清液发酵两条不同的工 艺路线。国内乙醇发酵行业，包括吉林燃料乙醇有限责任公司引进v o g e l b u s c h 公司 技术建设的第一套大型燃料乙醇装置，对原料进行简单前处理分离胚芽后，采用带渣发 酵的技术路线，而国外，特别是在美国，一般对原料玉米进行比较完全的前处理分离胚 芽、蛋白、纤维后，得到淀粉乳作为乙醇发酵的原料，同时副产酵母。 氮源和磷源对s p s c 0 1 时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究 11 2 固定化细胞及在乙醇发酵方面的应用 细胞培养和发酵呈自催化反应特征，通常情况下细胞密度越高，表观反应速率就越 高。生化反应工程理论指出一个连续培养或发酵体系处于恒化状态时，稀释速率一定等 于细胞比生长速率，生物反应器内的细胞浓度受细胞生长和洗出平衡调控 1j 。理论上， 细胞密度随着稀释速率的增加而减少，达到临界稀释速率时，所有细胞都将被洗出。因 此，游离细胞连续培养或发酵过程，难以获得很高的细胞密度。然而，通过使用合适的 支撑材料，细胞就可以被束缚而有效截留在反应器中，实现固定化。 1 9 5 9 年h a t t o r i 和f u r u s a k a 首次将ec o l i 吸附在树脂上实现了细胞固定化【2 】。随 后人们相继丌展了固定化活细胞或称为固定化增殖细胞用于微生物发酵的研究工作，目 前已有大量的研究工作发表，几乎覆盖了所有微生物发酵工艺，而且近年来还丌展了固 定化动植物细胞生产次级代谢产物的研究工作【3 】，其中固定化酵母细胞用于乙醇发酵的 研究工作，则是最丰富的。 同传统的游离酵母发酵工艺相比较，固定化增殖酵母细胞连续发酵工艺在技术上具 有如下特点； 固定化增殖酵母细胞可以在发酵罐中达到很高的浓度，般为3 0 - 4 0g ( d w ) l 一， 因而大大强化了乙醇发酵过程的表观发酵速率，相应提高了发酵罐的设备生产强度指 标，减少了设备总容积规模和发酵罐固定资产建设投资。 酵母细胞可以在发酵罐中长期连续使用，因此整个发酵过程可以省去传统乙醇 发酵工艺中的酵母种子培养过程。 然而，载体材料的使用随之带来了许多细胞生理、生态、工艺、工程和经济方面的 问题，主要体现在： 载体材料有时会对细胞产生生理毒性，因而影响目标代谢产物的生物合成。 载体固定化细胞的大规模制备过程复杂，不适宜于大规模工业化生产，而且容 易引起杂菌污染。 载体固定化细胞的传质性能较差，外部营养基质和内部代谢产物浓度梯度较大， 致使其整体活性较低，同时，生物反应器中流体流动的冲刷和代谢过程内部产生气体的 胀裂还会造成载体固定化细胞的破裂，影响其连续使用的寿命。 载体材料的使用和不断消耗带来了附加成本，使固定化细胞技术难以在乙醇发 酵这样的传统发酵工业中推广应用。 因此，载体固定化酵母细胞乙醇发酵技术虽然已有几十年的研究历史，却始终没有 在乙醇发酵工业中得到很好的应用。只有n a g a s h i m ae ta 1 在8 0 年代早期建立了应用固 定化细胞技术生产乙醇的中试车间，虽然装置连续运行超过4 0 0 0 小时，固定化酵母细 大连理工大学硕士学位论文 胞乙醇生产强度是游离酵母细胞的2 0 倍，但是这一技术的经济性还是无法与传统的乙 醇生产工艺相比。 1 2 无载体固定化酵母细胞乙醇连续发酵新技术 人们早已发现，某些微生物细胞具有自絮凝( s e l f - f l o c c u l a t i n g ) 形成颗粒的能力p j ，利 用这种细胞自絮凝形成的毫米尺度颗粒作为固定化细胞方法的无载体固定化细胞技术， 是近年来发展起来的新技术【2 j ，也是固定化细胞技术中全新的概念。与各种载体固定化 细胞技术相比，这种无载体固定化细胞技术具有非常突出的优点，主要体现在： 细胞的固定化方法非常简单，絮凝性菌株一般在摇瓶培养阶段就可以形成絮凝 颗粒，培养液澄清透明，然后絮凝细胞颗粒可以在生物反应器中逐级扩大培养，并实现 固定化，不产生细胞固定化过程的附加成本。 不使用细胞生长和代谢产物生物合成所需营养物质以外的其它任何物质，细胞 的生理和生态环境不受外来物质的干扰和影响，有利于目标代谢产物的顺利合成。 自絮凝细胞颗粒内部结构松散，颗粒内部表面能够不断自我更新，颗粒整体活 性非常好。 在生物反应器中一定的生理、生态、物理、化学和流体力学条件下，小颗粒的 絮凝和大颗粒的解离可以呈动态平衡，不存在载体固定化细胞的强度和寿命问题。 无载体固定化细胞技术的上述优点已经被学术界和工业界接受，认为是最具有产业 化应用前景的技术，特别是对乙醇这样大宗低值初级代谢产物的生产过程。2 0 0 5 年1 月，无载体固定化乙醇发酵新技术通过了国家教育部主持的鉴定，与会专家致认为该 技术成果总体上达到了国际先进水平，可为国家燃料乙醇产业提供技术支撑。 12 1 自絮凝菌株的选育 目的生产中所用的发酵性能优异菌株多数并不具备自絮凝性能。尽管筛选菌株的过 程通常要耗费大量的时间，这方面的工作仍在继续 4 ，5 j , 近年来已选育出一些具有自身 絮凝能力，且乙醇发酵性能良好的菌株，如葡萄汁酵母( s a c c h a r o m y c e su v a r u m ) 变异 株【6 j 、粟酒裂殖酵母( s c h i z o s a c c h r o m y c e s p o m b e ) 变异株fj 和运动发酵单胞菌( z v m o m o n a s m o b i l 扫) 变异株1 8 】等，并陆续开展了乙醇发酵的研究工作。随着现代生物化学及分子生 物学的研究进展【9 1 ”，已经逐步阐明了酵母细胞自絮凝的机理及调控酵母细胞自絮凝过 程的基因家族，更多发酵性能优良的菌株可望通过代谢工程技术被赋予自絮凝特征。 大连理工大学与中国科学院沈阳应用生态研究所合作i 使用原生质体融合技术将发 酵性能优良但不具备絮凝能力的酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e ac e r e v i s i a e ) 和具有自身絮凝 凝能力但乙醇发酵性能相对较差的粟酒裂殖酵母( s c h i z o s a c c h r o m y c e s p o m b e ) 进行属间 氮源和磷源对s p s c 0 1 时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究 原生质体融合，得到融合株s p s c 。靳艳等对s p s c 的性能进行了研究，证明融合株s p s c 既有良好发酵性能又具有强囱身絮凝特性i l 。 1 2 2 适宜于自絮凝颗粒酵母乙醇发酵反应器的开发 上世纪末期，国内外有关学者针对酵母的絮凝特性，开发了各种不同类型的生物反 应器系统，如：气升式反应器1 19 1 、单级填充床式反应器【6 ，2 n2 ”、带有沉降罐 2 2 】或不带沉 降罐( 2 3 】的二级填充床式反应器、c 0 2 驱动并带有c 0 2 分离或循环装置的悬浮床生物反应 器等 2 4 , 2 5 】。 1 2 3 自絮凝颗粒酵母乙醇发酵工艺的研究 乙醇连续发酵过程中酵母细胞生长和产物乙醇生成的动力学特征均为典型的产物 抑制型，连续发酵工艺宜采用反应器多釜串联的工艺方案。白风武等建立了单釜反应器 有效容积o 5m 3 、二级串联的生物反应装置，以淀粉糖化液为底物，在平均稀释速率为 0 1h 。1 的条件下，装置稳定运转一个月，终点发酵液中乙醇浓度8 0 8 5g l ，残糖浓度 低于5 0gl 。，设备平均生产强度8 4gl 。h 。【2 6 】。管斌等采用带有细胞循环的双罐系统， 通过提高反应器内菌体浓度，将乙醇生产强度提高到3 0 5gi 1h o 【z 7 j 。谢健等在单釜有效 容积为1 0m 3 的四釜并联气升环流悬浮床生物反应器系统中，以玉米为原料，双酶法制 糖，过滤得到清糖液作为底物，进行了连续发酵生产乙醇的研究。在稀释速率为0 1h 。 的条件下，终点发酵液中乙醇浓度为7 0 8 0g l ，残余还原糖和残余总糖分别为2 3g l 。和3 5g l ，反应器的设备生产强度达到7 89 1 。h “幽j 。 自絮凝细胞颗粒体系通常不允许原料残渣存在，因此应采用清液发酵工艺。与传统 的乙醇带渣发酵工艺相比，清液发酵不仅可以提高原料综合利用水平，而且可以回收乙 醇发酵过程副产的酵母，进行深加工。原料综合利用和副产酵母的回收，显著降低了发 酵液精馏后产生废糟液的c o d 浓度，为发酵废液的大比倒循环回用，清洁生产创造了 有利条件。李东侠等以玉米粉双酶法制备的糖化液为底物，使用自絮凝颗粒酵母，在有 效容积1 5l 小型悬浮床生物反应器中研究了不同乙醇精馏废液循环比条件下的连续发 酵工艺过程，并探讨了乙醇精馏废液“全循环”的可行性。研究结果表明：虽然产生了 比较强的副产物抑制效应，但该工艺能够稳定操作，为乙醇发酵行业彻底解决废液污染 问题提供了一条简便、可行的工艺路线【2 9 】。在此基础上。刘传斌等丌发了自絮凝酵母细 胞颗粒多釜串联乙醇连续发酵工艺。通过四个悬浮床生物反应器串联运行，发酵液精馏 废液“全循环”使用，控制平均发酵时间为2 0h ，使发酵液中的乙醇浓度达到9 6 6g l “【3 o j 。 大连理：r 大学硕士学位论文 2 0 0 4 年底，采用自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵新技术，在国家燃料乙醇试点建设单 位安徽丰原集团建立了万吨级规模的产业化示范工程装置，使这一无载体固定化细 胞技术在乙醇发酵领域率先实现了产业化。该工艺技术路线体现出以下特点： 在对原料进行前处理分离脂肪、蛋白、纤维等组分的基础上，液化糖化后得到 不含残渣的糖液，进行清液发酵，提高了原料综合利用程度； 在特殊设计的悬浮床生物反应器中，自絮凝颗粒酵母可以实现完全固定化，细 胞密度显著提高，平均发酵时间缩短，发酵罐设备生产强度相应提高； 原料的前处理及酵母细胞的完全固定化，使进入后续精馏系统的发酵液十分清 洁，精馏过程产生的废糟液c o d 可以由现有乙醇发酵工艺的3 0g l - t 5 0g l “降低到5g j j 8gi ，废糟液能够以较大比例在发酵系统中直接循环使用，实现清洁生产。 2 0 0 5 年末，无载体固定化细胞技术成功于年产2 0 吨大型燃料乙醇生产装置的建设 并实现稳定运行，主要技术指标和经济指标均优于国内外已有的乙醇发酵技术。 我国现有的乙醇发酵行业在原料前处理路线和发酵罐结构设计上与目前开发的白 絮凝颗粒酵母乙醇发酵体系有较大的差异，能否将这技术经济指标先进的发酵工艺应 用到现有乙醇发酵装置的技术改造中，提升其工艺技术水平，也是一个亟待解决的问题。 徐铁军等模拟现有乙醇发酵行业普遍采用的发酵罐结构，建立了一套由三级串联操作的 磁力搅拌发酵罐和一个种子罐组成的生物反应器系统，并研究了自絮凝颗粒酵母在浚系 统中的乙醇连续发酵过程【3 “。实验数据表明，自絮凝颗粒酵母在各发酵罐中呈部分固定 化状态；在稀释速率0 0 4 0h - 条件下，发酵系统呈一定的振荡行为，其他四个稀释速率 实验组均能够达到拟稳态。当稀释速率不超过0 0 3 3h 。时，流出来级发酵罐的发酵液中 乙醇浓度可以达到1 2 ( v ) 以上，残还原糖和残总糖分别在0 1 1 和o 3 5 ( w v ) 以 下。在稀释速率为o 0 3 3h - 1 时，计算发酵系统乙醇的设备生产强度指标为3 3 2gl 。h 。， 与游离酵母细胞传统乙醇发酵工艺相比，增加约一倍。 以酵母细胞自絮凝形成颗粒作为固定化方法的无载体固定化酵母细胞技术在乙醇 发酵领域逐步实现产业化的同时，对包括动力学在内的许多基础研究工作提出了新的要 求。实现动力学理论和模型指导下的工艺过程优化，流体力学理论和模型指导下的反应 器放大，整体上提升工程装置放大、设计和运行的技术水平，也是急需解决的问题。葛 旭萌等利用f b r m 系统建立了酵母絮凝颗粒在线表征的方法口”，并在此基础上采用机 械搅拌的方法使絮凝颗粒分散至接近游离细胞，在消除内扩散影响而不影响细胞生理与 代谢特征的条件下，研究了连续发酵过程中自絮凝颗粒酵母细胞生长和乙醇发酵的本征 动力学，建立了相应的数学模型【3 3 】，为进一步开展表观动力学研究工作，优化自絮凝颗 粒酵母生长和乙醇发酵工艺过程，奠定了良好基础。 氮源和磷源对s p s c o i 时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究 124 存在的问题 酵母细胞的絮凝是以酵母细胞自絮凝形成颗粒作为固定化方法的无载体固定化酵 母细胞乙醇发酵技术的核心和根本。酵母细胞能够自絮凝形成一定大小的颗粒是酵母细 胞可以被固定在生物反应器内，并利用自沉降原理替代常觌离心分离技术从酵母乳中回 收酵母的决定性因素。伴随着此技术成功实现产业化，酵母细胞在实际生产条件下能够 长期保持稳定的絮凝状态显得尤为重要。在万吨级中试装置运行当中观察到至3 0 天左 右时，酵母s p s c 0 1 絮凝颗粒出现严重解絮，之后通过添加营养盐，絮凝性性状又逐渐 恢复。所以如何控制酵母细胞絮凝性状，保持良好的乙醇发酵能力是这一技术殛需解决 的课题。 酵母絮凝已经被证明是非常复杂，难以调控的，受到遗传，生理和物理化学因素以 及发酵罐中流体力学和动力学等各方面的影响p ”“。而且各种因素对絮凝的影响具有明 显的菌种特异性【3 8 。迄今为止，已经有大量关于酵母，特别是酿酒酵母絮凝研究的报道， 但是存在较多的差异，甚至矛盾。对自絮凝酵母s p s c 0 1 絮凝性影晌因素的研究参考价 值有限。而且研究多集中于与酵母絮凝有关的细胞生理，遗传和絮凝蛋白方面【3 “，很 少关于工业生产条件下酵母絮凝特征的报道。建立在实际工业生产中有效的酵母细胞絮 凝调控策略无疑是保证无载体固定化细胞乙醇发酵技术可靠运行的关键，同时也为酵母 细胞絮凝的絮凝机理，絮凝相关代谢途径等理论研究奠定基础。 1 3 酵母絮凝机理 1 31 酵母絮凝 酵母发生聚集是一种广泛存在的现象。其中酵母的絮凝是产生酵母聚集现象的机理 之一。酵母絮凝最初被定义为酵母细胞粘附成团并迅速的从原来使之悬浮的培养基中沉 淀出来的一种现象。之后为了区别于另外两种导致酵母聚集的机理，有性聚集和链式 聚集，絮凝的定义被修正为酵母的种能粘附成团之后从培养基中沉淀出去，并能被乙 二胺四乙酸( e d t a ) 或专一的糖所分散的特性【4 2 】。 絮凝现象广泛存在于各种酵母里，包括s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ， s a c c h a r o m y c e s c n “s b e r g e n s i s ， s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ”瑚，k l u y v e r o m y c e sb u l g a r i c u s ”瑚k 1 m a r x i a n u s i 删和s a c c h a r o m y c o d e sl u d w i g i i l 45 1 。目前关于酿酒酵母s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 的絮凝机理以及絮凝相关的研究是最为深入和全面的。 大连理： ：大学硕士学位论文 l32 酵母细胞壁 由于研究发现，被分离出来的酵母细胞壁仍然保留了絮凝的能力，酵母的絮凝现象 始终被认为是酵母细胞壁本身固有的一种性质h 6 ，47 1 。关于酵母细胞壁的研究也相应展 丌。 以s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 为例，酵母细胞壁由四种生物大分子构成，分别是细胞 壁蛋白，p 1 ，6 - 葡聚糖，d l ，3 一葡聚糖和几丁质，并且在电镜下有明显的里外两层结构。 这四种大分子按照特定的机理共价的结合在一起，构成了细胞壁的交联结构【4 8 】。 l 、细胞壁蛋白：约占细胞壁干重的3 0 5 0 ，是甘露聚糖蛋白 4 训。在核糖体合成， 经高尔基体，由内质网分泌到细胞膜，释放后共价地结合到细胞壁的8 1 ，6 葡 聚糖上。到目前为止，主要有两种类型的蛋白被发现，分别是g p i 壁蛋白和p i r 壁蛋白。 2 、d 1 ，6 一葡聚糖：约占细胞壁干重的5 ，大约由1 4 0 个葡萄糖残基构成。k o l l a re t a 1 研究发现d l ，6 葡聚糖的还原来端通过一种还不是很清楚的连接类型与口】， 3 一葡聚糖的非还原来端结合在一起 5 0 】。 3 、b 1 ，3 - 葡聚糖：构成了细胞壁的大部分，大约由1 5 0 0 个葡萄糖残基构成直链部 分，并含有4 0 一5 0 个葡萄糖残基通过c 6 构成支链部分。d l ，3 一葡聚糖是细胞壁 的主要组成部分，并且和几丁质一起决定了细胞壁的形状和强度 4 9 1 。 4 、几丁质：在野生类型的酵母细胞中，约占细胞壁干重的1 2 1 4 叭。部分几丁质分 布在芽痕的周围 5 ”，也有研究表明部分几丁质以分散的形式分布于细胞壁的外 侧【5 4 】，其合成在细胞浆移动发生后的子细胞里开始并受到细胞周期的调控5 4 1 。 k o l l a re la l 的研究表明几丁质的还原末端与b 1 ，3 葡聚糖的菲还原末端通过8 l ， 4 键连接在一起1 5 ”。 磷酸盐以很小比例存在于酵母细胞壁的甘露聚糖中，但是这么低含量的磷酸赫却被 发现对细胞表面电荷有显著的影响1 5 “。最早m i l l 研究得出磷酸盐是被连接到特定的甘 露聚糖残基的c 6 上口”，之后由b a l l o u 发现磷酸盐通过形成1 - 6 键连接到甘露聚糖侧链 特定的残基上【5 ”。但同时发现存在于甘露聚糖中的磷酸盐含量在不同的菌株中有着很大 的差别【5 8 5 9 1 。 以上介绍的细胞壁中的组成物质都有可能参与到酵母细胞絮凝中连接键的形成。这 些物质的含量，构成，构象的变化都有可能导致酵母的絮凝特性的变化。 氮源和磷源对s p s c 0 1 时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究 1 3 3 酵母絮凝假说 1 3 3 1 钙桥假说 直到八十年代早期，这个假说是对细胞絮凝形成的各种解释中最被认同的。它是根 据酵母絮凝过程中对钙离子的专一性需求这一现象而最早由h a r r i s 推测，之后由m i l l 在1 9 6 4 年f 式提出的【6 ”。钙桥假说认为酵母细胞的絮凝是由培养基中钙离子与细胞表 面负电荷形成盐桥从而在细胞间建立连接形成的。并且根据絮凝可以在弱酸性p h 4 6 的 条件下发生，认为细胞表面的羧基，磷酸基和硫酸基是有可能和钙离子形成盐桥的，其 中根据考察到的p h 对细胞絮凝的影响，m i l l 认为羧基基团是最有可能与钙离子连接的 位点。同时根据絮凝颗粒在5 0 6 0 之间发生解絮，提出由糖中的氢原子与羟基形成的 氢键有稳定盐桥进而稳定絮凝的作用【6 “。支持这一假说的研究结果有如下三个： a 1 ，2 环氧丙烷通过酯化羧基不可逆地抑制絮凝。 b 在细胞生长稳定期发生的絮凝的起始伴随着细胞壁上羧基浓度的增加。 c 羧基被认为是与酵母细胞壁蛋白有密切联系的。由蛋白水解酶或者蛋白变性剂 导致的不可逆的解絮现象更加说明羧基与壁蛋白参与了细胞絮凝形成的过程。 研究表明，存在于细胞壁甘露聚糖中的磷酸二酯基团很可能是与钙离子结合的另，+ 个位点【6 0 ，6 2 , 矧。关于磷酯基团对酵母细胞絮凝影响的研究结果有着很大的差异，甚至得 到矛盾的结论。而且支持磷酸二酯基团与絮凝关联的证据得到了s t a f f o r d 和a s s i n d e r 的 质疑。因为他们观察到在强酸条件下由6 - 磷酸甘露糖对絮凝产生的抑制在p h 4 0 条件 下不能重复【56 1 。 到目前为止，并没有和钙桥假说完全不符合的研究结果。但是随着对酵母细胞絮凝 现象研究的深入，发现这个假说不能很好的解释一些新的现象。例如，糖的抑制作用， 有絮凝能力的菌株细胞与没有絮凝能力的菌株细胞间的共絮凝，以及在没有絮凝能力的 菌株细胞表面的也存在带有羧基基团的甘露聚糖。并且由于不能解释絮凝过程中细胞间 的专一性识别，钙桥假说受到了更强烈的质疑。与此同时，从化学角度分析钙桥假说， 其中关于钙离子作用的推断并不是很恰当。钙离子在溶液中的氨型电子云分布和原子核 所带的正电荷会导致钙离子并不能像钠离子那样结合两个位点。并且满足絮凝需要的钙 离子浓度低于1 0 0m m o ll ，如此微量的离子浓度是否能在溶液中形成稳定的二价盐桥 还需要详尽有力的证据说明。以上这些对钙桥假说的质疑导致了研究人员发展了另一个 能更好解释絮凝现象的假说类外源凝集素假说拉“。 大连理工大学硕士学位论文 1 3 3 2 类外源凝集素假说 在类外源凝集素假说中，细胞间絮凝被认为是由只存在于有絮凝能力的细胞表面的 特异性蛋白，即类外源凝集素与周围临近细胞表面的甘露聚糖的甘露糖残基的结合造成 的。而钙离子的作用是维持类外源凝集素的正确的构象。这种糖与蛋白的结合最早是由 t a y l o r 和o r t o n 根据甘露糖对絮凝的专一性抑制这一现象提出的m 】。之后在类外源凝集 素假说中由m i k ie ta 1 做出完整的解释【6 7 6 8 1 。以下观察到的研究结果都很好的支持了这 一假说： a e d d y 和r u d i n 发现导致细胞絮凝的细胞连接是由两个独立的部分组成的，命名 为粘附素和受体，并且认为菌株只能有粘附素或者受体，而不能两者同时具有。 b 粘附素只在有絮凝能力的细胞表面被发现，并且对蛋白酶和蛋白变性剂十分敏 感。所以粘附素被认为是一种细胞表面的蛋白。不久，n a g a r a j a n 和u m e s h k u m a r 找到了这种絮凝蛋白的抗体。 c 观察到的絮凝对钙离子的专一性要求以及被e d t a 分散的现象是与外源凝集素 的行为是一致的。早期研究表明，所有的外源凝集素都包含钙元素和锰元素。 x 射线研究进一步证明钙离子和锰离子位于外源凝集素的糖结台位点附近，对 维持外源凝集素的正确构象是必需的。 d 在絮凝细胞和不絮凝的细胞表面都存在受体。这种受体不是蛋白，但是对伴刀 豆球蛋白a 或高碘酸的抑制很敏感。这表明这种受体包含葡萄糖苷或者甘露 毗哺糖的残基。 e 甘露糖对絮凝的专一性抑制以及酿酒酵母细胞s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 不能和 被认为细胞壁缺少甘露聚糖的s c h i z o s a c c h a r o r n y c e sp o m b e 发生共聚都说明了絮 凝过程中有a 一甘露聚糖的参与。 在许多方面，类外源凝集素假说可以说是对钙桥假说的合理扩展。两者都承认细胞 壁蛋白和甘露聚糖在絮凝中的作用，同时也认为絮凝最终是由氢键造成的。两个假说最 大的不同是对钙离子作用的推断。在钙桥假说中，钙离子对絮凝起主导作用，而在类外 源凝集素假说中，钙离子只是能够维持类外源凝集素正确构象的一种离子口“。 1 3 3 _ 3 类外源凝集素的两种类型 通过对实验室和工业中大量的絮凝菌株的考察，发现了两大类有着不同絮凝特点的 酵母菌株【67 6 8 】。一类命名为f 1 0 1 型，这一类菌株都带有f l o l 基因，展示出组成式的絮 凝特点，即在生长的任何阶段都表现出絮凝特性；另一类命名为n e w f l o 型，这一类菌 株只在生长的稳定期和非限制性培养基中表现出絮凝特性；进一步考察这两种类型的菌 株发现它们专一性糖抑制的差异。f l o l 型表现出专一性的甘露糖抑制，而n e w f l o 型对 氮源和磷源对s p s c 0 1 时程解絮特征及酒精发酵性能影响的研究 甘露糖的专一性不那么明显，也可以被0 【葡萄糖苷或者甘露吡喃糖抑制。由于研究表明 外源凝集素的底物专一性甚至超过抗体，s 仃a t f o r de t a l 提出糖的专一性抑制的差异不是 程度的问题，而是表明有两种不同的类外源凝集素机理的酵母细胞絮凝存在。进而絮凝 菌株也被分为甘露糖敏感型( m s ) ，葡萄糖甘露糖敏感型( g m s ) 和甘露糖不敏感型 ( m i ) s 6 1 。 1 3 3 4 絮凝蛋白 随着类外源凝集素假说被广泛接受，关于细胞壁上的可能有类外源凝集素活性的蛋 白或由已经确定的絮凝基因表达的蛋白的研究也相应展开。这些研究的主要依据是絮凝 蛋白只存在于有絮凝能力的细胞的细胞壁上，而不存在于不絮凝的细胞表面。最早被发 现的只存在于有絮凝特性的细胞表面，而不絮凝的细胞不具有的是分子量为3 7k d a 的 一段肽链【6 9 】。之后h o l m b e r g 从絮凝酵母的细胞壁的碱