（遗传学专业论文）霍山石斛人工种子包埋配方的优化和萌发的研究.pdf

摘要 霍山石斛( d e n d r o b i u mh u o s h a n e s ec z t a n ge ts j c h e n g ) 产于安徽省霍山县，为 药用石斛中的珍品，对生长条件要求极为苛刻，种子繁殖能力极低，由于过度采挖， 自然资源早已枯竭，霍山石斛试管苗出瓶移栽成活率较低，很难进行大规模人工栽培。 目前，人工种子的研究已有较多的报道，但霍山石斛为材料制作人工种子并未见报道。 因此，可以考虑通过人工种子快速繁殖作为解决资源匮乏的有效途径之一。 本文以腋芽、原球茎、不定芽为包埋繁殖体，制作霍山石斛人工种子，采用单因 素和正交设计试验，探讨麦芽糖、激素、活性炭、海藻酸钠、离子交换时间对霍山石 斛人工种子萌发的影响，研究繁殖体的种类和大小对霍山石斛萌发率和成苗率的影 响，对人工种皮的糖分泄漏率和p h 的变化以及成苗植株生长特性进行测定，并对人 工种子贮藏与防腐等方面进行初步研究，为霍山石斛人工种子深入研究提供技术方 法。主要研究结果如下： 1 由单因素试验得出，麦芽糖为霍山石斛人工种子适宜的碳源，适宜浓度为4 o ， 通过正交设计试验，得出麦芽糖是影响霍山石斛人工种子萌发主要因素，适宜的霍 山石斛人工种子包埋配方组合为：麦芽糖含量为4 0 、6 b a n a a1 0 ：1 ，活性炭 浓度o 1 ，海藻酸钠浓度4 0 ，将含有繁殖体的此配方溶液滴入2 c a c l 2 溶液 中，进行离子交换反应，反应时间1 0m i n 。在此包埋配方下，以腋芽、原球茎、不 定芽为包埋繁殖体的霍山石斛人工种子萌发率可以达到：6 5 6 、9 0 1 、7 5 2 ， 萌发后幼苗的存活率分别为1 6 1 、8 0 6 和1 9 1 。 2 霍山石斛人工种子包埋繁殖体，腋芽、不定芽为适宜的大小为0 6 0 8c m ，原球茎 颗粒直径为0 3 锄；其中，原球茎较腋芽和不定芽更适合包埋。 3 人工种皮糖分泄露率为o 5 2 ，这与包埋配方需要较高的麦芽糖浓度是一致的；以 腋芽为包埋繁殖体的霍山石斛人工种子在播种6 0d 后，以腋芽为包埋繁殖体的霍山 石斛人工种皮p h 值由5 6 0 下降到4 6 9 ，以原球茎，不定芽为包埋繁殖体的霍山石斛 人工种皮p h 值由5 6 0 分别下降到4 8 0 ，4 7 1 ，p h 值逐渐降低，这可能阻碍人工种子 成苗；对照植株生长特性优于人工种子成苗植株，说明人工种皮不能充分满足繁殖 体生长所需的营养物质及环境，因此，人工种子的质量还有待于提高。 4 以原球茎为包埋繁殖体的霍山石斛人工种子的形态指标和生理指标都高于以腋芽、 不定芽为包埋繁殖体的霍山石斛人工种子，其成苗植株株高为2 3 6c m ，茎粗为1 2 5 眦n ，鲜重为1 8 6 2 3m g 干重为1 5 0 1m g ，叶绿素含量为o 31m e g g f w 。 5 低温贮藏2 0d 后，霍山石斛人工种子仍有1 0 6 的萌发率；一般情况下，霍山石 斛人工种子在有茵条件下萌发率为o ，利用多菌灵l o 0g l 为防腐剂，在自然条件 下，霍山石斛人工种子萌发率可以达到1 3 8 。 关键词：霍山石斛人工种子繁殖体萌发率低温贮藏杀菌剂 t h er e s e a r c ho ng e r m i n a t i o na n do p t i m i z a t i o no fe m b e d m e n to f a r t i f i c i a ls e e d so fd e n d r o b i u mh u o s h a n e n s e a b s t r a c t d e n d r o b i u mh u o s h a n e s ec zt a n ge t s j c h e n g i st r e a s u r ei nm e d i c i n a l d e n d r o b i u m ，p r o d u c e di nh u o s h a nc o u n t y ，a n h u ip r o v i n c e mg r o w t ho fi td e m a n d s e x t r e m e l yh a r s hc o n d i t i o n s ，a n ds e e dm u l t i p l i c a t i o nc a p a c i t yi sv e r yl o w d u et oe x c e s s i v e e x p l o i t a t i o n ，n a t u r a lr e s o u r c e sh a v eb e e nt i a l e do f f , i ti sd i f f i c u l tt oc a r r yo u tl a r g e s c a l e a r t i f i c i a lc u l t i v a t i o nf o r t h et r a n s p l a n to ft e s t - t u b ep l a n t l e t so fd h u o s h a n e s eh a v eal o w e r s u r v i v a l r a t e a tp r e s e n t ，t h e r ea r eh a v em o r eo fr e p o r ti na r t i f i c i a ls e e d s ，b u ta r t i f i c i a l s e e d so fd h u o s h a n e s eh a v en o tb e e nr e p o r t e d ，t h e r e f o r e ，w ec a nc o n s i d e rt h ea d o p t i o no f r a p i dp r o p a g a t i o no fa r t i f i c i a ls e e d sa sae f f e c t i v ew a y t os o l v i n gl a c ko fr e s o u r c e s i nt h i sp a p e r ，t h ea r t i f i c i a ls e e d so fd h u o s h a n e s ew a sp r o d u c e dw i t ha u x i l i a r yb u d s ， p r o t o c o r m l i k eb o d i e s ，a n da d v e n t i t i o u ss h o o t s b yu s i n go fs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t ，s t u d i e do nt h ee f f e c to f5f a c t o r s ( m a l t o s e ( ) ，h o r m o n er a t eb e t w e e n6 - b a ( m g l - 1 ) a n dn a a ( m g l 。1 ) ，a c t i v ec a r b o n ( ) ，s o d i u ma l g i n a t e ( ) ，t i m eo fi o n e x c h a n g e ( r a i n ) ) o ng e r m i n a t i o nr a t eo fa r t i f i c i a ls e e d so fd h u o s h a n e s e ，t h ee f f e c to ft h e t y p ea n ds i z eo fp r o p a g a t o r so ng e r m i n a t i o nr a t ea n dr a t eo fs e e d l i n g s t h e nt h el e a k i n g r a t eo fm a l t o s ea n dv a r i a t i o no fp hv a l u eo fa r t i f i c i a ls e e dc a p s u l ed u r i n gv e g e t a t i n go f a r t i f i c i a ls e e d so fd h u o s h a n e s ew a sm e a s u r e d a l s ow es t u d i e do nt h es e e d l i n gp l a n t s g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ，a r t i f i c i a ls e e ds t o r a g e ，p r e s e r v a t i o n ，a n do t h e ra s p e c t si no r d e r t o p r o v i d e t e c h n i c a lm e t h o d sf o rd e p t hs t u d yt oa r t i f i c i a ls e e d sdh u o s h a n e s e 1 1 1 em a i nr e s u l t so fs t u d yw e r ef o l l o w e d ： 1f r o ms i n g l e f a c t o rt e s tt h a t ，t h em a l t o s ei ss u i t a b l ec a r b o n , a p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o ni s 4 o ，b yo r t h o g o n a ld e s i g nt e s t i n g ，m a l t o s ep l a y st h em o s ti m p o r t a n tr o l ei ni n d u c i n g t h ed h u o s h a n e s ea r t i f i c i a ls e e d st og e r m i n a t e ，t h em o s ta p p r o p r i a t ec o m b i n a t i o ni s ： m a l t o s e 4 0 ，h o r m o n er a t eb e t w e e n6 - b a ( m g 。l 1 ) a n dn a a ( n a g l - 1 ) 1 0 ：1 ，a c t i v e c a r b o n 0 1 ，s o d i u ma l g i n a t e4 ，t i m eo fi o ne x c h a n g ei s 10r a i n e m b e d d e di nt h i s f o r m u l a , t h eg e r m i n a t i o nr a t eo fa r t i f i c i a ls e e d so fd h u o s h a n e s et a k e i n ga u x i l i a r yb u d s ， p r o t o c o r m - l i k eb o d i e s ，a n da d v e n t i t i o u ss h o o t sa st h ep r o p a g a t o r si s6 5 6 ，9 0 1 ， 7 5 2 a f t e rg e r m i n a t i o n ，t h es u r v i v a lr a t eo fs e e d l i n g so fa r t i f i c i a ls e e d sw a s8 0 6 ， a f t e rg e r m i n a t i o n , t h es u r v i v a lr a t eo fs e e d l i n g so fa r t i f i c i a ls e e d sw a s16 1 ，8 0 6 ， 19 1 i i 2t h ea p p r o p r i a t es i z eo fa u x i l i a r yb u d sa n da d v e n t i t i o u ss h o o t su s i n ga sp r o p a g a t o r s 0 6 - 0 8c m ，t h ed i a m e t e ro fp r o t o c o r m l i k eb o d i e si s 0 3c m ，p r o t o c o r m - l i k eb o d yi s m o r es u i t a b l ef o re m b e d d i n g 3 啊1 el e a k i n gr a t eo fm a l t o s eo fa r t i f i c i a ls e e dc a p s u l ew a s0 5 2 ，i ti sr e s u l to fr e q u i r i n g ah i g h e rc o n c e n t r a t i o no fm a l t o s e ，t h ep hv a l u eo fa r t i f i c i a ls e e dc a p s u l ed e c r e a s e d d u r i n gt h ep r o c e s so fv e g e t a t i o no fa r t i f i c i a ls e e d s ，t h ep hv a l u eo fa r t i f i c i a ls e e dc a p s u l e u s i n ga u x i l i a r yb u d s ，p r o t o c o r m - l i k eb o d i e s ，a n da d v e n t i t i o u ss h o o t sa st h ep r o p a g a t o r s d r o p p e d f r o m5 6 0t o4 6 9 ，f r o m5 6 0t o4 8 0 ，f r o m5 6 0t o4 7 1 ，t h ep hv a l u e sg r a d u a l l y r e d u c i n gm a yi m p e d ea r t i f i c i a ls e e d si n t os e e d l i n g s i na d d i t i o n ，t h ec o m p a r i s o np l a n t s g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c si s b e t t e rt h a na r t i f i c i a ls e e d ss e e d l i n gp l a n t s ，a r t i f i c i a ls e e d s c a p s u l ec a nn o tf u l l ym e e tt h et h en u t r i e n t so fp r o p a g a t o r sr e q u i r i n gt h e r e f o r e ，t h e q u a l i t yo f s e e d sn e e dt ob ei m p r o v e d 4t h ep l a n t sg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fa r t i f i c i a ls e e d su s i n gp r o t o c o r m l i k eb o d i e s a st h e p r o p a g a t o r s i sb e t t e rt h a na r t i f i c i a ls e e d su s i n ga u x i l i a r yb u d s ，a n da d v e n t i t i o u ss h o o t s ， t h ep l a n t sh e i g h to fi tw a s2 3 6c m ，s t e md i a m e t e ri s1 2 5r a i n ，f r e s hw e i g h ti s18 6 2 3m g ， d r yw e i g h ti s15 01m g ，t h ec h l o r o p h y l lc o n t e n ti s0 31m g g f w 5a f t e rh a v i n gb e e ns t o r e da t4 f o r2 0d ，t h eg e r m i n a t i o nr a t eo fa r t i f i c i a ls e e d so f d h u o s h a n e s et a k e i n ga u x i l i a r yb u d s ，p r o t o c o r m l i k eb o d i e s ，a d v e n t i t i o u ss h o o t sa st h e p r o p a g a r t o r sa r e3 3 ，10 6 ，5 2 a n di nn a t u r a lc o n d i t i o n st h eg e r m i n a t i o nr a t ei s 13 8 a f t e r10 0g lc a r b e n d a z i mh a v e nb e e na p p e n d e di n t oa r t i f i c i a ls e e dc a p s u l e t h i s r e s u l tw o u l db eaf o u n d a t i o no f m a n u f a c t u r ea n df u r t h e rs t u d yo ft h ea r t i f i c i a ls e e d so fd h u o s h a n e s e k e yw o r d s ：d e n d r o b i u mh u o s h a n e n s e ，a r t i f i c i a ls e e d ，p r o p a g a t o r , g e r m i n a t i o nr a t e ，l o w - t e m p e r a t u r e s t o r a g e ，g e r m i c i d e 1 i i 独创性l 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：时问：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：蠹自瘤时间： 年 月 日 第一导师签名： 时间： 锈年1 c 旯4 弋日 1 文献综述 随着植物组织培养技术的迅速发展，以此技术为基础的其他生物工程也应运 而生，并日益显示其巨大潜力。植物人工种子是近来生物工程技术中发展迅速的 领域之一。 m u r a s h i g ei l l 于1 9 7 7 年在国际园艺植物学术会议首次提出高速度、大规模生 产繁殖体的设想。通过人工种子技术，可以快速地繁殖一个优良品种或杂种，特 别是用手工生产杂种第一代种子，以保持它们的优良品性和整齐度。一些名贵品 种，难以保存的种质资源，遗传性不稳定的或育性不佳的材料，均可采用人工种 子的技术进行繁殖。另外它在基因工程、脱毒技术等其他技术相结合等方面，也 具有诱人的前景。因此受到各国，究人员甚至政府的重视，许多大的植物工程技 术研究公司和实验室着手此项研究【2 j 。欧洲将植物人工种子列入了尤里卡计划， 我国也于1 9 8 7 年将其列入国家高技术研究与发展计划( 8 6 3 ”计划) 3 1 。据报道， 目前已对2 6 个科，3 6 个属的植物的人工种子进行了研究【3 j 并已取得喜人的结果。 1 1 植物人工种子的研究概况 1 1 1 人工种皮包埋配方的研究进展 ( 1 ) 人工种皮包埋配方中营养物质的研究进展 在自然种子中，胚乳为合子胚发育的营养物质仓库。理论上讲，有些植物是 有胚乳植物，例如芹菜其人工种子中必须有营养物质代替胚乳，以提供萌发与成 苗所必需的养分和炭源，而苜蓿是一种无胚乳作物，从理论上讲不需要胚乳，但 研究表明，在包裹材料中不加任何东西，苜蓿胚的成苗率是零。在制作人工种子 时，用营养物质代替胚乳，通过组合各种植物生长发育所必需的物质，为植物繁 殖体创造一个适宜的营养环境f 4 j ，以保证繁殖体转化成苗。营养物质对提高成苗 率十分重要。人工种皮包埋配方营养物质一般由基本培养基成分、生长调节剂及 其他一些物质组成。在过去的三十年中，m s ，n 6 t 5 1 ，b 5 1 4 1 ，s h t 6 1 等培养基都曾 被用作人工种子包被的基本培养基，其中最常用的培养基为m s 。糖类既可以作 为包埋繁殖体生长的碳源物质，又可以改变包被体系中的渗透势，防止营养成分 外泄，还能在人工种子低温贮藏过程中起到保护作用 7 1 。目前用于包埋配方中的 糖类主要有蔗糖，麦芽糖，果糖，淀粉等。不同植物的人工种子对营养物质中所 添加的糖类要求有所不同。叶志毅【s j 等用体细胞胚为包埋繁殖体制作桑树人工种 子时发现，当果糖添加到包埋配方中作为碳源时，桑树的人工种子萌发率只有2 2 ，而当蔗糖作为桑树人工种子的碳源时，萌发率可以达至l j l 0 0 。郭顺星【9 j 等 以原球茎为包埋繁殖体制作铁皮石斛人工种子时，发现在包埋配方中添加麦芽糖 时，铁皮石斛人工种子存活率达到6 4 。刑小黑p j 等以不定芽为包埋繁殖体制作 水稻籼粳人工种子，发现麦芽糖更有利于提高不定芽的萌发率。淀粉在人工种子 包被中应用也比较广泛，淀粉可以在胶囊中分解，为植物繁殖体的发育提供炭源 支撑【i 0 , 1 1 】。黄绍兴【1 2 1 等对木薯淀粉研究还发现，淀粉分子多孔状的结构可以改变 海藻酸钙胶囊的致密结构，从而增加胶囊的透气性、保水性和吸水性，提高了人 工种子的萌发率。此外，糖类的浓度对人工种子萌发也有影响。a d r i a n i 等【l 列以 不定芽为包埋繁殖体制作猕猴桃人工种子，发现在一定范围内增加蔗糖的浓度可 以提高其转化率。在实际操作中，几种碳源成份配合使用也可以达到很好的效果 【“，1 4 l 0 除了在人工种皮包埋配方中添加碳源，还可以添加b a ，i a a ，g a ，n a a ， a b a 等植物生长调节剂。植物生长调节剂促进体细胞胚胚根，胚芽的分化与生 长，还可以促进非体细胞胚繁殖体转化成苗【l 引。a n t o n i e t t a p 6 1 等以体细胞胚为包 埋繁殖体制作茶枝柑人工种子，发现在营养物质中附i 3 1 1 g a 3 能够使其萌发率由 2 6 7 提高到5 0 。s a i p r a s a d 【r 7 】等以植物球茎为包埋繁殖体制作兰属人工种子， 发现附加0 4 4l a m o l l b a 和o 5 4i | m o l l n a a ，可使其转化成苗率达1 0 0 。 ( 2 ) 海藻酸钠包被技术研究进展 早期的人工种子的包埋技术主要包括液胶包埋法和干燥包被法等。人工种子 包被技术上应用最广泛包埋方法是水凝胶法，是通过离子交换或改变温度( 浇铸) 形成凝胶包被植物繁殖体的方法。r e d e n b a u g h t 3 1 在1 9 8 6 试验了2 6 种水溶性胶，结 果表明只有海藻酸钠、果胶酸钠、琼脂、海藻酸钠明胶、角交叉聚糖洋槐豆 树胶及c e l r i t e 可作为苜蓿人工种子的包被材料，其中以海藻酸钠效果最好，成活 率达到8 6 。海藻酸钠无毒性，具有生物活性，做成的胶囊强度较好，成本较低， 制作工艺简单，在近3 0 年的人工种子包被方面有了广泛的应用和很大的发展。 r e d e n b a u g h 利用c a c l 2 作为络合剂使海藻酸钠发生离子交换并形成海藻酸 钙胶囊。繁殖体被悬浮于海藻酸钠水溶液中，滴入c a c l 2 溶液中后发生离子交 换，在表面结成硬壳，形成胶囊。形成胶囊的效果可以通过控制海藻酸钠的浓度 和发生离子交换的时间来实现。一般情况下，海藻酸钠的使用浓度在2 5 之 间，离子交换时间为5 3 0m i n 。海藻酸钠的浓度和与c a c l 2 溶液离子交换的时间 对人工种子的萌发有一定的影响。在目前的大量文献中，不同的实验条件下，不 同植物繁殖体对这两方面的要求也有所不同。汤绍虎【1 3 1 等在研究甘薯人工种子 中发现，4 浓度的海藻酸钠适合甘薯人工种子的萌发。蔡秋红t ? g j 等在研究水稻 人工种子中发现，3 浓度的海藻酸钠适合水稻人工种子的萌发。番木瓜体细胞 胚人工种子以2 5 的海藻酸钠在5 0i t m o l lc a c l 2 溶液中反应1 0m i n 可得到最好 的效果，萌发率可达7 7 5 【2 0 l ；而蛾豆的体细胞胚人工种子只需离子交换反应5 m i n 就可达到最高的萌发率6 5 【z l j 。 海藻酸钠与c a c l 2 溶液离子交换反应形成的人工种皮，也存在很大的缺点，如 2 水溶性营养成分及助剂易渗漏、胶囊在空气中易失水、失水后吸水不能复涨、胶 囊之间易粘连等【2 2 】。为了解决这些问题，可以添加纤维素衍生物，活性炭和一 些高分子化合物等。陆承勋【2 3 】等在胡萝卜人工种子的研究中加入在m s 培养基中 浸泡过的活性炭，可以有效地减少营养成分的泄漏。杨光孝1 2 4 j 等在安祖花人工 种子的包埋配方中加入0 1 的活性炭，不仅提高了无菌条件下人工种子的萌发 率和转株率，减少了黄褐化率，而且提高了人工种子在有菌条件下的转株率。 1 1 2 包埋繁殖体的研究进展 最初在1 9 8 1 年，l a w r e n c e 等瞄】用液体包裹芹菜和莴苣的体细胞胚研究包埋技 术，之后，关于人工种子研究的报道越来越多。目前已经从2 0 0 多种植物中诱导 出体细胞胚，但进行过人工种子实验的不超过4 0 种1 2 6 】，由于作为人工种子包埋 繁殖体的植物必须具备高频率、同步化的高质量胚状体发生系统，莴苣、芹菜、 香菜、苜蓿、狼尾草等数十种植物具有制作潜力口7 1 。这些植物已具有建立好的 体细胞胚发生系统，几乎没有必要用人工种子作为繁殖手段。若从经济角度出发， 多年生或无性繁殖植物首先具有人工种子应用的潜力。但是，这类植物一般难以 得到高质量胚状体，加之其体细胞胚存在无性系变异，幼苗期较长以及苗转化率 较低等缺点，使人工种子技术在一些重要经济植物和珍稀濒危植物中的应用受到 限制。近年来，人工种子的包埋繁殖体材料己逐渐由体细胞胚转向非体细胞胚 【2 引。所谓非体细胞胚，是指芽、茎段、短枝、愈伤组织、花粉胚、块茎、球茎、 块茎、试管苗等繁殖体。目前为止，用来制作人工种子的植物非体细胞胚，大致 可以分为三类。第一类是天然单极无性繁殖体，如球茎、微鳞茎、根状茎、原球 茎；第二类是微切段，如带有顶芽或腋芽的枝条或茎节段；第三类是处于分化状 态的无性繁殖体，即还未达到完全分化的体外分生组织，如拟分生组织、细胞团 在占 雩宇。 天然单极无性繁殖体的体内贮藏有较多的营养物质，所以利用它们制作人工 种子时，即使不添加人工胚乳及其它诱导物质也能很好地转株。1 9 9 3 年，s h a s h i c f 2 9 】等以原球茎为包埋繁殖体对兰科植物大花惠兰人工种子进行了研究，无菌条 件下萌发率达1 0 0 ；2 0 0 5 年，黄卫昌1 3 0 j 以钻啄兰原球茎为包埋繁殖体，研究了 不同贮藏温度对钻啄兰人工种子萌发及幼苗成活的影响；何奕昆 3 1 j 等用半夏小 块茎为包埋繁殖体制作人工种子，研究了半夏人工种子的低温贮藏和萌发实验。 微切段是制作人工种子常用的繁殖体，这可能是因为一旦微繁殖体系建立之后， 获得外殖体相对容易之故【3 2 】。b a p a t 3 3 1 等及p 甜n a i k 【蚓分别报道以腋芽、营养芽为 材料制作桑树人工种子获得了完整植株，其中桑树腋芽人工种子苗转化率达 6 3 ；s h a n m 3 5 1 以枝芽为材料制作姜人工种子，转化率有8 1 8 ；r a 0 1 3 6 l 报道以香 蕉枝项芽为材料制作的人工种子转化率达1 0 0 。谷瑞安l j7 j 等人，以赤桉树微芽 3 为包埋繁殖体制作人工种子，研究了赤桉树人工种子生根及转株实验，发现微芽 包埋后二周生根率可以达到8 1 3 ，三周后转株率可以达到8 3 3 。汤绍虎【1 8 j 等以甘薯腋芽为包埋繁殖体制作人工种子，研究发现甘薯人工种子在无菌条件 下，萌发了为6 1 5 ，在营养土中成苗率为2 4 0 7 。倪德翔【3 s 】等研究了以不定 芽为包埋繁殖体的紫参和安祖花人工种子，转株率到达4 8 7 和5 6 1 。处于分 化状态的无性繁殖体，不像前两类那样是由均一组分构成的，而是一个复合体， 但各组分最终也将发育成上述两类繁殖体之一【3 5 ，3 9 1 。u o z u m i l 4 0 1 报道以芽原基为 繁殖体制作成的辣根人工种子，转化率达5 3 。 1 1 3 人工种子低温贮藏的研究进展 由于农业生产要受季节的限制，人工种子同自然种子一样也需要一定时间的 储藏。而人工种子含水量较大，常温条件下易于萌发，也易于失水。所以人工种 子的储藏技术是其研究的另一个难题。目前报道的方法，主要有低温法【3 0 1 ，干 燥法1 4 1 , 4 2 , 4 3 】，液体石蜡法m 】及多种方法的结合法。相对而言，低温贮藏是通过降 低温度来降低繁殖体的呼吸作用，使之进入休眠状态，低温贮藏对人工种子的萌 发具有明显的抑制作用，贮藏后的发芽率虽有所下降，但仍不失为一种较好的贮 藏方法，因此，低温贮藏被广泛用于人工种子的贮藏。钻喙兰人工种子在4 贮 藏条件下，1 5d 时萌发率可达9 2 ，贮藏1 2 0d 仍具萌发力。2 0 和2 5 下，贮 藏1 5d 萌发率分别为8 2 和7 7 f 3 0 】。半夏人工种子在4 c 条件下贮藏3 0 d 后，可 获得8 0 的萌发率1 4 5 1 。 1 1 4 人工种子防腐技术的研究进展 防腐是人工种子自然条件下大面积播种的关键技术之一。可以在胶囊中添加 杀菌剂，防腐剂，农药，抗生素，除草剂等，人为地影响和控制植物的发育和抗 逆性，提高它的发芽率和成苗率。柯善强【4 j 等在人工种皮中加入防腐齐, j c h 、c d 、 w h 8 3 1 d ，明显的提高了黄莲人工种子有菌条件下的萌发率和成苗率；汤绍虎【1 8 1 等在人工种皮中加入多菌灵、安苄青霉素，使甘薯人工种子在有菌的m s 琼脂培 养基上萌发率提高t 4 1 0 以上；自雨【4 6 j 以半夏块茎为包埋繁殖体制作半夏 人工种子，在人工胚乳中添加甲基托布津，发现半夏人工种子在自然条件下的萌 发率可以提高到1 7 7 。薛建平【4 7 j 等人以半夏试管小块茎为包埋繁殖体制作人工 种子，在人工胚乳中添加多菌灵后，在自然环境中萌发率达到9 5 。 1 2 石斛植物人工种子的研究溉况 石斛属( d e n d r o b i u m ) 是兰科( o r c h i d a c e a e ) 最大的属之一，全球计有1 5 0 0 种。石斛属植物分布广泛，广大的热带、亚热带、温带地区几乎都是石斛的原产 地，我国有7 6 种，2 变种f 4 埘。 霍山石斛为多年生草本，产于安徽省霍山县，因植株矮小，所以又称“米斛”。 4 霍山石斛是药用石斛中的珍品，具有滋阴、清热、生津、润肺、止咳、清音明目 等功效【4 9 1 。现代药理研究表明，霍山石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫 力、扩张血管及抗血小板凝集等作) 耳 5 0 , 5 1 , 5 2 , 5 3 】，因此霍山石斛在临床上及中药复 方中被广泛应用。近年来市场需求量不断增加， 霍山石斛对生长条件要求极为苛刻，霍山石斛种子繁殖能力极低，生长周期 长，由于过度采挖，自然资源早已枯竭 5 4 1 。霍山石斛试管苗根系纤弱不发达， 生态环境要求特殊，出瓶移栽成活率很低，还很难进行大规模人工栽培f 5 习。实 现霍山石斛资源可持续利用迫在眉睫，因此，可以考虑通过人工种子快速繁殖作 为解决资源匮乏的有效途径之一。 19 9 2 年，s h a r m a ( 3 5 】等研制了大包鞘石斛( d w a r d i a n u mw a r n e r ) 的人工种子； 1 9 9 6 年，郭顺星1 9 等报道了以铁皮石斛原球茎为材料制作人工种子，发现以改良 1 2 m s 培养基各种成分附加蔗糖为人工胚乳的人工种子存活率、发芽率、成苗最 好、其发芽率可达8 0 以上；2 0 0 0 年，张铭1 5 6 l 等也对铁皮石斛人工种子的制作 流程、繁殖体的选择、人工胚乳的筛选、有菌萌发等进行了探索，利用种胚原球 茎，制得的人工种子萌发率最高可达8 0 3 ，但对于铁皮石斛人工种皮质量，以 及人工种子的防腐以及低温贮藏方面，并没有做相关研究。 目前，植物以腋芽和不定芽为包埋繁殖体制作人工种子已有较多的报道，如 甘薯、水稻、桉树、半夏等一些具有重要经济价值的粮食作物、观赏植物、药用 植物等，但石斛属植物并未见到相关的报道。霍山石斛经济价值高、种子来源少 或自然条件下极难萌发、组培快繁试管苗生长慢、移栽难、胚类似物较易获得， 可以尝试通过人工种子的途径解决资源匮乏的问题。 5 2 引言 霍山石斛产于安徽霍山地区，为药用石斛中的珍品。在古医书本草纲目、 本草纲目拾遗、百草镜、名医别录、证类本草等中也均有记载 【5 7 】。在东南亚及香港市场上堪与黄金相比，素有“千金草”、“软黄金”之称 5 8 】。近 代医学家张涛颐称：“霍山石斛，干之而不稿，口嚼之且无渣滓，味浓而富脂膏， 养胃益液，却无清凉碍脾之虑，确为无上妙品”。由于其极高的药用价值，近年 来市场需求量不断增加，其生境苛刻，自然生长繁殖相当缓慢，加之过度采挖， 已成为濒危植物。利用组织培养技术能在一定程度上解决快繁问题，但其试管 苗生产周期长，成本高，移裁也不易成活，且不便储藏和运输，从而限制了霍山 石斛的规模性生产。 植物人工种子是今年来生物工程技术中发展迅速的领域之一，目前植物以体 细胞胚，腋芽，不定芽，原球茎为包埋繁殖体制作人工种子，并且对人工种子萌 发和转株的研究，已有较多报道，但霍山石斛为材料制作人工种子并未见报道。 本实验以腋芽、类原球茎、不定芽为包埋繁殖体制作人工种子，通过单因素和正 交设计试验，研究糖类、激素、活性炭、海藻酸钠、离子交换时间，对人工种子 的萌发的影响；此外，海藻酸钠包埋剂有制作方便的优点，但易染菌，难以实用 化【5 6 】，本文在包埋剂中添加多菌灵、甲基托布津，对霍山石斛人工种子防腐以 及低温贮藏做了初步研究，并对包埋不同繁殖体的霍山石斛人工种子萌发率、成 活率、成苗植株生长指标进行比较，从而为霍山石斛人工种子研究提供基础，以 期为霍山石斛人工种子实用化提供科学依据。 6 3 材料与方法 3 1 实验材料 霍山石斛( d e n d r o b i u mh u o s h a n e n s ec z t a n ge ts j c h e n g ) 试管苗，安徽 农业大学生命科学学院提供。 3 2 实验设计 3 2 1 材料的制备 ( 1 ) 腋芽的诱导：选取健壮、生长一致的霍山石斛试管苗，切取带腋芽的茎节， 接种在m s + 6 一b a ( m g l 。1 ) + n a a ( m g l d ) ，1 琼脂，2 蔗糖的培养基( a 1 ) 上，培养一段时间，待腋芽长到0 2 1 2c m 左右时，作为霍山石斛人工种子的包 埋繁殖体。培养条件为2 5 士2 ；光照时间为1 2h d 1 ；光照强度2 0 3 0p m 0 1 m - 2 s 一。 诱导培养基为： a l ：m s + 6 b a0 2m g l l + n a a0 1m g l - 1 a 2 ：m s + 6 一b a0 2m g 。l - + n a ao 0 5m g l 。1 a 3 m s + 6 一b a0 2m g l 吖4 - n a a0 0 3m g l 叫 a 4 ：m s + 6 b a0 2m g l 4 - n a a0 0 2 5m g l 1 a s ：m s + 6 b a0 2m g l 。1 + n a a0 0 2m g l - l a 6 ：m s + 6 b a0 2m g l - 1 + n a a0 0 16m g l 。1 ( 2 ) 不定芽的诱导：将原球茎接种在m s + 6 b a ( m g l 以) + n a a ( m g l 。) ，1 琼脂， 2 蔗糖的培养基( b 1 一b 4 ) 上，对其进行诱导分化培养，培养一段时间后，分割诱 导得到的不定芽，选取健壮、长约0 2 1 2c m 左右的不定芽，作为霍山石斛人工 种子的包埋繁殖体。培养条件同( 1 ) 。诱导培养基为： bl ：1 2 m s + 6 - b a0 0 5m g l + n a a0 0 5m g l 1 b 2 ：1 2 m s + 6 - b a0 0 5m g l 叫+ n a a0 1m g l q b 3 ：1 2 m s + 6 一b a0 0 5m g 。l 1 + n aa0 15m g l - 1 ： b 4 ：1 2 m s + 6 - b a0 0 5m g l 1 + n aa0 2m g l ： ( 3 ) 原球茎：选取健壮、生长一致的霍山石斛试管苗，切取带腋芽的茎节，接种 在实验室已有培养基m s + 6 b a3 0m g l 以+ n a ao 0 5m g l ，置培养条件为 2 5 士2 ；闭光处理，培养4 0d ，诱导原球茎，再在m s 培养基上进行增殖，选取 未分化成苗、健壮、原球茎作为霍山石斛人工种子的包埋繁殖体。 ( 4 ) 对照材料的选择：选择与包埋繁殖体大小一致的腋芽、原球茎、不定芽，直 接接种在相同培养基上，置于人工种子相同的培养条件下培养，成苗后，作为人 工种子成苗植株对照。每个处理为2 0 个，重复3 次。 7 3 2 2 霍山石斛人工种子制作配方单因素实验 ( 1 ) 碳源的单因素筛选实验 以包埋配方m s + 6 - b a 3 0n a g l d - 4 - n a ao 3m g l “+ o 2 活性炭+ 3 0 海藻 酸钠为基础，离子交换时间为2 0m i n ，分别添加1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、 5 ，o 、6 0 浓度的葡萄糖蔗糖、麦芽糖、果糖作为碳源，筛选适宜的碳源及其 浓度。其中选择包埋的腋芽、不定芽大小为0 6 0 8c m ，原球茎颗粒直径为0 3c m ( 以下选择相同大小的三种繁殖体) 。 ( 2 ) 激素配比的单因素筛选实验 由( 1 ) 得出适宜的碳源为麦芽糖，浓度为4 0 ，因此，包埋配方以m s + 4 0 麦芽糖+ 6 - b a ( m g l 。1 ) + n a a ( m g l 。1 ) + o 2 活性炭+ 3 0 海藻酸钠为基础，离 子交换时间为2 0m i n ，在包埋剂中添加激素6 - b a ( m g l d ) ，n a a ( m g l 。) ，两 者之间浓度配比分别为2 ：1 、4 ：l 、6 ：1 、8 ：1 、1 0 ：1 、1 2 ：1 ，筛选适宜的6 - b a ( m g l 1 ) 与n a a ( m g l 以) 激素配比。 c 1 ：6 - b a3 0m g l 。1 + n a a l 5m g l - 1 c 2 ：6 - b a 3 0m g l 。1 + n a a0 7 5m g l 1 c 3 ：6 - b a 3 0m g l 1 + n a a 0 5m g l 1 c 4 ：6 - b a3 0m g l 1 + n a a0 3 7 5m g l 1 c 5 ：6 - b a3 0m g l - l + n a a0 3m g l 1 c 6 ：6 - b a 3 0m g l 1 + n a a0 2 5m g l l ( 3 ) 活性炭浓度的单因素筛选实验 由( 1 ) ( 2 ) 得出，适宜的麦芽糖浓度为4 0 ，适宜的6 - b a n a a 激素配比为 1 0 ：1 ，因此，包埋配方以m s + 4 0 麦芽糖+ 6 - b a 3 0m