（遗传学专业论文）醛固酮调控wnk激酶家族表达及其作用机制的研究.pdf

目录 l l l llli ii ll l li l l lt ll l l l y 18 9 3 0 6 2 一、摘要 中文论著摘要( 1 ) 英文论著摘要( 4 ) 二、英文缩略词( 7 ) 三、论文 前言( 8 )刖舌( 8 ) 实验材料( 1 0 ) 实验方法( 1 1 ) 实验结果( 附论文图片) ( 2 0 ) 讨论( 2 7 ) 结论( 2 9 ) 四、本研究创新性自我评价( 3 0 ) 五、参考文献( 3 1 ) 六、附录 综述( 3 4 ) 在学期间科研成绩( 4 3 ) 致谢( 4 4 ) 个人简介( 4 5 ) 中文论著摘要 醛固酮调控w n k 激酶家族成员表达 及其作用机制的研究 刖罱 w n k 激酶( 盟i t hn ol y s i n e ( k ) l ( i n a s e ) 是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，因其 家族成员在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名。w n k 激酶家族成员均具有1 个 短的氨基端结构域、1 个高度保守的蛋白激酶结构域、1 个自身抑制结构域和至少2 个螺旋螺旋结构域。迄今，在人类共发现了该家族的4 个成员，即w n k l 、w n k 2 、 w n k 3 和w n k 4 。其中，w n k i 禾iw n k 4 的基因变异导致一种常染色体显性遗传病 一l i 型假性低醛固酮血症( p s e u d o h y p o a l d o s t e r o n i s mt y p e i i ，p h a i i ，o m i m # 1 4 5 2 6 0 ) 。p h a i i 是一种。肾脏离子转运异常性疾病，也被称为g o r d o n 综合征，主 要临床表现为高血压、高血钾和代谢性酸中毒。因此，对w n k 激酶的功能研究揭 示了肾脏离子转运调控的一条新途径。 醛固酮( a l d o s t e r o n e ，a l d o ) 是人体内最重要且作用最强的盐皮质激素，主要 作用部位为。肾脏，其生理作用为保钠排钾，调节细胞外液容量进而调控血压。 由于w n k 激酶家族成员与醛固酮均表达于肾脏，并且参与肾脏离子转运调 节，因此我们推测醛固酮可能通过调控w n k 激酶家族成员的表达而发挥其生理 功能。为此，我们通过体外给予大鼠醛固酮及醛固酮受体拮抗剂，高钾饮水诱导 大鼠内源醛固酮增高；检测各组大鼠血清醛固酮水平及血清和2 4 小时尿液中l + 、 n a + 、c l 一水平；r e a l t i m ep c r 检测大鼠肾脏组织w n k 成员表达；检测醛固酮刺 激fw n k 成员启动子区荧光素酶报告基因活性的变化，并通过生物信息学软件分 析w n k l - k s 启动予区转录因子结合位点，以揭示醛固酮对w n k 激酶家族成员的 作用及其机制。 材料与方法 一、实验材料与试剂 1 、健康雄性w i s t a r 大鼠 2 、总r n a 提取试剂 3 、反转录试剂 4 、r e a l t i m ep c r 试剂 5 、h e k 2 9 3 细胞系 6 、细胞培养及转染相关试剂 二、实验方法 l 、4 8 只健康雄。i 生w i s t a r 大鼠，随机分为6 组，每组8 只，分别给予醛固酮、醛 固酮受体拮抗剂和高钾饮水。 2 、将大鼠置于代谢笼中饲养，收集2 4 小时尿液。将各组大鼠处死，采集血清， 并取。肾脏组织。 3 、提取肾脏组织r n a 并反转录成c d n a 。 4 、r e a l t i m ep c r 检测大鼠肾脏组织中聊，基因家族成员表达。 5 、转染w n k l - l ，聊、j 船和w n k 4 基因启动子荧光素酶报告基因载体至 h e k 2 9 3 细胞中，醛吲酮刺激后检测荧光素酶活性变化。 6 、预测w n k l 磺因启动子区域内转录因子结合位点。 7 、w n k l - k s 启动子区系列截短荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测。 实验结果 l 、各组大鼠血清醛同酮水平及尿液中k + 水平均升高，尿n a + 水平均下降；高 钾组尿c l 水平显著升高，其他组无变化；各组大鼠血清离子浓度均无显著变化。 2 、大鼠肾脏组织中w n k l - k s 表达显著上升，w n k 4 表达显著下降，而w n k l - l 表达无明显变化，w n k 3 仪在高钾组表达上升，在其他组无明显变化。 3 、醛固p i o l n 激h e k 2 9 3 细胞后，w n k l l 肩动子区荧光素酶活性无明显变化， 2 w n k l - k s 启动子区荧光素酶活性显著上升，w n k 4 启动子区荧光素酶活性显著下 降。 4 、在w n k l 瞄因启动子区预n n 3 个糖皮质激素反应元件。 5 、 w n k i - k s 启动子区系列截短荧光素酶报告基因载体转染h e k 2 9 3 细胞后， p g l 3 - b a s i c - 9 7 5 、p g l 3 - b a s i c 一6 6 3 、p g l 3 - b a s i c 一1 5 0 和p g l 3 - b a s i c 一7 0 的转录活性活 性显著上升，而p g l 3 一b a s i c 一31 4 、p g l 3 - b a s i c 一2 7 4 5 t l p g l 3 b a s i c 2 2 0 的转录活性显著 下降。 结论 醛固酮可调控w n k 激酶家族成员的表达，与相应启动子区荧光素酶报告基因 活性检测结果一致，表明醛固酮可通过基因组效应参与w n k 基因表达调控。 关键词 w n k 激酶；肾脏；醛固酮；r e a l t i m ep c r 3 英文论著摘要 t h es t u d yo p r e s s i o n , n dm e c h a n i s m ne x o r e s s l o na n m e ca n i s mo f w n k0 l州k k i n a s ef a m i l ym e m b e r , , 霉：u l a t e db ya l d o s t e r o m k i n a s ei a m i l ym e me r sr e r u l a t e a l0 s t e r o n e i n t r o d u c t i o n w n kk i n a s e ( w i t hn ol y s i n e ( 自，w n k ) i sas e r i n e - t h r e o n i n ek i n a s e t h e m e m b e r so ft h i sf a m i l yl a c ka l y s i n ea tau s u a l l yi n v a r i a n tp o s i t i o ni nt h ea c t i v es i t ea n d a r et h e r e f o r ek n o w na sw n kp r o t e i nk i n a s e s w n kk i n a s e sh a v eas h o r t a m i n o - t e r m i n a ld o m a i n ，ah i g h l yc o n s e r v e ds e r i n e t h r e o n i n ek i n a s ed o m a i n ，as e l f r e p r e s s i o nd o m a i na n dt w oh e l i x - h e l i xd o m a i n sa tl e a s t t od a t e ，f o u rw n k k i n a s e m e m b e r sn a m e df r o mw n k lt ow n k 4h a v eb e e ni d e n t i f i e d m u t a t i o n si nt h eg e n e s e n c o d i n gw n k 1a n dw n k 4 ，t w oo ft h eo t h e rf o u rm e m b e r so ft h eh u m a nw n k f a m i l y , a r er e s p o n s i b l ef o rp s e u d o h y p o a l d o s t e r o n i s mt y p ei i ( p h a 2 ) ，a l s ok n o w na s g o r d o ns y n d r o m e ，a na u t o s o m a ld o m i n a n tf o r mo fh u m a na r t e r i a l h y p e r t e n s i o n a s s o c i a t e dw i t hh y p e r k a l a e m i aa n dm e t a b o l i ca c i d o s i sw i t hh y p e r c h l o r a e m i a t h e r e s e a r c ho nt h ew n kk i n a s e sr e v e a l san e ws i g n a lc a s c a d ei nt h ek i d n e yt h a tr e g u l a t e s n a c ia n dkb a l a n c ei nt h e b o d y a l d o s t e r o n ei sa ni m p o r t a n tm i n e r a l o c o r t i c o i dh o r m o n ei nh u m a n i tp l a y sam a j o r r o l ei nt h em a i n t e n a n c eo fs o d i u m ，p o t a s s i u m ，a c i d - b a s eb a l a n c ea n dt h u si n v o l v e di n t h ep h y s i o l o g i c a lc o n t r o lo fs y s t e m i cb l o o dp r e s s u r e t h i sr e g u l a t i o ni sa c h i e v e d t h r o u g ha l d o s t e r o n e i n d u c e ds t i m u l a t i o n o fn a + a b s o r p t i o n ，k + s e c r e t i o n ，a n dh + s e c r e t i o nb yt h ed i s t a ln e p h r o n ，p a r t i c u l a r l ys e g m e n t so ft h ec o l l e c t i n gd u c t b o t ht h ew n k sa n da l d o s t e r o n ea r ee x p r e s s e di nk i d n e y ，w h e r et h e yp l a yar o l ei n t h ei o nt r a n s p o r a t i o n w ep r e s u m e da l d o s t e r o n em i g h te x e r tt h ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s b yr e g u l a t i n gw n kf a m i l ym e m b e r s i nt h i ss t u d y ，r a t sw e r et r e a t e dw i t ha l d o s t e r o n e ， a l d o s t e r o n er e c e p t o ra n t a g o n i s ta n dh i g hp o t a s s i u mw a t e r t h ec o n c e n t r a t i o no f 4 a l d o s t e r o n e ，s o d i u m ，p o t a s s i u m ，a n dc h l o r i n ei ns e r u ma sw e l la si n2 4 hu r i n es a m p l e s w e r em e a s u r e d r e a l - t i m ep c rw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fw n kf a m i l y m e m b e r si nr a t s k i d n e y t h el u c i f e r a s ea c t i v i t i e so fw n kc o n s t r u c t sw e r em e a s u r e d a f t e rs t i m u l a t e db ya l d o s t e r o n e t h ep o s s i b l et r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e si nt h e 10 0 0b pr e g i o nu p s t r e a mt h et r a n s c r i p t i o n a li n i t i a t i o nw e r ep r e d i c t e dv i ab i o i o f o r m a t i c s s o f t w a r e t h i ss t u d yc o u l dh e l pu st od i s c o v e rt h ee x p r e s s i o na n dm e c h a n i s mo fw n k k i n a s ef a m i l ym e m b e r sr e g u l a t e db ya l d o s t e r o n e m a t e d a l sa n dk i t s ： 1 w i s t a rr a t s m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 2 r e a g e n t sf o rt o t a lr n a e x t r a c t i o n 3 r e a g e n t s f o rr e v e r s e t r a n s c r i p t i o n 4 r e a g e n t sf o rr e a l t i m ep c ra s s a y 5 h u m a nh e l q 9 3c e l ll i n e 6 r e a g e n t s f o rc e l lc u l t u r ea n dt r a n s f e c t i o n m e t h o d s ： 1 4 8m a l ew i s t a rr a t sw e r ed i v i d e di n t o6g r o u p s ( n = 8 ) t h e yw e r et r e a t e dw i t h a l d o s t e r o n e ，a l d o s t e r o n er e c e p t o ra n t a g o n i s t sa n dp o t a s s i u mw a t e r , r e s p e c t i v e l y 2 t h er a t sw e r eh o u s e di nm e t a b o l i cc a g e s t h es e r u m s ，2 4 hu r i n es a m p l e sa n dt h e k i d n e yt i s s u e sw e r ec o l l e c t e d 3 t o t a lr e n a lr n aw a se x t r a c t e da n dr e v e r s e t r a n s c r i p t e di n t oe d n a 4 t h ee x p r e s s i o n so fw n kf a m i l ym e m b e r si nk i d n e yw e r es t u d i e db yr e a l - t i m e p c r 5 k i d n e y d e r i v e d h e k 2 9 3c e l l sw e r ec u l t u r e da n dt r a n s f e c t e dw i t h p g l 3 - b a s i c w n k i l p g l 3 一b a s i c w n k i k sa n dp g l 3 一b a s i c - w n k 4c o n s t r u c t s 2 4 ha f t e rt h et r a n s f e c t i o n ，t h ec e l l sw e r es t i m u l a t e db ya l d o s t e r o n ea n da s s a y e df o r 1 u c i f e r a s ea c t i v i t i e si nt h el u m a tl b9 5 0 7l u m i n o m e t e r 6 t h ep o s s i b l et r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e si nt h e10 0 0b pr e g i o nu p s t r e a mt h e 5 7 t h ew n k1 一k sc o n t r a c t sw e r ea m p l i f i e da n di n s e r t e di n t ot h ec l o n i n gs i t e so f p g l 3 b a s i cv e c t o r t h e i ra c t i v i t i e sw e r ed e t e r m i n e db yt r a n s i e n tt r a n s f e c t i o n r e s u l t s 1 t h ec o n c e n t r a t i o n so fs e r u ma l d o s t e r o n ea n du r i n ek + i nr a t sw e r eo b v i o u s l y e l e v a t e dc o m p a r e dw i t hn o r m a lc o n t r 0 1 t h ec o n c e n t r a t i o no ft h eu r i n en a + d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya n dt h eu r i n ec 1 i n c r e a s e do n l yi nt h eg r o u po fh i g hk + t h e v a l u e so fk + ，n a + a n dc i 。i ns e r u m w e r en o td i f f e r e n tf r o mt h o s eo fn o r m a lc o n t r o l s 2 i nr a t s k i d n e y , t h e e x p r e s s i o no fw n k l - k si n c r e a s e d ，w h i l et h a t o f1 4 w k 4 d e c r e a s e dc o m p a r e dw i t hn o r m a lc o n t r o l s t h ee x p r e s s i o no fw n k 3i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l yo n l yi nt h eh i g hkg r o u p 3 a f t e rt h ec o n s t r u c t sw e r et r a n s f e c t e dt oh e k 2 9 3c e l l sa n ds t i m u l a t e dw i t h a l d o s t e r o n e ，t h el u c i f e r a s ea c t i v i t yo fw n k l - k si n c r e a s e d ，t h a to fw n k 4d e c r e a s e d a n dt h e r ew a sn oc h a n g eo nw n k l - lv e c t o r 4 w e p r e d i c t e dt h ep o s s i b l et r a n s f e c t o rb i n d i n gs i t e si nt h e10 0 0b pr e g i o nu p s t r e a m t h et r a n s c r i p t i o n a li n i t a t i o na n df o u n dt h r e ep u t a t i v eg l u c o c o r t i c o i dr e c e p t o rb i n d i n g s i t e sv i ab i o i n f o r l t l a t i c ss o f t w a r e 5 a f t e rt r a n s f e c t e dt oh e k 2 9 3c e l l s ，t h el u c i f e r a s ea c t i v i t yo fp g l 3 一b a s i c 一9 7 5 ， p g l 3 一b a s i c 一6 6 3 ，p g l 3 一b a s i c - 1 5 0a n d p g l 3 - b a s i c 一7 0 i n c r e a s e dt h a to f p g l 3 - b a s i c 一3 14 p g l 3 - b a s i c 一2 7 4a n dp g l 3 b a s i c - 2 2 0d e c r e a s e d c o n e l u s i o n t h em i n e r a l o c o r t i c o i dh o r m o n ea l d o s t e r o n ec o u l dr e g u l a t et h ee x p r e s s i o no f w n kk i n a s ef a m i l ym e m b e r s ，w h i c hc o n s i s t sw i t ht h er e s u l t so fl u c i f e r a s ea s s a y t h e r e f o r e ，t h er e g u l a t i o ni sa c h i e v e dt h r o u g ht h eg e n o m i cp a t h w a y k e yw o r d s w n k k i n a s e ；k i d n e y ；a l d o s t e r o n e ；r e a l t i m ep c r 6 英文缩略词 7 论文 醛固酮调控w n k 激酶家族成员表达 及其作用机制的研究 月u舌 w n k 激酶( w i t hn ol y s i n ek i n a s e ) 是一种丝苏氨酸蛋白激酶，因其家族成 员在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名。w n k 激酶家族成员均具有1 个短的氨 基端结构域、1 个高度保守的丝氨酸苏氨酸激酶结构域、1 个自身抑制结构域和至 少2 个螺旋螺旋结构域。迄今，在人类共发现了该家族的4 个成员乜1 ，甚i w n k l 、 w n k 2 、w n k 3 和w n k 4 。 聊j 基因定位于1 2 p 1 3 3 3 ，主要有两个转录本，全长w n k l ( f u l l 1 e n g t h w n k l ，w n k l 一l ) 基因全长1 6 0 k b ，包含2 8 个外显子，广泛表达于人体多种组 织中，在睾丸、心脏和骨骼肌中高表达，脑组织中低表达口1 。肾脏中高表达的w n k l 较正常w n k i - l 短，缺失了w n k l - l 第1 - 4 外显子，它从第4 个内含子开始转录， 增加了1 个长约9 0 b p 的e 4 a 外显子，它没有完整的激酶结构域，因此该转录本的 产物无蛋白激酶活性，被称为肾脏特异性w n k l ( k i d n e y - s p e c i f i cw n k l ， w n k l k s ) 。在。肾内，w n k l - k s 仅高表达于远端。肾单位h 1 ，其表达量大约是 w n k l - l 的1 0 倍畸1 ，是愀j 肾脏功能性转录本。w n k 2 基因定位于9 q 2 2 3 1 ，全 长为1 3 6 k b ，包含3 0 个外显子田1 ，主要表达在心脏、大脑和结肠口3 。目前w n k 2 在肾脏的功能未见报道。w n k 3 基因定位于x p l1 2 2 ，全长1 6 5 k b ，包含2 4 个外 显子，主要表达在脑和肾脏m 1 ，在氯离子转运调节中起重要作用。w n k 4 基因定位 于1 7 q 2 1 3 l ，全长1 6 k b ，包含1 9 个外显子，w n k 4 在肾脏、胰腺、胆管、结肠、 大脑( 脑屏障) 、附睾和皮肤组织均有表达阳川，在维持肾脏钾钠氯离子平衡中起 关键作用3 。 w n k l 基因第l 内含子的大片段缺失和w n k 4 基因激酶结构域下游一段高度 保i ) ：区域的错义突变导致一种常染色体显性遗传病n2 。一i i 型假性低醛固酮血症 8 ( p s e u d o h y p o a l d o s t e r o n i s mt y p ei i ，p h ai i ，o m i m # 1 4 5 2 6 0 ) ，p h ai i 也被称为 g o r d o n 综合征n 引，其主要临床表现为高血压、高血钾和代谢性酸中毒，该病对噻 嗪类药物高度敏感n 引。对w n k 激酶的研究揭示了一条新的肾脏离子调控途径。 w n k 激酶成员是肾脏多个离子通道和转运体的上游调控蛋白激酶。w n k 4 能 够抑制钠氯共转运子( s o d i u m c h l o r i d ec o t r a n s p o r t e r , n c c ) 、上皮细胞钠通道 ( e p i t h e l i a ls o d i u mc h a n n e l ，e n a c ) 和n a k c 1 共转子( n a k 2 c 1c o t r a n s p o r t e r ，n k c c l ) 介导的钠离子重吸收，抑制肾脏髓质外钾通道( r e n a lo u t e rm e d u l l a r yp o t a s s i u mi o n c h a n n e l ，r o m k ) 和钾氯共转子( k c 1c o t r a n s p o r t e r ，k c c ) 介导的的钾离子外流 1 5 - 1 9 o w n k l l 对n c c 没有直接影响，但它能完全阻断w n k 4 对n c c 的抑制作用n5 1 ； w n k l l 能够增强e n a c 的表达呦1 ，促进钠离子内流。w n k l l 也能够抑制r o m k 活性幢，抑制钾离子外分泌。w n k l k s f l 邑够增强e n a c 表达乜引，使钠离子内流增 加，w n k l k s 本身对r o m k 和n c c 无作用，但能逆转w n k l l 对两者的作用瞳3 l 。 w n k 3 能激活介导氯离子内流的转运体n c c 和n k c c ，而无激酶活性的w n k 3 则对 n k c c 2 和n c c 起抑制作用汜钔，同时w n k 3 能抑制介导氯离子外流的k c c l 4 和 r o m k 瞳5 2 引。目前对w n k 2 的了解很少，w n k 2 对离子通道的作用尚不清楚。 醛固酮( a l d o s t e r o n e ，a l d o ) 由胆固醇代谢产生，是人体内最重要且作用最 强的盐皮质激素，主要作用部位为肾脏，它的主要生理作用为调节细胞外液容量 和钾离子的平衡进而参与血压的调控。醛固酮的主要作用机制为它与胞质内的类 固醇受体结合后，形成激素受体复合物，后者通过核膜与相应的d n a 调控元件结 合启动基因转录级联，最后合成一系列醛固酮诱导蛋白，调节水、电解质和血容 量平衡。 由于w n k 激酶家族成员与醛固酮均表达于肾脏，并且参与肾脏离子转运调 节，因此我们推测醛固酮可能通过调控w n k 激酶家族成员的表达而发挥其生理功 能。为此，我们通过体外给予大鼠醛固酮及醛固酮受体拮抗剂，高钾饮水诱导大 鼠内源醛固酮增高；检测各大鼠血清醛固酮水平及血清矛1 1 2 4 d , 时尿液中k + 、n a + 、 c l 水平；r e a l t i m ep c r 检测大鼠。肾脏组织w n k 成员表达；检测醛固酮刺激下w n k 成员启动子区荧光素酶报告基因活性的变化，并通过生物信息学软件预测 w n k l 一k s 启动子区转录起始点，卜游l k b 序列内转录凶子结合位点，以揭示醛固酮对 9 w n k 激酶家族成员的作用及其机制。 一、细胞系 实验材料 荧光素酶报告基因载体p g l 3 - b a s i c 海肾荧光素酶载体p r l - t k 美 p r o m e g a 公司 美 p r o m e g a 公司 p m d 18 一ts i m p l e日本t a k a r a 公司 醛固酮 螺内酯 t r i z o l 反转录试剂盒 r e a l t i m ep c r 试剂盒 胶回收及质粒制备试剂盒 琼脂糖 d e p c d u a l g l o t m 双荧光素酶检测系统 s i g m a 公司 江苏正大风海制药有限公司 美国i n v i t r o g e n 美国p r o m e g a 公司 日本t a k a r a 公司 中国a x y g e n 公司 日本t a k a r a 公司 美国p r o m e g a 公司 美国p r o m e g a 公司 限制性内切酶日本t a k a r a 公司 台式高速离心机 台式低温超速离心机 德国b i o f u g e 美国s i g m a l o 电泳仪及电泳槽 7 5 0 0r e a l t i m ep c r 仪 组织匀浆器b i o s p e ct i s s u et e a r o r 超净工作台b s b 3 a 二氧化碳细胞培养箱b n a 3 1 1 自动凝胶成像分析仪g d s 8 0 0 0 p c r 仪 全温振荡培养箱h z q f 1 6 0 恒温水浴锅h h 1 生物发光仪l n m a tl b9 5 0 7 美国b i o r a d 美国a b i 德国h e i d o l p h 公司 澳大利亚g e l a i r 公司 日本e s p e c 公司 美国u v p 公司 日本t a k a r a 公司 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 常州国华电器有限公司 德国b e r t h o l dt e c h n o l o g i e s 五、国际生物信息学网址和计算机分析软件 l 、g e n b a n k 数据库： h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n b a n k 2 、p r i m e r 3 引物设计软件： h t t p ：w w w b a s i c n w n e d u b i o t o o l s p r i m e r 3 3 、t r a n s f a c 生物数据库： h t t p ：w w w b i o b a s e i n t e r n a t i o n a l t o m 4 、s p s s10 0f o rw i n d o w s 统计软件 实验方法 一、大鼠的分组情况 4 8 只雄性w i s t a r 大鼠来自于中国医科大学实验动物部，每只体重约为1 2 0 9 ， 随机分为6 组，每组8 只，常规方法饲养于1 2 1 2 小时昼夜明暗交替系统。皮下 注射给予醛固酮，灌胃法给予醛同酮受体拈抗剂，o 5 m o l lk + 给予高钾饮水，分 组如下： c 组： 正常对照组，给与正常饮食和饮水，常舰饲养； a 1 组：醛固酮给药1 天，剂量为：1 8 t g d ； a 3 组：醛同删连续给药3 天，剂量为：1 8 p g d ； s 组：螺内酯连续给药1 0 天，剂量为：1 0 0 m g k g d ； s + a 组：1 0 0 m g k g d 体重的螺内酯，连续给药1 0 天，后3 天同时皮下注射 醛固酮，剂量为1 8 l a g d ； k 组：0 5 m o l l k + 饮水，饲养l o 天。 二、大鼠血清和尿液指标检测 将大鼠置于代谢笼中饲养，收集2 4 h 尿液。将各组大鼠用颈部脱位法处死， 采集血液，并取肾脏组织。用罗氏自动生化分析仪( i s e8 0 0 ) 检测大鼠血清及尿 液中钠、钾和氯离子浓度，放免法检测大鼠血清醛固酮水平。 三、大鼠肾脏组织e d n a 的获得 t r l z 0 1 氯仿法提取大鼠肾组织总r n a ，反转录成e d n a 。 ( 一)肾脏组织总r n a 的提取 所有使用的试剂、吸头、容器等均需经o 0 1 d e p c 水处理。采用t r i z o l 一 步法抽提总r n a ，步骤如下： 1 、称取适量组织于液氮中浸1 0 m i n ，碎后立即转入含l m lt r i z o l 的2 m l 离心 管中； 2 、匀浆后室温静置5 m i n ； 3 、加入0 2 m l 氯仿，祸旋振荡1 5 s e c ，室温放置5 m i n 使之分层； 4 、4 。c ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，使溶液分层； 5 、转移上层水相于另一1 5 m l 离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置 1 0 m i n ，4 。c ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ； 6 、弃上清，加入7 5 乙醇l m l ，4 。c ，7 , 5 0 0 r p m 离心5 m i n ； 7 、弃上清，管底沉淀经空气干燥5 10 m i n 后溶于适量0 0 1 d e p c 水中； 8 、紫外分光光度计测定r n a 的o d 2 6 0 o d 2 8 0 ，计算比值，鉴定纯度，计算浓 度。 ( 二)e d n a 合成 1 、总r n a 加入离心管中，7 0 。c 孵育1 0 分钟。 2 、用反转录试剂盒将r n a 转录为c d n a ，反应体系如f ： 1 2 m g c l 2 ( 2 5 m r n o l l ) 10 x b u f f e r d n t p ( 10 m m o l l ) r n a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u i - t 1 ) a m v t r a n s c r i p t a s e ( 2 0 u l a l ) 总r n a o l i g o ( d t ) ts p r i m e r ( 5 0 0i ，t g m 1 ) 4 “l 2 1 a l 2 “l 0 5 1 a l o 5 1 1 1 1 l a g 1p l n u c l e a s e f r e ew a t e r u pt o2 0 0 1 a l 3 、反应条件为：4 2 l h ，9 9 * ( 25 m i n ，4 c5 m i n 。 四、r e a l t i m ep c r 检测大鼠w n k 基因家族成员表达 1 、大鼠w n k l 一，w n k l k s ，w n k 3 ，w n k 4 定量p c r 引物序列如下： 引物名称引物序列 w n k l l w n kll f o r w a r d w n kll r e v e r s e w 1 1 l 【1 l - t a q m a n f a m w n k l k s w n k1 k s f o r w a r d w n k1 k s r e v e r s e w n k 1 - k s - t a q m a n m g b w n k 3 w n k 3 f o r w a r d w n k 3 r e v e r s e w n k 4 w n k 4 f o r w a r d w n k 4 r e v e r s e w n k 4 t a q m a n - f a m g c a c a g c a c c a g g a c a t a c a g t 3 7 t g t t g g a c g g g t t g t g a a g a t a g 3 7 c a c c c t c a a g t a t g g c a c a g g g g c 3 7 c t a c c c g t a c c c c t g t t t c c t 。3 t c a t t g c t g c t g c t g t t c t c a 3 7 c t t c a c t c c c t c a r i _ f a t 3 7 一c t a t c g a a t g t g g c t g c a a g t c 3 7 c t t g a c a c a g c a g c a g g a t a g g 一3 7 57 t t c c t t c a a g a c c g t g t a t c g a 3 7 57 g c a g c c c c t t g a g c a t c t c 一3 7 57 一c t g c a g g c t c g g a a a c t c t c t c g g 3 7 1 3 ， ， ， ， ， ， 5 5 5 5 5 5 5 5 内对照1 3 a c t i n r b a - t a m r a - p r r b a t a m r a f a m 5 g t c a g g t c a t c a c t a t c g g c a a t - 3 7 5 a g a g g t c t 兀ac g g a t g t c a a c g l - 3 7 5 c c t t c c t t c c t g g g t a t g g a a t c c t g t g 3 7 2 、t a q m a n 探针法r e a l t i m ep c r 反应体系如下： p r e m i xe xt a q 州( 2 ) p c rf o r w a r dp r i m e r ( 10 9 m ) p c rr e v e r s ep r i m e r ( 10 1 a m ) 荧光探针溶液 r o xr e f e r e n c ed y ei i ( 5 0 x ) e d n a 模板 d h 2 0 1 0 9 1 0 4 1 a l 0 4 i _ t l 0 8 1 a l 0 4 1 a l 2 0 p l 6 0 “l 总体积 2 0 0 p l 3 、s y b r 法r e a l t i m ep c r 反应体系如下： s y b rp r e m i xe x t a qi i ( 2 x ) p c rf o r w a r dp r i m e r ( 1o “m ) p c rr e v e r s ep r i m e r ( 10 9 m ) r o xr e f e r e n c ed