（遗传学专业论文）拟南芥雄性不育突变体tdf1的基因克隆和功能分析.pdf

上海师范大学硕士学位论文 摘要 绒毡层对拟南芥花药的发育起着至关重要的作用，同时也是花粉发育不可或 缺的组织。它分泌胼胝质酶降解四分体中的胼胝质从而释放小孢子，还能为花粉 外壁的形成提供营养物质。本论文报道了一个新的拟南芥绒毡层发育和功能的必 需基因t d f l ，它的突变能引起植株的雄性不育表型。细胞学观察发现t a f t 突变 体花药中含有两层绒毡层细胞，预示该基因可能调控绒毡层细胞的平周分裂，此 外，该突变体花药的体细胞层早期出现空泡化现象，小孢子提前降解。图位克隆 与遗传互补实验证明t d f i 基因就是m y b 家族转录因子a t m y b 3 5 ，它主要在花 药的减数分裂细胞、绒毡层和小孢子中高效表达。胼胝质染色、r t - p c r 和 r e a l t i m ep c r 分析表明t d f l 基因调控胼胝质酶相关基因a 6 和花粉外壁相关基 因m 跎，这预示着t d f l 基因参与小孢子的释放和花粉外壁形成的调控过程。此 外，结合实验数据和目前已报道的花药发育关键基因，绘制了一拟南芥绒毡层发 育与功能的基因调控网络，其中包含9 个绒毡层发育的必需调控基因。t d f l 基 因的功能分析及调控网络的深入研究对绒毡层发育的分子机制研究具有指导作 用。 关键词：拟南芥；花药发育；绒毡层发育；胼胝质壁；花粉外壁；基因调控网络 上海师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t t a p e t u mp l a y si m p o r t a n tr o l e si na n t h e rd e v e l o p m e n ta n di se s s e n t i a lf o rp o l l e n d e v e l o p m e n tb yp r o v i d i n ge n z y m e sf o rc a l l o s ed i s s o l u t i o n , a n dm a t e r i a l sf o rp o l l e n w a l lf o r m a t i o ni na r a b i d o p s i s i nt h i sp a p e r , w er e p o r t e dt h em o l e c u l a ra n a l y s i so fa d e f e c t i v eo ft a p e t u md e v e l o p m e n ta n d f u n c t i o n l ( t a f l ) m u t a n tw h i c hi se s s e n t i a lf o r t a p e t u md e v e l o p m e n ta n df u n c t i o n t h et d f lm u t a n ts h o w sac o m p l e t em a l es t e r i l e p h e n o t y p e i th a st w ol a y e r so f t a p e t a lc e l l ss u g g e s t i n gt h a tt d f in e g a t i v e l yr e g u l a t e s t a p e t a lp e r i c l i n a ld i v i s i o n t d f lw a si s o l a t e du s i n gam a p b a s e dc l o n i n gs t r a t e g ya n d w a sc o n f i r m e db yg e n e t i cc o m p l e m e n t a t i o n i te n c o d e sai u r 3m y bt r a n s c r i p t i o n f a c t o rp r e d o m i n a n t l yl o c a t e dt ot h en u c l e u s ，a n dh i g h l ye x p r e s s e si nm e i o c y t e s ， t a p e t u m , a n dm i c r o s p o r e si na n t h e rd e v e l o p m e n t c a l l o s es t a i n i n ga n dr t - p c r a n a l y s i ss u g g e s tt d f lr e g u l a t em i c r o s p o r e r e l e a s ef r o mt e t r a da n dp o l l e nw a l l f o r m a t i o n ap r e l i m i n a r yr e g u l a t i o nn e t w o r kc o n t a i n i n gn i n e r e g u l a t i o ng e n e s e s s e n t i a lf o rt a p e t u mf o r m a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n df u n c t i o nh a sb e e nc o n s t r u c t e dw i t h t d f lp l a y i n gak e yr o l ei nt h en e t w o r k t h ef u n c t i o ni n v e s t i g a t i o no ft d f la n dt h e g e n er e g u l a t i o nn e t w o r ko ft a p e t a ld e v e l o p m e n ti n t h i sw o r ks h o u l dp r o v i d ea r o a d m a pf o rt h ei n v e s t i g a t i o no fm o l e c u l a rm e c h a n i s mo ft a p e t a ld e v e l o p m e n ti n p l a n t k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ；a n t h e rd e v e l o p m e n t ；t a p e t u md e v e l o p m e n t ；c a l l o s ew a l l ； e x i n e ；g e n er e g u l a t i o nn e t w o r k 上海师范大学硕士学位论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：了知痞 日期： 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名： 随痞 剔硷归醐： 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 1 花药发育 第一章文献综述 雄蕊是种子植物产生花粉的器官，由花丝和花药两部分组成。位于花被的内 方或上方，在花托上呈轮状或螺旋状排列。在十字花科中，雄蕊数目为6 个，四 长两短，称为四强雄蕊。花丝是雄蕊基部的柄状部分，起支持和伸展花药的作用， 也具有运输水分与营养物质的功能。花药是雄蕊中最重要的组成部分，常以药隔 分成两个药室，每一药室具1 个或2 个花粉囊。花粉囊是产生花粉的地方。花药 的壁由孢子体细胞包括表皮层、内表皮层、中间层和绒毡层构成。绒毡层为花粉 囊周围的特殊细胞层，具双核或多核结构，细胞内含较多的r n a 和蛋白质，并 有油脂和类胡萝b 素等营养物质，具有供应花粉粒发育所需养料的作用。花粉成 熟时，花粉囊自行开裂，散出花粉。 o o l d b e r g 等以烟草为材料，详细描述了花药发育的过程( g o l d b e r ge ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 花药发育分为两个主要的阶段( 图1 1 ) ，在第一阶段，花药的形态开始建成，各 层细胞组织开始分化，小孢子母细胞开始减数分裂，到第一阶段结束时，花粉囊 中各层细胞已经分化完成，小孢子母细胞完成了减数分裂形成四分体。在第二阶 段中，花药增大，花丝增长，绒毡层等特异组织退化降解，花粉经过2 次有丝分 裂逐渐发育形成三核花粉粒，最后花粉囊破裂，花粉释放( 图1 - 1 ) 。花药形成和 花粉释放的发育过程受严格的时间调控( k o l t u n o wc ta 1 ，1 9 9 0 ；s c o t te ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 花药中细胞的分化以及开裂与花苞的大小相关，有精确的时间顺序。上世纪9 0 年代对花药细胞分化，组织降解，特异表达基因的研究，在分子和遗传水平上都 有很大的突破( g a s s e r , 1 9 9 1 ；m c c o r m i c k , 1 9 9 3 ，2 0 0 4 ；s c o t te ta 1 。1 9 9 1 ；k o l t u n o w e ta 1 ，1 9 9 0 ；d a w ea n df r e e l i n g ，1 9 9 2 ；a a r t se ta 1 ，1 9 9 3 ；p r e u s se ta 1 ，1 9 9 3 ；g o l d b e r g e ta l 。1 9 9 3 ) 。 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 图1 - i ：花药发育主要阶段 扫描电镜以及光镜下烟草花药原基与花药横切面的示意图( k o l t u n o we ta 1 ， 1 9 9 0 ：d r e w se ta 1 ，1 9 9 2 ) c ，连接细胞；c c c ，圆形细胞簇；e ，表皮层； e n ，内表皮层：p g ，花粉粒；p s ，花粉囊；s t ：裂口细胞；t ，绒毡层；t d ，四 分体：v ：导管细胞 在拟南芥中已经详细研究了花药的形态发生，根据花药的细胞学切片的光镜 观察结果将其从雄蕊原基发生到花药开裂脱落详细地分为1 5 个时期( s a n d e r se t a 1 ，1 9 9 9 ) 。在1 4 期中，花药原基开始细胞分裂形成各层组织，逐渐形成成熟 花药的腔、壁、连接细胞和导管区域( 图1 2 ) 。第5 期，具有四角结构的花药原 基孢子体细胞逐渐分化形成了内壁层、中间层、绒毡层和小孢子母细胞。小孢子 母细胞经过第5 7 期的减数分裂形成含有单倍体小孢子的四分体( 图1 3s t a g e 7 ) 。 四分体外包裹有一层厚厚的胼胝质层。小孢子在第八期由于胼胝质酶复合体降解 胼胝质层的作用从四分体释放出来，并且在第9 1 2 期经过两次有丝分裂形成三 核的花粉粒( 图1 2 ) 。随着花粉发育花药也不断增大，部分花药特异组织降解， 在第1 2 1 3 期裂口细胞破裂后形成了两室的花药( 图1 2 ) 。在花粉释放后，花药 逐渐衰老并脱落。( 图1 2s t a g e l 4 a c ) 。表1 1 列出了发生在每一个过程中发生的 关键步骤和存在的细胞和组织，以及花、花药、花粉的发育时期的分类( r e g a n a n d m o f f a u1 9 9 0 ；s m y t he ta 1 1 9 9 0 ；b o w m a ne la 1 1 9 9 1 ) 。 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 图卜2 拟南芥花药发育的1 4 个时期 a t , a r c h e s p o r i a lc e l l ；c ，c o n n e c t i v e ；e ，e p i d e r m i s ；e n ，e n d o t h e c i u m 玉l ，l 2 ，a n dl 3 ，t h et h r e e c e l l - l a y e r si ns t a m e np r i m o r d i a ；m c , m e i o t i cc e l l ；m l ，m i d d l el a y e r ；m m c , m i c r o s p o r em o t h e r c e l l s ；m s p , m i c r o s p o r e s ；j 。p ，p r i m a r yp a r i e t a ll a y e r ；2 0 p ，s e c o n d a r yp a r i e t a lc e l ll a y e r s ；l * s p p r i m a r ys p o r o g e n o u sl a y e r ；s p , s p o r o g e n o u sc e l l s ；s t r ，s t o m i u mr e g i o n ；lt a p e t u m ；t a r s ，t e t r a d s ； kv a s c u l a rr e g i o n f b ，f i b r o u sb a n d s ；m s p , m i c r o s p o r e s ；p g ，p o l l e ng r a i n s ；s m ，s e p t u m ；研， s t o m i u m ；s t r , s t o m i u mr e g i o n ；ft a p e t u m ； 4 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 表1 - 1 ：花药发育的关键步骤、存在的细胞和组织 a ：a r ，a r c h e s p o r i a l ；c 。c o n n e c t i v e ；e ，e p i d e r m i s ；e n ，e n d o t h e c i u m ；l 1 ，l 2 ，a n dl 3 ，t h et h r e ec e l l l a y e r so ft h es l a m e np f i m o r d i a ；m c ，；m e i o c y t e ；m l ，m i d d l el a y e r ；m m c ，m i c m s p o r em o t h e r c e l l ；m s p ，m i c r o s p o r e ；2 0 p ，s e c o n d a r yp a r i e t a ll a y e r ；p g ，p o l l e ng r a i n s ；s m ，s e p t u m ；s p ， 印o r o g e n o u sc e l l s ；s t ，s t o m i u m ；t ，t a p e t u m ；t d s ，t e t m d s ；v ，v a s c u l a r b ：f l o w e rd e v e l o p m e n ts t a g e st a k e nf r o ms m y t he ta 1 ( 1 9 9 0 ) a n db o w m a n “a 1 ( 1 9 9 1 ) c ：p o l l e nd e v e l o p m e n ts t a g e st a k e nf r o mr e g a na n dm o f f a rr 1 9 9 0 ) 5 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 2 绒毡层 2 1 绒毡层的发育 作为一种独特的分泌细胞绒毡层，在有花植物的花粉发育过程中起着至 关重要的作用。绒毡层是花药壁的最内层，它的形成需要雄蕊原基的l 2 和l 3 层 的共同参与，主要来源于l 2 层的孢原细胞系和l 3 层的连接组织( e s a u ，1 9 7 7 ) 。 在花粉母细胞的减数分裂前期。缄毡层细胞进行核内有丝分裂，形成双核的、缺 少初生壁的极性分泌细胞( b e d i n g e r ，1 9 9 2 ) ，其中充满了核糖体、线粒体、内质 网、高尔基体等等，且在原生质膜的向药室面上分布着许多分泌小泡。在发育早 期绒毡层细胞之间彼此通过细胞质桥连接起来。 从绒毡层后期发育的特点看，可分为两种：一种是分泌型腺质绒毡层，发育 后期的绒毡层可能仍与花粉壁保持着联系，维持在原来的位置上，壁宿存，通过 细胞内切向面释放物质；另一种是变形绒毡层，绒毡层细胞较早地发生壁的破坏， 原生质体融合形成合胞体并侵入药室，将发育的小孢子包裹起来( b e d i n g e r ， 1 9 9 2 ) 。在被子植物中，分泌型腺质绒毡层更为常见。 绒毡层在花粉发育过程中起着重要的作用。例如在减数分裂过程中，绒毡层 细胞核进行特殊的分裂形成两个或更多核，并具有极性分泌特征的细胞。在花粉 发育过程中绒毡层细胞和小孢于是互相依赖的。伴随着小孢子的发育、花粉的成 熟，绒毡层细胞经历一个逐渐解体的过程，细胞解体后释放一些形成花粉壁的脂 类成分( p i f f a n e l l ie ta l ，1 9 9 8 ) ，或者构成含油层的亲水和疏水物质( p a p i n i ， 1 9 9 0 ) 。p a p i n i 等( 1 9 9 9 ) 对l o b i v i ar a u s c h i l 和t i l l a n d s i aa l b i d a 的小孢子 发育过程中绒毡层细胞的超微结构进行了研究，发现它是一种典型的细胞程序化 死亡( p c d ) 。 2 2 绒毡层的功能 绒毡层的分泌作用对花粉的发育是必不可缺的，它的功能主要分成三类： ( 1 ) 提供营养。绒毡层可以阶段特异性地合成蛋白质、碳水化合物等物质， 以分泌小泡的形式被极性转运至绒毡层的向药室面，并分泌到药室中以提供母细 6 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 胞减数分裂和小孢子发育所需的营养成分( m a s c a r e n h a s ，1 9 9 0 ) 。研究表明，绒毡 层与简单的营养物质的动员与合成有关，为花粉发育提供一个必需的物质条件， 而不是提供花粉分化过程中的任何关键的形态发生成分。 ( 2 ) 分泌胼胝质酶。当小孢子母细胞完成减数分裂后。绒毡层适时地分泌胼 胝质酶复合体以分解包裹四分体的胼胝质壁，释放小孢子( s t e i g l i t z ，1 9 7 7 ) 。胼胝 质酶合成与分泌的时间特异性，对花粉的正常发育具有决定性作用。 ( 3 ) 参与花粉外壁和花粉包被的合成。绒毡层在外壁形成中所起的作用表现 为孢粉素前体的分泌，这些前体物在模板系统上聚合( b e d i n g e r 。1 9 9 2 ) 。此外， 绒毡层在花粉包被的合成中也起着重要作用。随着小孢子的液泡化，绒毡层细胞 逐渐死亡，其分解产物填入花粉壁，形成一层由脂类、蛋白、色素等成份组成的 花粉包被( s t e e r , 1 9 7 7 ；w ue la 1 ，1 9 9 7 ；p i f f a n e l l i 。1 9 9 8 ) 。这对于花粉的萌发和花 粉与柱头间的相互作用是重要的。 2 3 影响绒毡层发育和功能的几个必需基因 在拟南芥花药发育过程中，绒毡层对花粉的发育是至关重要的。有几个基因 与绒毡层的形成、发育及功能密切相关。 5 ：p 上口忆z 、研e x s 和狎d j 基因在花药发育的早期起作用，决定绒毡层 的形成( s c h i e f t h a l e re ta 1 1 9 9 9 ；y a n ge la i 1 9 9 9 ；z h a oe la 1 2 0 0 2 ；y a n ge la 1 2 0 0 3 ) 。在s p l n z z 突变体的花药中缺失了药室内壁、中层、绒毡层、减数分裂体 四层体细胞层。e m s l 巴裕和即d j 两基因决定着小孢子母细胞和绒毡层细胞的分 化，它们的敲除将导致绒毡层细胞前体继续分化而形成小孢子母细胞。 继绒毡层细胞形成之后，一些基因对绒毡层的分化和早期功能有着重要作 用，诸如：d y t l 、m y b 3 3m y b 6 5 。d y t l 基因编码一个b h l h 家族的转录因子， 在花药发育的第五期晚期和第六期早期于绒毡层中高效表达，它影响着其他绒毡 层相关基因的表达( z h a n ge ta 1 2 0 0 6 ) 。在m y b 3 3m y b 6 5 双突变体花药的花粉母细 胞时期。绒毡层细胞发生肥大，导致减数分裂前小孢子母细胞开始降解( m i l l a r a n dg u b l e r2 0 0 5 ) 。 在绒毡层发育的晚期，三个调控基因m s l 、a 朋卿m s l 8 8 是花粉形成和发育 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 所必需的。m s l ( a t 5 g 2 2 2 6 0 ) 基因编码的蛋白具有p h d f i n g e r 结构域( p h d f i n g e r m o t i f ) ，调控着绒毡层和小孢子的发育，突变体m s l 的花药中，绒毡层发育不正 常，出现空泡化，花粉自四分体释放小孢子后马上退化降解( w i l s o ne ta l ，2 0 0 1 ) 。 a m s ( a t 2 g 1 6 9 1 0 ) 是m y c 家族的一个转录因子，在绒毡层的发育和减数分裂后的 转录调控中起重要作用( s o r e n s e ne ta l ，2 0 0 3 ) ，它能引起未成熟绒毡层细胞和小 孢子的降解。m y b l 0 3 m s l 8 8 是r 2 r 3m y b 家族的一个转录因子，它的敲除会引起 完全的雄性不育表型。m y b l 0 3 m s l 8 8 主要在花药的绒毡层中特异性表达，调控 着绒毡层的发育、胼胝质的降解和花粉外壁的形成( h i g g i n s o ne ta 1 2 0 0 3 ；z h a n ge t a 1 2 0 0 7 ) 。 3 胼胝质 3 1 胼胝质的合成及相关基因 在植物雄配子发育过程中，减数分裂期间及其以后的细胞壁的形成和分解是 一个独特的过程。四分体的细胞壁( 胼胝质层) 主要由小孢子母细胞分泌的1 3 - 1 ，3 葡聚糖组成。胼胝质层具有将小孢子彼此分开、将其与孢子体细胞层隔离、以及 防止细胞融合等作用( w a t e r k e y ne ta 1 ，1 9 6 2 ；h e s l o p h a r r i s o na n dm a c k e n z i e ， 1 9 6 7 ) 。此外，胼胝质层还防止了小孢子过早发育、并提供了花粉外壁发育的模 板( w a t e r k e y na n db e i n f a i t 1 9 7 0 ) 。 在拟南芥中，有1 2 个c a l s 家族的基因与胼胝质合成相关( h o n g e t a l ，2 0 0 1 a ) 。 目前，o 塔家族是拟南芥基因组分类最大的基因家族之一。根据外显子的数量， c a 坶家族基因可以分成两类，一类由2 3 个外显子组成，另一类基因的外显子可 达到5 0 个。在这个家族中，编码胼胝质合成酶的c a l s 5 基因与沉积在减数分裂体、 四分体和小孢子上的胼胝质的合成有关( d o n ge ta 1 2 0 0 5 ) 。在突变体c a l s 5 的花药 中完全没有胼胝质，因此，影响了花粉的骨架和顶盖结构且导致含油层在球状结 构上的随机分布，不能形成正常的花粉外壁。 3 2 胼胝质的降解及相关基因 在减数分裂之后，胼胝质层在由绒毡层分泌的胼胝质酶复合体( c a l l a s e ) 的 8 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 作用下被降解，四分体释放出小孢子( s t e i g l i t z , 1 9 7 7 ；s t e i g l i t za n ds t e r m l 9 7 3 ) 。 b 1 ，3 葡聚糖酶是有许多家族的水解酶类，以酶对底物的特性分为两大类。葡聚 糖内切酶把长链的底物切成短片断，而葡聚糖外切酶则在长链末端水解单个糖单 位。葡聚糖内切酶的活性主要在绒毡层中被检测到，葡聚糖外切酶主要在花药外 层细胞中表达。实验证明，胼胝质酶复合体降解胼胝质层受到时间上的严格控制， 因此，在矮牵牛和高梁中过早或延迟表达胼胝质酶都将导致花药中小孢子的降解 ( f r a n k e le la 1 ，1 9 6 9 ；w a r m k ea n do v e r m a n ，1 9 7 2 ) 。d 1 ，3 葡聚糖酶的生物学功能大 部分是抵御微生物的感染、入侵等防御机制，但是也有一部分水解酶在根和花组 织中表达，他们的功能与植物防御机制无关，而是涉及组织的正常发育与分化 ( l o t a ne la 1 ，1 9 8 9 ；m e m e l i n ke la 1 ，1 9 9 0 ) 。例如在花药内特异表达的胼胝质酶复合 体，就是与四分体释放小孢子过程相关( f r a n k e le ta 1 ，1 9 6 9 ) 。 根据文献报道，目前已克隆了几个在花药中特异表达的编码b 1 ，3 葡聚糖内 切酶的基因。例如：烟草中用同源序列分析的方法分离得到的r a g 基因，是仅 在四分体分裂前期在绒毡层中有高效表达( b u c c i a g l i ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。还有拟南芥中 一个编码与8 1 ，3 葡聚糖酶同源的a 6 基因，其核酸序列与葡聚糖内切酶高度同 源，启动子的g u s 活性检测结果显示a 6 在花药正常表达胼胝质酶时活性最强。 此外，转基因烟草中，a 6 启动子在花药中特异表达，而且a 6 - b a r n a s e 的表达导 致了烟草中绒毡层降解以及雄性不育的表型( w o r r a l le ta 1 ，1 9 9 2 ；h i r de ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。可以说，这几个基因的时空特异性表达结果表明了它们在小孢子释放过 程中起着一定作用，可是它们在降解胼胝质时的具体功能还未被直接证实，而且 目前胼胝质体降解的调控机制还不清楚。 4 花粉壁 4 1 花粉壁的分化 在大多数植物中，花粉壁包括内层( 花粉内壁i n t i n e ) 和外层( 花粉外壁 e x i n e ) 。花粉外壁又分为两层：有蜂窝状的外壁外层( s e x i n e ) 以及平坦的外壁 内层( n e x i n e ) ( 见图卜3 ) 。 9 上海师范大学硕十学位论文第一章文献综述 囊曩曩曩罩i 曩瀚，：呐i n t i n e 鬈麓麓蠹麓爨季麓麓鬟一聊州一 ：一：一：e * ：一：c 一：- ：一：一：* ：一：* ：* ：一：一：一：* ： 图卜3 花粉壁结构 e x i n e ：花粉外壁；s e x i n e ：外壁外层；n e x i n e ：外擘内层；i n t i n e ：花 粉内壁；t r y p h i n e ：含油层；p l l l ：质膜；c y t o p l a s a ：细胞质 花粉壁的早期发育，特别是壁图案的决定要素，要追溯到减数分裂早期，一 直到四分体阶段，这个时期足原外壁形成的重要阶段。所谓原外壁，泛指外壁形 成的模板，通过孢粉素先质的成层积累，最终构成花粉外壁。原外壁是在质膜的 远极面上产生的纤维索性质的基质，在电镜下星中等电子密度的细颗粒状结构， 出现在胼胝质壁与质膜之间。虽然原外壁的受体基质是由幼嫩小孢子的原生质体 合成，但它是受孢子体控制的。在小孢子母细胞阶段，图案基因被抄录，其产物 转移到细胞质和质膜中，再通过质膜的活动形成原外壁。 从时间、空间和个体发育的顺序看，花粉壁的分化大致可以分为三个阶段： 1 四分体阶段：以原外壁为模板，首先分化出花粉的外壁外层。2 游离小孢子 阶段：先后或同时产生外壁内层和内壁，外壁内层是在初生外壁降解以后形成的， 作为外壁发育的骨架。3 成熟花粉阶段：孢粉素进一步沉积，壁层增厚，内壁 达到最后成熟程度。 花粉外壁在抵御不同环境压力，微牛物侵袭和细胞识别中起重要作用。花粉 外壁由复杂的骨架和项盖结构构成，极端抗腐蚀的孢粉素类物质是外壁的主要构 成物( s c o t te ta 1 ，1 9 9 4 ) 。孢粉素是由一些长链脂肪酸、氧化芬芳环以及苯基 丙酸类物质聚合而成。在花粉发育的四分体时期，在小孢子质膜和胼胝质层之间 积累的纤维素层( 即初生外壁) 形成了支架结构以利于孢粉素沉降，并在四分体 晚期使之逐渐形成骨架和顶盖的前体结构。在胼胝质层降解后，小孢子被释放到 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 花粉囊中，外壁的骨架顶盖结构也逐渐增大。在双核花粉期，外壁的网状结构已 经完全形成，花粉被一层致密的具花纹结构的外壁包裹。 总之，花粉外壁的合成是绒毡层细胞和小孢子共同参与的结果。目前认为， 小孢子建立起一个称为初生外壁的表面模板系统，决定了外壁的沉积模式，而绒 毡层分泌的孢粉素前体在模板系统上聚合( b e d i n g e 9 1 9 9 2 ) 。 4 2 花粉壁的功能 花粉壁作为细胞或花粉的保护或防御结构是容易理解的，但其核心问题还在 于它对传粉和受精作用的影响。这些作用主要通过花粉的表面纹饰、附属物和壁 蛋白来进行的。 在花粉壁的内部，普遍存在着外壁蛋白和内壁蛋白。外壁蛋白存在于成熟花 粉的外壁腔内，它是由二倍体的绒毡层细胞合成并提供的，因此是孢子体不亲和 性的识别物质；而内壁蛋白是受花粉的细胞质所控制，是配子体不亲和性的识别 物质。花粉粒的内壁是纤维素性质的，其层次结构在单子叶植物中是比较复杂的， 但它的功能主要是形成花粉管。此外，内壁蛋白和花粉管的蛋白质，对受精的不 亲和性也是十分重要的。 4 3 与花粉外壁合成相关的基因 目前，在拟南芥花粉发育过程中，一些在花粉外壁形成中出现问题的拟南芥 突变体己经被分离得到。臌因编码一个预测的脂肪酸还原酶，其作用是催化 脂肪酸转变为脂肪醇。它参与了苯丙醇合成途径，是孢粉素形成所需的重要基因。 历妇突变体的花粉无外壁结构并且表型为完全不育( a a r t se ta 1 ，1 9 9 3 ：a a r t se t a 1 ，1 9 9 7 ) 。d e x i 是花粉外壁网络结构形成的必需基因。这个蛋白是初生外壁或 内质网的组成部分，而且可能参与初生外壁前体的聚合，彪船基因突变会导致孢 粉素在小孢子质膜上随机沉积，且花粉粒退化降解( p a x s o n s o w d e r se ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。f l p l 基因编码一个转运蛋白或一个脂肪酸合成催化酶，在孢粉素和蜡质 合成中起到关键作用。在f l p l 突变体中，花药内能生成有外壁的小孢子，但是外 壁的网络结构被改变了，导致花粉表面异常光滑( a r i i z u me ta 1 2 0 0 3 ) 。n e f l 编 码了一个在绒毡层细胞质体中的膜蛋白。这个基因的缺失影响了绒毡层质体中油 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 脂积累、初生外壁形成以及孢粉素的合成。在n e l l 突变体中，没有花粉外壁结 构( a r i i z u m ie ta 1 2 0 0 4 ) 。虽然这些突变体的研究使我们对花粉外壁发育过程 有了一定的了解，但是对其调控机理的研究还不完善。 5 减数分裂 5 1 减数分裂机制 有性生殖是通过雌雄配子的融合，把父母双方的遗传物质混在一起的生殖方 式，它具有遗传的稳定性，同时又增加了诸多新的变异。而减数分裂便是有性生 殖的前提，在其第一轮分裂( 减数分裂i ) 中有一个相当长的前期，大多数生物 体在此阶段都要经历同源染色体相互识别、配对、联会、遗传重组等过程。在后 期i 同源染色体被分向相反的两极，染色体数目减半；而第二轮分裂( 减数分裂 i i ) 则是一个相对简单的等数分裂的过程。近年来，随着细胞生物学及分子生物 学研究方法的不断改进，以及对模式生物体的不断优化选择，人们在减数分裂机 制的研究上取得了瞩目的进展。 首先，姐妹染色单体间存在着相互联系和作用。减数分裂细胞与有丝分裂细 胞相似，大约早在s 期。姊妹染色单体便建立了联系。在前期i 的较早阶段，染色 单体的染色质纤维都被精确地盘绕成环状，每个环的基部都与一个中空的轴相 连，两个姊妹染色单体的染色质纤维环排列在轴的同- n ，形成一个线型的排列 结构，这种“肩并肩”的形式，可能是通过拓扑异构酶介导的周边染色质环的链 状排列而得以维持。这种作用方式使两个姊妹染色单体的轴联为一体，既方便了 两者之间的相互作用，也可能促进了两个姊妹染色单体相联的着丝粒的发育。 其次，同源染色体之间存在着配对、联会、重组等相互作用。同源染色体的 配对涉及到一个在基因组范围内搜索同源区段的过程。两个同源染色体首先“共 定位”到一个共同的空问领域，之后便是“共排列”，这两个步骤是通过一个间 隙相互作用的过程而进行的，这种相互作用最初是不稳定的、易变的，但不适当 的并列和缠绕会逐渐消失，最后只有那些合适的排列变得稳定而长久。同源染色 体在联会过程中，其侧面紧密相贴，形成联会复合体。联会复合体在之后的同源 染色体交换中起到一个中心支架作用，它是绝大多数生物体的染色体发生交叉和 1 2 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 交换的必要条件，联会一旦形成即发生交换。重组是指在减数分裂中发生的所有 的交换事件，它与细胞学上可见的交叉具有前后关系。在具有较大染色体的机体 中，减数重组事件也可以通过细胞学上可见的交叉来检测。 5 2 拟南芥中己知与减数分裂相关的基因 目前，在拟南芥中报道的与小孢子减数分裂有关的基因有：m m d l ( a t l 9 6 6 1 7 0 ) ，该基因编码p h d f i n g e r 转录因子，后者负责调控减数分裂时的 基因表达，其突变将导致性母细胞死亡( y a n ge ta 1 2 0 0 3 ) ；s y n l ( a t 5 9 0 5 4 9 0 ) 基因编码一个r a d 2 1 相关蛋白，该蛋白在染色体浓缩和姐妹染色单体配对的过 程中起作用( b a ie ta l ，1 9 9 9 ) ；a s k l ( a t l 9 7 5 9 5 0 ) 基因的突变导致染色体减数分 裂i 后期染色体分离不均一( ge ta l ，1 9 9 9 ) ；m s 5 p o l l e n l e s s 3 ( a t 4 9 2 0 9 0 0 ) 基 因则调控着减数分裂i i 期的分裂过程( g l o v e re ta 1 1 9 9 8 ；s a n d e r se ta 1 1 9 9 9 ) 。 m e l l ( a t l g 7 7 3 2 0 ) 基因与染色体重组修复相关，该突变体的四分体异常，经 常形成5 8 个不均匀小孢子的四分体( h ea n dm a s c a r e n h a s1 9 9 8 ) 。 6 植物转录因子 6 1 植物转录因子的概念、功能和分类 植物转录因子，又称反式作用因子，是一群能与真核基因启动子区域中的顺 式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与 空间表达的蛋白质分子。对转录因子蛋白质结构分析表明，转录因子一般具有4 个功能区：d n a 结合区、转录调控区、核定位信号区和寡聚化位点。d n a 结 合区是指转录因子识别d n a 顺式作用元件，并与之结合的一段氨基酸序列。转 录调控区包括转录激活区和转录抑制区两种，一般包含d n a 结合区以外的 3 0 1 0 0 个氨基酸残基。核定位信号区是转录因子中富含碱性氨基酸的结构域，转 录因子进入细胞核的过程受该区段的控制。寡聚化位点是不同转录因子借以相互 作用的功能区，它们的氨基酸序列很保守，大多与d n a 结合区相连并形成一定 的空间构象。转录因子的这些功能区决定转录因子的功能、特性、核定位和调控 作用。 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 根据与d n a 结合的方式可以把转录因子分为两类：普遍性转录因子和特异 性转录因子。普遍性转录因子能和启动子的核心序列t a t a 框结合而特异性转 录因子和d n a 序列上的其它顺式调节元件结合，只能激活特定的基因。通常根据 保守性较强的d n a 结合区把转录因子分类，例如螺旋转角螺旋 ( h e l i x - t u r n - h e l i x ) 、锌指( z i n cf i n g e r ) 结构、亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r ) 君f l m a d s 盒等结构。m y b 转录因子是其中非常重要的一类，而且是植物转录因子中最大的 家族之一。 6 2 植物m y b 类转录因子 植物m y b 类转录因子家族是指含有m y b 结构域的一类转录因子。m y b 结构域是 一段约5 1 5 2 个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列 ( s t r a c k ee ta 1 ，2 0 0 1 ；c h e ne ta 1 ，2 0 0 6 ) 。m y b 转录因子以含有保守的m y b 结构域为共 同特征，广泛参与植物发育和代谢的调节( n o d ae ta 1 ，1 9 9 4 ；m o y a n oe ta 1 ，1 9 9 6 ； t a m a g n o n ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。含单一吖b 结构域的m y b 转录因子在维持染色体结构和转 录调节上发挥着重要作用，是m y b 转录因子家族中较为特殊的一类。含两个m y b 结 构域的m y b 转录因子成员众多，在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞 的形态发生。含3 个m y b 结构域的m y b 蛋白与c - m y b 蛋白高度同源，可能在调节细胞 周期中起作用。 r 2 r 3 一m y b 转录因子是植物中数目最多的一类m y b 蛋白，它们以n 一端含有由两 个m y b 结构域构成的d n a 结合功能域为共同特征。d n a 结合功能域除特异结合d n a 外，有时其中的碱性氨基酸可兼作核定位序列。绝大部分r 2 r 3 一m y b 蛋白的c 一端都 具有转录激活功能域特征。这些都是r 2 r 3 一州b 蛋白作为转录因子所必需的要素。 d n a 结合功能域是转录因子最关键的结构域。r 2 r 3 一m y b 转录因子的d n a 结合功 能域由两个同源的m y b 结构域( r 2 ，r 3 ) 组成双部位结构，通过r 2 和r 3m y b 结构域的 协同作用完成与靶序列的特异结合，是一种比较独特的d n a 结合功能域的组织方 式。 绝大部分植物r 2 r 3 一m y b 蛋白通常还具有转录激活功能域。k r a n z 等( 1 9 9 8 ) 根 据植物中r 2 r 3 一m y b 蛋白的c 2 端氨基酸序列把这些r 2 r 3 一m y b 蛋白分组，发现各亚组 4 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 的保守序列中有的富含酸性氨基酸，有的富含s e r t h r ，有的富含p r o 和g l n ，有的 同时具备上述几个特征。这提示r 2 r 3 一m y b 转录因子大都具有转录激活功能。 6 3 拟南芥中已知与花药发育有关的m y b 转录因子 在模式植物拟南芥基因组中，根据转录因子数据库的统计 b ! 1 2 ；g 丛：! b i ：b 虹：蚓! ：! z ，包含t 2 0 3 个的m y b 家族成员，这个家族功能主 要有：控制细胞分化和发育；在多条苯基丙酸类合成途径中起调控作用苯基 丙酸类物质是由苯丙氨酸经代谢产生的一大类化学代谢产物所构成，包括类黄 酮，香豆酸，肉桂醇以及其他一些物质；此外，还调控着对水杨酸，脱落酸( a b a ) ， 赤霉素( g a ) 这些信号分子的响应( r o m e r oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 目前，国际上已经报道了几个与拟南芥花药发育有关的m y b 家族基因。例如： 月棚耀筘( a t 3 g 1 3 8 9 0 ) 与花药内层细胞的细胞壁发育相关，影响花药的开裂导致雄 性不育( s t e i n e r l a n g ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。彳朋儡刃( a t 4 g 3 4 9 9 0 ) 在拟南芥大多数组 织中都有表达，以花药绒毡层、柱头和侧根中的表达最强，这个基因的表达变化 会导致苯基丙酸类合成途径的变化，影响了花粉壁的沉积( p r e s t o ne ta 1 ， 2 0 0 4 ) 。a 嬲，( a t 5 g 0 6 1 0 0 ) 以及a 删阳缈( a t 3 g 1 1 4 4 0 ) 这两个同源基因是受 m i c r o r n a 调控的与g a 信号途径相关的m y b 转录因子，在这两个基因的双突变体中， 绒毡层过度肥大，导致了花粉在减数分裂前发育异常( a n t h o n y a m i l l a re ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。月t 脚7 ( a t 5 g 5 6 1 1 0 ) 基因在花药以及表皮毛中表达，反义技术敲除 a t m y b i 玖瑾因影响了花粉，绒毡层以及表皮毛的发育。在被敲除的植株中，花粉 粒由于缺乏细胞质内容物导致外形上的扭曲，绒毡层在发育过程中提前降解，并 且茎和叶的表皮毛的分支与野生型相比有明显增加( l ie ta 1 ，1 9 9 9 ：h i g g i n s o n e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。我们实验室的船，蹶变体是与, 4 t m y b l 0 3 基因等位的突变体，它 的花药除了上述缺陷外，花药的胼胝质延迟降解且花粉外壁不能正常形成 ( z a i b a o z h a n gc t a l ，u n d e rr e v i e w ) 。但是，该基因在花药中的详细生物学功能 尚未明了。 7 本研究的目的意义和内容 植物的有性生殖不仅是