（外科学专业论文）血管内皮生长因子基因多态性与肺癌遗传易感性的关联性研究.pdf

目录 iylllll11901tl it l li lli 11111 illll07 1 1 1 1 1 5 i y 19 0 1 中文摘要 1 英文摘要4 研究论文血管内皮生长因子基因多态性与肺癌遗传易感性的关联性 研究 前言 一8 日u 舌j 8 材料和方法9 结果 1 5 附图 1 8 附表 1 9 讨 仑2 4 结论3 0 参考文献3 1 综述血管内皮生长因子与恶性肿瘤的相关研究进展3 6 致谢5 4 个人简历5 5 中文摘要 血管内皮生长因子基因多态性与肺癌遗传易感 性的关联性研究 摘要 目的：肺癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因，占全部恶性肿瘤死亡的 五分之一，且发病率和死亡率仍在继续迅速上升。根据卫生部全国肿瘤防 治办公室提供的资料显示：目前我国肺癌发病率每年增长2 6 9 ，如不及 时采取有效控制措施，预计到2 0 2 5 年，我国肺癌病人将达到1 0 0 万，成 为世界第一肺癌大国。研究调查显示：吸烟，环境污染化，职业暴露，生 活方式不良化等多种因素都会影响肺癌的发生，流行病学研究已证明吸烟 与肺癌发生之间存在密切关系，吸烟导致肺癌的发病率和死亡率持续上 升。研究结果显示：在因肺癌死亡的病例中，8 0 男性、7 5 女性跟吸烟有 关。随着肺癌分子流行病学，肺癌细胞分子生物学研究水平的不断进步， 关于肺癌遗传易感性方向的研究逐步受到重视。 恶性肿瘤的生长和转移要靠丰富的营养供给，组织中的营养物质和 氧气通过血管进入肿瘤细胞，同时代谢产物排到细胞外，这就为肿瘤细胞 生长和迁移奠定了重要的基础条件。研究肿瘤血管生成对了解恶性肿瘤的 发生、发展、侵袭和转移的生物学特性和机理有重要的理论意义和临床应 用价值。血管内皮生长因子( v e g f ) 是众多促进血管生成的因子之一， 是生理性病理性血管生成调节物，可直接作用于血管内皮细胞，促进人类 血管的生长，在肿瘤的形成，生长，侵袭及转移过程中扮演重要角色。近 些年研究显示：肺癌、食管癌、前列腺癌，卵巢癌等肿瘤疾病患者的肿瘤 组织、血、尿都可以检测到v e g f 表达量相应增加。 人类的v e g f 基因具有一些高度多态性位点，这些多态性位点可能通 过基因序列的改变，从而改变基因的转录活性进而影响相应蛋白的表达， 导致了人类对疾病易感性的个体差异。研究表明v e g f 基因启动子区 一4 6 0 t c 、2 5 7 8 c a 单核苷酸多态( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 与多种疾病的发病风险相关。本研究旨在探讨v e g f 基因启动子区 4 6 0 t c 、一2 5 7 8 c a 单核苷酸多态( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p s ) 与中国北方汉族人群肺癌发病风险的关系，进一步阐明肺癌的分子生物学 中文摘要 机制。 方法：采用基于医院的病例对照研究方法，采集2 51 例肺癌患者( 其 中鳞状细胞癌9 5 例、腺癌6 8 例、小细胞肺癌4 1 例、腺棘细胞癌2 6 例、其他 病理类型( 包括粘液表皮样癌、大细胞未分化癌、透明细胞癌、肉瘤样癌、 细支气管肺泡癌等) 2 1 例, n 2 5 5 侈t 健康对照个体的静脉抗凝血5 m l ，同时记 录其病史和个人相关资料。采用蛋白酶k 消化饱和氯化钠盐析法于外周血 采集一周内提取其白细胞d n a ，采用聚合酶链反应限制性片段长度多态 性( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， p c r r f l p ) 分析方法和引物介导的限制性聚合酶链反应 ( p r i m e r - i n t r o d u c e dr e s t r i c t i o na n a l y s i sp c r ，p i r a p c r ) 方法检测4 6 0 c t 和v e g f 2 5 7 8 c a s n p s 的基因型频率分布。 数据统计分析采用s p s s13 0 版软件包( s p s sc o m p a n y ，c h i c a g o ， i l l i n o i s ，u s a ) 进行分析，p o 0 5 ) 。 2在肺癌患者组和健康对照组中，吸烟个体比例分别为为5 9 8 、 4 1 6 ，两组间存在显著性差异( x ? = 1 6 7 4 8 ，p 0 0 1 ) 。吸烟可能显 著增加肺癌发病风险( o r = 3 1 0 3 ，9 5 c i = 1 9 7 8 4 8 6 7 ) 。 3 在肺癌患者组和健康对照组中，v e g f 基因启动子区4 6 0 t c 单核昔 酸多态的三种基因型频率( t 厂r 、c t 、c c ) 分别是5 2 2 、4 0 2 、 7 6 和6 1 2 、3 5 3 、3 5 。比较两组间基因型分布，存在显著性 差异( p = o 0 4 2 ) ；等位基因频率分布( t 、c ) 分别是7 2 3 、2 7 7 中文摘要 和7 8 8 、2 1 2 ，两组间比较具有显著性差异( 户o 0 1 6 ) 。与t t 、 c t 基因型相比，携带c c 基因型可能明显增加肺癌的发病风险 ( o r 1 9 7 9 ，9 5 c i = 1 3 3 9 2 9 2 5 ) 。 4在肺癌患者组和健康对照组中，v e g f 基因启动子区2 5 7 8 c a 单核 苷酸多态的三种基因型频率( c c 、c a 、a ) 分别是4 9 8 、 4 3 o 、7 2 和6 0 4 3 6 5 3 1 。比较两组间基因型分布，具有 显著性差异( 仁o 0 1 9 ) ；等位基因频率分布( c 、a ) 分别是7 1 3 2 8 7 和7 8 6 2 1 4 ，两组间比较具有显著性差异( p = - 0 0 0 7 ) 。 与c c 、c a 基因型相比，携带a 基因型可能明显增加肺癌的发病 风险( o r = 2 0 4 4 ，9 5 c i = 1 3 9 4 2 9 9 4 ) 。 5应用2 l d 软件对v e g f 4 6 0 t c 与2 5 7 8c a 多态性位点进行联合分 析显示，两多态性位点间不存在连锁不平衡( d = o 3 0 3 7 1 7 ) 。 结论： 1吸烟可以明显增加肺癌的发病风险。 2v e g f 4 6 0 t c 单核苷酸多态性与肺癌发病风险相关，即携带c 等位 基因的基因型( c t + c c ) ，可能显著增加肺癌的发病风险。 3v e g f 2 5 7 8 c a 单核苷酸多态性可能显著增加肺癌的发病风险。 4v e g f 基因启动子区v e g f 4 6 0 t c 与2 5 7 8c a 单核苷酸多态位点 间不存在连锁不平衡。 关键词：肺癌；血管内皮生长因子；基因多态性；单核苷酸；遗传易 感性；发病风险 一 研究论文 s t u d yo nt h ea s s o c i a t i o no fv e g fg e n e t i cp o l y m o r p h i s m s w i t hp r i m a r yl u n gc a n c e r a b s t r a c t o b j e c t i v e ：l u n gc a n c e rb e c a m et h ef i r s tc a u s eo fd e a t ho fm a l i g n a n t t u m o u ri nc h i n a ，a c c o u n t i n gf o rt h ed e a t ho ft h ef i f t ho f m a l i g n a n tt u m o u r ， w h i c hi n c i d e n c ea n d m o r t a l i t yc o n t i n u e st or i s er a p i d l y a c c o r d i n gt ot h e m i n i s t r yo fn m i o n a lc a n c e rp r e v e n t i o na n dc o n t r o lo ft h eo m c ep r o v i d e s i n f o r m a t i o nd i s p l a y e d ：t h el u n gc a n c e ri n c i d e n c eo fo u ra n n u a lg r o w t hi s 2 6 9 a sn o tt ot a k ee f f e c t i v em e a s u r e st oc o n t r o l ，u n t i l2 0 2 5 ，t h el u n g c a n c e rp a t i e n t si nc h i n aw i l lr e a c h1 m i l l i o n ，i ti se x p e c t e dt ob e c o m et h e w o r l d sf i r s t l u n g c a n c e rp o w e r sc o u n t r y r e s e a r c ha n ds u r v e yh a v e d e m o n s t r a t e dt h a t c i g a r e t t e s m o k i n g ， e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n ， o c c u p a t i o n a le x p o s u r ea n db a dl i f e s t y l ee t cf a c t o r sw i l li n f l u e n c et h e o c c u r r e n c eo fl u n gc a n c e r e p i d e m i o l o g i c a lr e s e a r c h e sp r o v e dt h a tt h e r e e x i s t sc l o s er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns m o k i n ga n dl u n gc a n c e r b e c a u s eo f s m o k i n g ，l u n gc a n c e ri n c i d e n c ea n dm o r t a l i t yr a t eh a v ec o n t i n u e dt or i s e r e s e a r c hr e s u l td i s p l a y ：8 0 o fm e na n d7 5 o fm e nh a v er e l a t e dw i t h s m o k i n gi nl u n gc a n c e rd e a t h so fc a s e s a l o n gw i t ht h ed e v e l o p i n go fl u n g c a n c e rm o l e c u l e se p i d e m i o l o g i c a la n dc e l l sm o l e c u l a r b i o l o g y ，t h ee f f e c t o f h e r e d i t a r ys u s c e p t i b i l i t yw a sf o c u s e do nt h er e s e a r c ho fl u n gc a n c e r m a l i g n a n tt u m o rg r o w t ha n dt r a n s f e rm u s tb es u p p l i e dw i t ht h e n u t r i e n t s t h en u t r i e n t sa n do x y g e no fo r g a n i z a t i o n se n t e rt h et u m o rc e l l s b yv e s s e l s ，a n dm e t a b o l i cp r o d u c tc o m e so u t f r o mt h ec e ll s ，t h i sc r e a t e s t h ei m p o r t a n tb a s i cc o n d i t i o n sf o rt h et u m o rc e l l sg r o w t ha n dt r a n s f e r t h e r ei si m p o r t a n tt h em e a n i n ga n dv a l u ei nc l i n i c a la p p l i c a t i o nt os t u d y b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dm e c h a n i s m so ft h ev e s s e l sg e n e r a t i o no f m a l i g n a n c i e si nt h eg r o w t hp r o c e s so fm a l i g n a n tn e o p l a s m sd e v e l o p m e n t a g g r e s s i o na n dt r a n s f e r v a s c u l a re n d o t h e li a lg r o w t hf a c t o r ( v e g f ) i sa p r i m er e g u l a t o ro fp h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a la n g i o g e n e s i si nk n o w n 4 研究论文 a sa n g i o g e n i cf a c t o r i tc a nd i r e c t l ya c to ne n d o t h e l i a lc e l lo fb l o o dv e s s e l a n dr e s u l ti nn e o v a s c u l a r i z a t i o n s ov e g fi sb e l i e v e dt op l a yac e n t r a l r o l ei nt h ed e v e l o p m e n t ，g r o w t h ，i n v a s i v e n e s s ，a n dm e t a s t a s i so ft u m o r r e c e n t l y ，s t u d i e ss h o wt h a ts o m et u m o r sm a yi n d u c eah i g h e rs e r u m ， u r i n a r yo ri n t r a t u m o r a lv e g fl e v e l ，f o ri n s t a n c e ：l u n gc a n c e r ，e s o p h a g u s c a n c e r ，p r o s t a t i cc a r c i n o m a ，a n do v a r i a nc a r c i n o m a s o m es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) i nt h ep r o m o t e r r e g i o n s o fh u m a nv e g fg e n em a yi n f l u e n c ep r o t e i ne x p r e s s i o nb y a l t e r i n g v e g f g e n e t r a n s c r i b e a c t i v i t y s t u d i e sh a v e s h o w nt h a t t h e v e g f 一4 6 0 t c ，- 2 57 8 c ap o l y m o r p h i s m sw e r ea s s o c i a t e dw i t ht h er i s k o fs o m ed i s e a s e s o u rp u r p o s ew a st o a n a l y s i s t h ea s s o c i a t i o no f v e g f 一4 6 0 t c ，一2 5 7 8 c as n p sw i t ht h es u s c e p t i b i l i t i yo fl u n gc a n c e ri n n o r t h c h i n aa n df u r t h e ri l l u m i n a t em o l e c u l a r b i o l o g ym e c h a n i s m so fl u n g c a n c e r m e t h o d s ：t h i sh o s p i t a l - - b a s e dc a s e - c o n t r o ls t u d yc o m p r is e d2 51 p a t i e n t s w i t h l u n gc a n c e r ( 9 5s q u a m o u s c e l lc a r c i n o m a s ，6 8 a d e n o c a r c i n o m a s ，41 s m a llc e l l l u n gc a r c i n o m a s ，2 6a d e n o s q u a m o u s c a r c i n o m a ，a n d21o t h e rp a t h o l o g i c a lt y p e si n c l u d i n gm u c o e p i d e r m o i d c a r c i n o m a ，l a r g e c e l lu n d i f f e r e n t i a t e dc a r c i n o m a ，c l e a rc e l lc a r c i n o m a ， s a r c o m a t o i dc a r c i n o m a ，b r o n c h i o l o a l v e o l a rc a r c i n o m a ，a n ds oo ni n c l u d e d ) a n d2 5 5f r e q u e n c y - m a t c h e dh e a l t h yc o n t r o l sw i t hn oe v i d e n c eo fd i s e a s e f i v em i l l i l i t e ro fv e n o u sb l o o df r o me a c hs u b j e c tw a sd r a w ni nv a c u t a i n e r t u b e sc o n t a i n i n ge d t aa n ds t o r e da t4 c ，m e a n w h i l et h em e d i c a lh i s t o r y a n dp e r s o n a ld a t ao f e a c hs u b j e c tw a so b t a i n e d t h eg e n o m i cd n aw a s e x t r a c t e dw i t h i no n ew e e ka f t e rb l e e d i n gb yu s i n gp r o t e i n a s ek d i g e s t i o n f o l l o w e db yas a l t i n go u tp r o c e d u r e g e n o t y p e so ft h ev e g f 一4 6 0 t ca n d 2 57 8 c as n p sw e r ea n a l y z e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n - r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ( p c r r f l p ) m e t h o d a n d p r i m e r i n t r o d u c e dr e s t r i c t i o na n a l y s i sp c r ( p i r a p c r ) s t a t i s t i c a la n a l y s i sw a sp e r f o r m e du s i n gs p s s13 0s o f t w a r ep a c k a g e ap r o b a b i l i t yl e v e lo f5 妒 o 0 5 ) 2t h ef r e q u e n c yo fs m o k e r si nl u n gc a n c e r p a t i e n t sa n dh e a l t h yc o n t r o l s w e r e5 9 8 41 6 ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a s s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c eb e t w e e nt h e p a t i e n t s a n d c o n t r o l s ( x 2 = l6 7 4 8 ，p o o1 ) s m o k i n gm a yi n c r e a s e dt h er i s ko f d e v e l o p i n gl u n gc a n c e r ( o r = 3 1 0 3 ，9 5 c i = 1 9 7 8 4 8 6 7 ) 3t h eg e n o t y p ef r e q u e n c i e so ft h ev e g f 一4 6 0t t ，c ta n dc ci n p a t i e n t s a n dc o n t r o l sw e r e 5 2 2 61 2 ，4 0 2 35 3 a n d 7 6 3 5 ，r e s p e c t i v e l y ；t h eta n dca l l e l e f r e q u e n c i e s w e r e 7 2 3 7 8 8 a n d2 7 7 2 1 2 ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e 。t h eg e n o t y f d i s t r i b u t i o n so rallelein g e n o t y d e f r e q u e n c i e so fv e g f 一4 6 0 t cb e t w e e nt h ep a t i e n t sa n dc o n t r o l s q 3 = 0 0 16 ) c o m p a r e dw i t ht h e 弋| 飞+ c hg e n o t y p e s ，t h ec | cg e n o t y p e c o u l ds i g n i f i c a n t l ym o d i f yt h er i s ko fd e v e l o p i n ge p i t h e l i a lo v a r i a n c a n c e r t h eo d d sr a t i ow a s1 9 7 9 ( 9 5 c i = i 3 3 9 - 2 9 2 5 ) 4t h eg e n o t y p ef r e q u e n c i e so ft h ev e g f 2 5 7 8c c ，c aa n da ai n p a t i e n t s a n dc o n t r o l sw e r e 4 9 8 6 0 4 ，4 3 0 3 6 5 a n d 6 研究论文 7 2 3 1 ，r e s p e c t i v e l y ；t h e ca n daa l l e l e f r e q u e n c i e s w e r e 71 3 7 8 6 a n d2 8 7 21 4 ，r e s p e c t i v e l y t h e r ew a s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ei nt h e g e n o t y p e d i s t r i b u t i o n so ra l l e l e f r e q u e n c i e so fv e g f 一4 6 0 t cb e t w e e nt h ep a t i e n t sa n dc o n t r o l s ( p = o 0 0 7 ) c o m p a r e d w i t ht h ec c + c a g e n o t y p e s ，t h e a g e n o t y p ec o u l ds i g n i f i c a n t l ym o d i f yt h er i s ko fd e v e l o p i n ge p i t h e l i a l o v a r i a nc a n c e r t h eo d d sr a t i ow a s2 0 4 4 ( 9 5 c i = i 3 9 4 - 2 9 9 4 ) 5t h ec o m b i n e de f f e c to fv e g f - - 4 6 0 t ca n d - - 2 5 7 8 c as n po nl u n g c a n c e rw a sa n a l y z e d i tw a ss h o w nt h a tt h et w os n p sw e r en o ti n l i n k a g ed i s e q u i l i b r i u m ( d = o 3 0 37 17 ) c o n c l u s i o n s ： i s m o k i n gm a y i n c r e a s et h er i s ko fd e v e l o p i n gl u n gc a n c e r 2v e g f 一4 6 0 t cp o l y m o r p h i s mw a sa s s o c i a t e dw i t hs u s c e p t i b i l i t yt o l u n gc a n c e r , c a r r y i n gca l l e l em a ys i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h er i s ko f d e v e l o p i n gl u n gc a n c e r 3v e g f - 2 57 8 c as n pw a sa s s o c i a t e dw i t ha ni n c r e a s e dr i s ko fl u n g c a n e e r 4t h ep r o m o t e rp o l y m o r p h i s m s - - 4 6 0 t c a n dt h e 2 578 c aw e r en o t l i n k a g ed i s e q u i l i b r i u m k e yw o r d s ：v e g f ；l u n gc a n c e r ；g e n e t i cp o l y m o r p h i s m ；s i n g l e n u c l e o t i d e ；s u s c e p t i b i l i t y ；r i s k 7 研究论文 血管内皮生长因子基因多态性与肺癌遗传易感 性的关联性研究 让! 叁 刖 罱 肺癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，全世界范围内发病率 上升最快、病死率最高、治疗效果相对较差的恶性肿瘤，肺癌成为全 球头号癌症杀手，每年因肺癌死亡的人数多于乳腺癌、前列腺癌和肠 癌死亡人数的总和。肺癌总发病数占全部恶性肿瘤发病的2 0 o ，死亡 占总癌死亡数的2 3 8 【1 1 据( 2 0 0 4 年世界卫生组织g l o b o c a n 癌症报 告。全球每年有大约1 2 0 万人被诊断为肺癌，中国每年约有4 0 万人被 确诊为肺癌。近年来肺癌发病情况在全球范围内呈持续上升趋势，对 人类的健康造成极大的危胁。肺癌的病因学、早期诊断、预防和综合 治疗成为各国学者努力研究的重点课题之一。 近年来研究发现，类似恶性肿瘤的转移和种植，血管生成在肺癌 形成的过程中起重要作用。在已知的血管生成因子中，血管内皮生长 因子( v e g f ) 是生理性、病理性血管生成的最重要调节物，它可直 接而特异地作用于血管内皮细胞，导致新生血管形成【2 】。血管内皮生 长因子( v e g f ) 是目前己知的最重要的血管生成调控因子，并且一 些研究提示肺癌的血管生成及不良预后与其表达量增加相关【3 5 1 。人类 v e g f 基因位于染色体6p2 1 3 ，包括8 个外显子和7 个内含子【6 1 。有研 究结果表明v e g f - 4 6 0 t c 、v e g f + 4 0 5 g c 、一2 5 7 8 c a 和- 11 5 4g a 基因位点与v e g f 在活体内表达活性增加相关i 1 2 】。因此推测：该基因 多态性有可能通过影响v e g f 的表达量从而影响肿瘤的发生和发展。 目前关于v e g f 一4 6 0 t c 和2 5 7 8 c a 多态与其它疾病发病风险的研究已 有较多报道【1 3 15 1 ，但结果在不同疾病中并不一致；其与肺癌关系的研 究也报道不多【1 6 1 。本研究采用病例对照研究方法，拟探讨v e g f 基因 启动子区4 6 0 t c 、2 5 7 8 c a 单核苷酸多态( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m e r p h i s m s ，s n p s ) 与肺癌遗传易感性的关系，进一步肺癌的分子生物学 机制。 研究论文 材料与方法 1研究对象 本研究包括肺癌患者2 5 1 例，健康对照个体2 5 5 例。病例组为 2 0 0 3 年9 月至2 0 1 0 年9 月在河北医科大学第四医院胸外科住院手术 治疗的患者，所有患者术前均未经化疗或放射治疗，除外其它癌症患 者及合并某些和血管增生相关的疾病如子宫内膜异位症；呼吸窘迫综 合征：慢性心衰；慢性呼吸衰竭，糖尿病等。均为汉族以排除种族间 可能存在的基因差异。且无明确致癌因素长期接触史。肿瘤的病理类 型均经河北医科大学第四医院手术切除标本的病理报告确认，其中鳞 状细胞癌9 5 例、腺癌6 8 例、小细胞肺癌4 1 例、腺棘细胞癌2 6 例、 其他病理类型( 包括粘液表皮样癌、大细胞未分化癌、透明细胞癌、 肉瘤样癌、细支气管肺泡癌等) 21 例。2 5 5 例健康对照为河北医科大 学第四医院进行健康体检的人员。患者及健康对照来自石家庄市及周 围市、县，均为汉族，彼此无血缘关系。有专业人员详细询问记录肺 癌组及患者组的年龄、性别和吸烟情况。现吸烟或曾吸烟每天5 支以 上并持续2 年以上者被定义为吸烟个体。本课题涉及的所有研究对象 均签有知情同意书。 2 主要实验设备、仪器与器皿 ( 1 ) s w - c j 2 f d 型净化工作台苏州安泰空气技术公司 ( 2 ) 离心机l x j - 6 4 0 1北京医疗仪器修理厂 ( 3 ) 台式离心机p q 1 6 0 0 a上海培清科技有限公司 ( 4 ) 电子天平p b 3 0 2 2 s瑞士m e t t l e r 公司 ( 5 ) p c r 扩增仪m a s t e r c y c l e r 5 3 3 3德国e p p e n d o r f 公司 ( 6 ) d y y - i i l 2 稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂 ( 7 ) 医用微波炉( m i c r o w a v eo v e n )上海中达医学应用研究所 ( 8 ) e p p e n d o r fr e s e a r c h 移液器德国e p p e n d o r f 公司 ( 9 ) d y f i i l 2 8 a 型电泳槽北京市六一仪器厂 ( 1 0 ) 2 0 2 2 a 型电热恒温烤箱上海阳光实验仪器公司 ( 1 1 ) m d f u 5 0 v 一8 6 低温冰箱日本三洋公司 ( 1 2 ) 凝胶成像分析仪a l p h a l a n g e r2 2 0 0 美国a n l a i 公司 研究论文 ( 1 3 ) h j 3 恒温磁力搅拌器 ( 1 4 ) h 1 微型混合器 ( 15 ) 澳柯玛冰柜 ( 1 6 ) 海尔冰箱b c 1 6 5 d ，( 1 7 ) 冰盒 ( 18 ) m d f u 5 0 v - 8 6 低温冰箱 3 主要实验试剂 ( 1 ) t r i t o n x 1 0 0 ( 2 ) 而s ( 三羟甲基氨基烷) ( 3 ) e d t a ( 乙二胺) ( 4 ) s d s ( 十二烷基磺酸钠) ( 5 ) 蛋白酶k ( 6 ) 1 0m m o l ld n t p s ( 7 ) 琼脂糖 ( 8 ) 溴化乙锭 ( 9 ) 1 0 0 b pd n a l a d d e r ( 1 0 ) t a q d n a 聚合酶 ( 1 1 ) 限制性内切酶： b s h l l 2 3 6 i b g li i ( 1 2 ) 引物合成 4 实验方法 4 1 本实验中所用试剂的制备 4 1 1d n a 提取液的制备 1m t r i s h c l ( p h = 8 o ) o 5 me d t a 1 mn a c l 加水至 4 1 2t e 缓冲液的制备 1 mt r i s h e l o 5 me d t a 江苏金坛医疗仪器厂 上海彭氏实业有限公司 青岛澳柯玛公司 青岛海尔集团同叼博列、呆i 剑 上海复日科技有限公司 日本三洋公司 s i g m a s i g m a s i g m a s i g m a m e r c k ，g e r m a n y 北京赛百盛生物有限公司 s i g m a s i g m a 北京赛百盛生物有限公司 北京赛百盛生物有限公司 p r o m e g a f e r m e n t a s 北京赛百盛生物有限公司 l m l 2 m l l m l 1 0 0 m l l m l 0 2 m l 1 0 研究论文 至 l0 0 m 1 4 1 35 0 x t a e 贮液的制备 t r i s 2 4 2 9 冰乙酸 5 7 1 m l 0 5 m o l 1e d t a 10 0 m l ( p h = 8 o ) 加水至1 0 0 0 m l 4 1 45 x t b e 的制备 t r i s 5 4 9 e d t a 二n a 2 3 7 2 9 硼酸 2 7 5 9 加水至1 0 0 0 m l 4 2 基因组d n a 的制备： 外周血白细胞d n a 的提取采用蛋白酶k 消化饱和氯化钠盐析法。 具体操作程序如下： 4 2 1 采取肘静脉血约5m l ，加入枸橼酸钠抗凝剂o 8 5m l 轻摇。 4 2 2 将加有o 8 5m 1 枸橼酸钠的血液标本置于5 0m l 离心管中，加预 冷蒸馏水至5 0m l ，反复颠倒混匀，2 5 0 0r p m 室温离心1 5 分钟。 4 2 3 缓慢倾倒上清，沉淀物中加入预冷的o 1 t r i t o n x 1 0 0 至5 0m l ， 同上离心，倾倒上清，用预冷蒸馏水洗涤l 2 次，沉淀物即为白 细胞。 4 2 4 沉淀物中加入3m ld n a 提取液，充分混匀，悬浮白细胞。加 1 0 s d s1 5 0 i t l ( 终浓度为o 5 ) ，振荡。 4 2 5 加入蛋白酶k 至终浓度为1 0 0 9 9 m ( 1 约4 0 0 9 1 ) ，混匀，3 7 。c 水 浴过夜消化。 4 2 6 加入5mn a c l1 2m l ，振荡2 5 秒，2 5 0 0r p m 室温离心15m i n 。 4 2 7 将上清倒入另一盛有8m l 无水乙醇的玻璃瓶中，反复颠倒。 4 2 8 挑出d n a 至内置有7 0 7 , 醇lm l 的e p p e n d o r f 管中，1 2 0 0 0r p m 室温离心5m i n 后弃去乙醇，自然晾干。 4 2 9 以2 0 0 9 lt e 溶解d n a ，4 放置至少2 4h 。 4 2 1 0 鉴定：将提取的基因组d n a ，在0 8 琼脂糖凝胶中电泳( 恒压 研究论文 8 0 v ，电泳缓冲液1x t b e ) 3 0 分钟后，将凝胶移至0 【成像系统 下进行观察。 4 2 1 1 定量：用无菌去离子水将鉴定合格的d n a 用溶解液稀释适当倍 数，在紫外分光光度仪上测量2 6 0n m ( o d 2 6 0 ) 和2 8 0a m ( o d 2 8 0 ) 两个波长的吸光度( 0 d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值大于1 6 ) ， 将可用的d n a 置于2 0 冰箱储存备用。 4 3 稀释d n a 备用：将t e 溶解的d n a 用无菌蒸馏水按比例稀释， 终浓度为1 0 0n g j 1 ，在震荡器上震荡2 0 秒后短暂离心备用，此即 为p c r 反应中的模板d n a 。 4 4 引物的合成： 4 4 1v e g f 一4 6 0 t c 多态特异性引物 上游引物为：5 t g t g c g t g t g g g g t t g a g c g 一3 ， 下游引物为：5 - t a c g t g c g g a c a g g g c c t g a 3 。 4 4 2v e g f 2 5 7 8 c a 多态特异性引物 上游引物为：5 g g a t g g g g c t g a c t a g g m g c 3 ， 下游引物为：5 a g c c c c c 肼c c t c c a a c 3 。 4 5 扩增v e g f 4 6 0 t c 和2 5 7 8 c a 基因的反应体系： 4 5 1 扩增v e g f 4 6 0 t c 基因的反应体系： 灭菌去离子水 1 0 x p c r 缓冲液 p c r 染料 上游引物 下游引物 1 0m m o l ld n t p s t a q 酶 模板d n a 4 5 2 扩增v e g f 2 5 7 8 c a 基因的反应体系： 灭菌去离子水 1 0 x p c r 缓冲液 p c r 染料 上游引物 11 6 山 1 6 1 d 2 o “l 1 o “l 1 o “1 o 4 山 0 4 1 d 2 o 山 1 0 8 山 2 4 肛1 2 0 1 x l 1 o “l 1 2 研究论文 下游引物 1 0 1 t l 10m m o l ld n t p s 0 4 9 l taq酶04i，d 模板d n a 2 0 9 l 将上述反应液轻弹混匀、短暂离心以便集中反应液于管底。 4 6 依据设计的循环参数进行扩增，反应条件： 4 6 1v e g f 4 6 0 t c ：